PLoS ONE: En Skift fra Canonical til Noncanonical Wnt Meldefunktioner formidler Drug Resistance i Colon Cancer Cells

Abstrakt

butyrat, en gæring produkt af fiber i tyktarmen, virker som en histondeacetylaseinhibitor (HDACi) og inducerer apoptose i tyktarmskræft (CC) celler

in vitro

. Vi har rapporteret, at de apoptotiske virkninger af butyrat er afhængige af hyperaktivering af Wnt /beta-catenin pathway. Men langvarig eksponering af CC celler til stigende koncentrationer af butyrat resultater i købet af modstand mod Wnt /beta-catenin- og apoptose-inducerende effekter af dette middel, samt krydsresistens over for strukturelt forskellige HDAC-hæmmere. Her rapporterer vi, at en mekanisme, hvorved HDACi modstand opstår, er gennem forøgelse af beta-catenin-uafhængig (noncanonical) Wnt signalering. Sammenlignet med HDACi-følsomme HCT-116 CC celler, HDACi-resistente HCT-R-celler udviser højere niveauer af AKT /PKB celle overlevelse signalering, som er delvist fremkaldt af WNT5A og dets receptor ROR2. Induktionen af ​​AKT signalering ved HDAC-hæmmere er også påvist i andre CC cellelinjer, omend i mindre grad end i de lægemiddelresistente HCT-R-celler. Observationerne foreslog, at apoptotiske effekt af butyrat og andre HDAC-hæmmere i CC celler kan udvides med inhibitorer af Pakt. Efter aftale med hypotesen, at kombinationen af ​​MK2206, et Pakt inhibitor, og en HDACi (butyrat eller LBH589) inducerede højere apoptose i CC celler sammenlignet med alene hver agent. Eksponeringen for begge stoffer også re-sensibiliseret de HCT-R celler til apoptose. Endelig blev begrebet samtidig fremkalde kanonisk Wnt aktivitet og undertrykke AKT signalering oversat til en kombination af kost-afledte stoffer. Kost-afledte Pakt hæmmere (kaffesyre phethyl ester, sulforaphane, dilallyl trisulfid) undertrykte butyrat-inducerede niveauer af Pakt, og øget de apoptotiske virkninger af butyrat i både narkotika-følsomme og resistente CC celler.

Vores resultater kan oversættes til (a) CC terapi beskæftiger kombinationer af syntetiske HDAC-hæmmere og hæmmere af Pakt, samt (b) CC forebyggelse baseret på kost, der resulterer i tilstrækkelige mængder af butyrat og Pakt hæmmere.

Henvisning : Bordonaro M, Tewari S, Cicco CE, Atamna W, Lazarova DL (2011) A Skift fra Canonical til Noncanonical Wnt Signaling formidler Drug Resistance i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 6 (11): e27308. doi: 10,1371 /journal.pone.0027308

Redaktør: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 5, 2011; Accepteret: 13. oktober 2011; Udgivet: November 3, 2011

Copyright: © 2011 Bordonaro et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Darina Lazarova er støttet af NIH /NCI tilskud # 1R15CA152852-01 og institutionelle midler fra Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Michael Bordonaro understøttes af AICR tilskud # 09A002, NIH /NCI-NIDDK # 1R15CA149589-01, og institutionelle midler fra Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Beta-catenin – afhængig (kanoniske) Wnt signalering initieres ved bindingen af ​​Wnt-ligander til deres celleoverfladereceptorer, og denne binding udløser en kaskade af intracellulære reaktioner der fører til akkumulering af Ser-37 /Thr- 41 dephosphoryleret beta-catenin. Det dephosphorylerede beta-catenin er transkriptionelt aktiv, og det danner komplekser med LEF /TCF-proteiner til at styre ekspression af hundreder af gener [1] – [3]. Den konstitutive aktivering af Wnt signalering skyldes mutationer i dets komponenter, APC og /eller beta-catenin, fremmer tumorigenese i colon [4] – [7], og sådanne mutationer er karakteristisk for størstedelen af ​​coloncancer (CC). Vi har observeret, at CC-celler med mutationer i komponenterne i den kanoniske Wnt signalering hyper-inducere denne vej i nærvær af histondeacetylaseinhibitorer (HDACi), såsom butyrat (et fermenteringsprodukt af fiber i tyktarmen), SAHA, MS275, og Trichostatin A [8], [9]. Disse HDAC-hæmmere inducere apoptose i CC-celler, og de apoptotiske niveauer er afhængige af gange ændring i kanonisk Wnt aktivitet: CC celler, der udviser lav induktion af Wnt /catenin signalering i nærvær af HDAC-hæmmere er relativt resistente over for de apoptotiske virkninger af midlerne; Celler, som undergår betydelig aktivering af kanoniske Wnt signalering er meget følsomme over for apoptose [8]. Vi har konstateret, at stigningen i Wnt /catenin aktivitet i butyrat-behandlet CC celler forud den apoptotiske begivenhed, fordi (a) inhibering af apoptose ved en generel caspaseinhibitor ikke modvirker stigningen i Wnt /catenin aktivitet (upublicerede data), og (b) flowcytometri-sorteret celle fraktioner med høj kanoniske Wnt signalering består af både live og apoptotiske celler; men hvis apoptose var en forudsætning for induktion af Wnt aktivitet, alle celler med høj Wnt aktivitet burde have været apoptotisk [8]. Den direkte forbindelse mellem gange induktion af Wnt /catenin aktivitet og graden af ​​apoptose blev observeret i analyser af ti humane CC cellelinier udsættes for butyrat, og dette forhold er forårsagende siden: (a) celler, der udtrykker inducerbare dominante negative TCF4, der undertrykker Wnt /catenin signalering, udviser reduceret apoptose i nærværelse af butyrat [8], og (b) flowcytometri-sorterede cellefraktioner med høj kanonisk Wnt aktivitet har et højere forhold mellem apoptotisk at leve celler end cellefraktioner med lave niveauer af kanoniske Wnt aktivitet [8]. Konstateringen af, at hyper-aktivering af Wnt /beta-catenin signalering resulterer i høje niveauer af apoptose [8], [9] er i overensstemmelse med de rapporter, der folder ændringer i signalveje, snarere end absolutte niveauer af signalering, fremkalde betydelig fysiologisk reaktion fra celler [10] – [12]

Gennem analyser af ti humane CC cellelinier, har vi fundet, HCT-116 celler responderer på butyrat og andre HDAC-hæmmere med hyper-induktion af Wnt /catenin signalering og høje niveauer. af apoptose [8]. Men ved gradvis eksponering af HCT-116 celler til stigende koncentrationer af butyrat, vi afledt butyrat-resistent HCT-R-celler. Disse celler vokser i nærværelse af 5 mM butyrat, en koncentration, der inducerer høje niveauer af apoptose i de parentale HCT-116-celler [9]. HCT-R-celler er også krydsresistente over for strukturelt forskellige HDAC-hæmmere, såsom TSA, MS-275, SAHA, og LBH589 [9]. Da vi har konstateret, at (1) den apoptotiske resultat i CC-celler er afhængig af induktion af kanoniske Wnt aktivitet [8], og (2) den hyper-aktivering af kanonisk Wnt signalering i butyrat-behandlet CC celler er delvis indledt på ligand-receptor-niveau [9], vi postulerede, at lægemiddel-sensitive og medikament-resistente CC celler afviger i ekspressionen af ​​Wnt ligander, receptorer og /eller positive og negative modulatorer af Wnt /catenin signalering ved ligand-receptor-niveau [8], [9]. I denne rapport har vi undersøgt disse muligheder, og fandt, at CC celler overlever udsættelse for butyrat eller andre HDAC-hæmmere ved at nedsætte kanoniske Wnt signalering og øge beta-catenin -. Uafhængige (noncanonical) Wnt signalering

Resultater

Forøget ekspression af mediatorer af noncanonical Wnt signalering i HDACi-resistent CC celler Salg

Vi har tidligere rapporteret, at HDACi-resistente fænotype af HCT-R-celler ikke skyldes nedsat acetylering af histon-proteiner, men snarere til den manglende evne af cellerne til hyper-inducere kanoniske Wnt signalering i samme omfang som de parentale HDACi-følsomme HCT-116-celler [9]. Vores resultater viste, at undertrykkelsen af ​​Wnt /catenin aktivitet i HDACi-resistente celler skyldes den ændrede ekspression af Wnt-ligander, deres receptorer og /eller modulatorer af Wnt-signalering ved ligand-receptor-niveau [9]. For at undersøge denne mulighed, analyserede vi udtrykket profiler af mock- og butyrat-behandlet HCT-116 (HDACi-sensitive) og HCT-R (HDACi-resistent) celler ved Wnt-specifikke PCR-arrays (SA Biosciences). Analyserne viste, at ved udsættelse for 5 mM butyrat, HCT-116 og HCT-R celler signifikant forøget ekspression af

WNT5A

WNT11

mRNA (data ikke vist), og vi har bekræftet denne ændring i ekspression på proteinniveauet (fig. 1A). Sammenlignet med HCT-116 celler, HCT-R-celler udtrykte højere niveauer af både ligander, og tilstedeværelsen af ​​secerneret WNT5A og WNT11 i vævskultur medier konditioneret med CC-celler blev bekræftet (fig. 1A)

(A) repræsentative western blot-analyser af CC-celler og deres konditionerede medier efter udsættelse for mock behandling (M) eller 5 mM butyrat (B) i 19 timer. (B og C). Silencing af

WNT5A

ROR2

udtryk øger Wnt /catenin transkriptionel aktivitet af HCT-116 (B) og HCT-R (C) celler. Celler (50.000 /brønd) blev cotransficeret med journalister for Wnt /catenin transkriptionel aktivitet (TopFlash eller FopFlash, 50 ng /brønd), pRL-TK som en kontrol for transfektion effektivitet og kontrol,

ROR2

, eller

WNT5A

siRNA’er (10 pmol /brønd). Nukleinsyrer blev indført i celler via en omvendt transfektionsprotokol med Lipofectamine 2000 96-brønds plader. På 31 timer efter transfektion blev cellerne eksponeret i 20 timer for at håne (m) eller 5 mM butyrat (b) behandling. Wnt transkriptionsaktivitet blev beregnet som forholdet mellem aktiviteten af ​​TopFlash (med vildtype Lef /Tcf bindingssteder) og FopFlash (med mutante Lef /TCF-bindingssteder). Hver transfektion blev udført i dobbeltbestemmelse brønde; Dataene repræsenterer gennemsnittet fra resultaterne af tre forsøg. (D). Overekspression af WNT5A undertrykker kanoniske Wnt transkriptionel aktivitet af HCT-116-celler. Co-transfektion af HCT-116 celler (50.000 /brønd) med den Wnt aktivitet reportere TopFlash eller FopFlash (50 ng per brønd), og pcDNANeo3.1 eller WNT5A-udtrykkende konstruktion (150 ng per brønd) blev udført gennem en omvendt transfektion med Lipofectamine (0,7 pl /brønd) i plader med 96 brønde. Efter transfektion blev celler eksponeret for mock behandling (m) eller 5 mM butyrat (b) i 20 timer. Hver transfektion blev udført i dobbeltbestemmelse brønde; Dataene repræsenterer gennemsnittet fra resultaterne af mindst tre eksperimenter. (E) Undertrykkelse af

ROR

2 udtryk øger følsomheden af ​​HDACi-resistente HCT-R celler til vækst-undertrykkende effekt af butyrat. HCT-R-celler (10

6) blev nucleofected med 175 pmol

ROR2

(Invitrogen) eller kontrol siRNA, og 500.000 celler blev udpladet pr brønd i en 6-brønds plade. Ved 24 timer blev cellerne eksponeret for mock behandling (m) eller 5 mM butyrat (b) i 17 timer. Ved 48 timer efter nucleofection blev celler udpladet ved 100 eller 200 per brønd i triplikater. Procent klonal vækst blev beregnet som antallet af kolonier, der opstår fra en enkelt cellesuspension af 100 celler. Eksperimentet blev gentaget tre gange, og resultaterne er gennemsnittet fra dataene fra de tre eksperimenter. Statistisk signifikante forskelle bemærket af stjerner

Afhængig af receptor sammenhæng WNT5A og WNT11 fremkalde enten kanonisk eller noncanonical Wnt signalering [13] -. [17]. Da WNT5A inducerer noncanonical Wnt aktivitet i nærværelse af receptoren ROR2, vi analyserede udtryk for ROR2 i de to CC cellelinjer. Western blot-analyser afslørede, at begge celletyper udtrykte ROR2; dog HCT-R celler udviste højere niveauer af ROR2 end HDACi-følsomme HCT-116 celler (Fig. 1A). Derfor er det muligt, at WNT5A fungerer som en noncanonical ligand i butyrat-behandlede celler, og at HCT-R-celler udviser højere niveauer af noncanonical Wnt signalering end HCT-116-celler.

For at konstatere virkningen af ​​WNT5A og ROR2 om Wnt aktivitet, vi co-transficeret HCT-116 og HCT-R-celler med transkriptionelle reportere til Wnt /beta-catenin signalering (TopFlash eller FopFlash) og siRNA’er til

WNT5A

eller

ROR2

. Den reducerede ekspression af WNT5A og ROR2 i HCT-116 celler steg Wnt /beta-catenin transkriptionel aktivitet i en statistisk signifikant måde (fig. 1B). Butyrat-behandlet HCT-116 celler med undertrykt

ROR2

WNT5A

udtryk øget deres niveau af kanoniske Wnt /catenin aktivitet til 233,0 ± 19,8 og 161,0 ± 32,0 i forhold til kontrol-transficerede celler ( 94,8 ± 10,8), P 0,05, i mock-behandlede HCT-R-celler, undertrykkelsen af ​​

ROR2

WNT5A

udtryk ændrede ikke signifikant Wnt transkriptionelle niveauer i forhold til dem i celler transficeret med kontrol siRNA (17,4 ± 4,6 og 12,8 ± 1,8, sammenlignet med 15,3 ± 3,7 i kontrol celler, P 0,05) (fig 1C.). Men i butyrat-behandlet HCT-R-celler, undertrykkelsen af ​​

ROR2

WNT5A

udtryk resulterede i signifikant højere niveauer af kanoniske Wnt transkriptionel aktivitet, sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA (60,2 ± 12,5 og 53,1 ± 8,4 i forhold til 31,2 ± 7,9 i kontrol celler, P . 0,05) (fig 1C). Derfor WNT5A og dens receptor ROR2 modvirke induktionen af ​​Wnt /beta-catenin-aktivitet i butyrat-behandlet HCT-116 og HCT-R-celler.

Denne konklusion blev støttet af resultaterne fra overekspression af WNT5A i HCT -116 celler. HCT-116-celler, der udtrykker lavere niveauer af WNT5A end HCT-R-celler (fig. 1A), blev co-transficeret med Wnt /beta-catenin reportere og en tom vektor, eller en WNT5A ekspressionsvektor. Cellerne co-transficeret med en tom vektor øget deres Wnt /beta-catenin aktivitet (TopFlash /FopFlash) fra 5,2 ± 1,1 til 62,2 ± 9,3; henviser til, at de celler, der overudtrykker WNT5A øget deres Wnt /beta-catenin aktivitet fra 3,7 ± 0,1 til 13,2 ± 0,3 (fig. 1D). Forskellen i Wnt /beta-catenin transkriptionsaktivitet mellem styre- og WNT5A-transficerede celler i nærvær af butyrat var statistisk signifikant (P 0,05).

Da silencing af

ROR

2 ekspression i HCT-R-celler resulterede i højere niveauer af Wnt /beta-catenin signalering, og vi har tidligere observeret, at den højere induktion af Wnt /beta-catenin i CC-celler, svarer til højere følsomhed af cellerne over for virkningerne af butyrat [8 ], vi analyserede klonal vækst af HCT-R-celler nucleofected med kontrol siRNA eller

ROR

2 siRNA. I fravær af butyrat, kontrol siRNA- og

ROR

2 siRNA-transficerede celler udviste en svag, men statistisk signifikant, forskel i klonal vækst (75,3 ± 1,4% versus 67,6 ± 3,4%, P 0,05) . I nærvær af butyrat, forskellen i klonal vækst evne var mere udtalt; kontrol-nucleofected HCT-R celler udviste klonal vækst på 71,3 ± 3,8% og

ROR

2 siRNA-nucleofected celler udviste 51,4 ± 5,5% af klonal vækst (fig. 1E).

Induktion af den AKT /PKB overlevelse vej af WNT5A og ROR2 i CC celler

stigningen i WNT5A udtryk i butyrat-behandlet HCT-116 og HCT-R-celler bedt en søgning efter nedstrøms effektorer af liganden. Adskillige noncanonical WNT5A-induceret tilgange er blevet identificeret, og mindst to af disse er ROR2-afhængige: phosphotidylinositol-3-kinase (PI3-K) /AKT signalering udløses af phosphoryleringen af ​​AKT kinase [18] – [20], og JNK-signalvejen [21] – [23]. I overensstemmelse med disse rapporter, vi observeret, at Serine473-phosphoryleret AKT (Pakt) udtrykkes ved højere niveauer i HDACi-resistente HCT-R-celler i forhold til HCT-116 celler, og i begge cellelinier, udsættelse for butyrat forøgede niveauerne af Pakt ( fig. 2A).

(A) HDACi-resistente HCT-R celler udtrykker højere niveauer af Pakt end HDACi-følsomme HCT-116 celler. Celler blev udpladet i 6-brønds plader med 450.000 celler per brønd, og efter 24 timer blev udsat for spotte (M) eller 5 mM butyrat (B) behandling i 17 timer. Total protein lysater blev analyseret ved western blot-analyser, og niveauer af Ser473-phosphoryleret AKT (Pakt), total AKT (AKT), og actin blev detekteret som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) HCT-R-celler er mere resistente over for 5-fluoruracil (5-FU) induceret apoptose end parentale HDACi-følsomme HCT-116-celler. Celler blev udsat for 1,5 mM 5-FU i 24 timer, og apoptotiske assays blev udført som beskrevet i Materialer og Metoder. Procentdel af levende celler blev beregnet ved at dividere antallet af levende celler med det samlede antal analyserede celler. (C) Silencing af ROR2 udtryk i HCT-R-celler nedsætter niveauerne af Ser473-phosphoryleret AKT. En million celler blev nucleofected med kontrol eller

ROR

2 siRNAs (175 pmol, Invitrogen) og udpladet på 500.000 per brønd i plader med 6 brønde. Ved 24 timer efter transfektion blev cellerne udsat for spotte (M) eller 5 mM butyrat (B) i 19 timer. Totale cellelysater blev analyseret ved Western blot; en repræsentativ Western blot vises. Søjlediagrammet under Western blot-billede repræsenterer kvantificering af Pakt niveauer i tre uafhængige forsøg ved densitometri, forskellen mellem butyrat-behandlede celler er statistisk signifikante (P 0,05), (D) .Overexpression af rekombinant WNT5A i HCT-116-celler resulterer i øgede Pakt niveauer. HCT-116-celler blev transficeret med en tom vektor eller en WNT5A ekspressionsvektor, og selekteret for stabil ekspression af disse konstruktioner. Dobbelte prøver blev analyseret for ekspressionsniveauer af WNT5A og Pakt som beskrevet ovenfor; en repræsentativ Western blot vises. Søjlediagrammet under western blot repræsenterer kvantificering af Pakt i tre uafhængige forsøg med densitometri, P 0,05. (E) repræsentant western blot analyse af SW620 humane CC-celler og SW620R celler, der vokser på 3 mM butyrat. De to cellelinjer blev udsat for håne (m) eller 5 mM butyrat (b) behandling i 17 timer og analyseret som i 2A. (F). SW620 celler, der udtrykker eksogene WNT5A udstille undertrykt induktion af Wnt /beta-catenin transskription af butyrat, P 0,05. Transfektion og analyser blev udført som beskrevet i fig. 1D.

Da AKT /PKB er en celle overlevelse vej, vi begrundet, at høje Pakt niveauer i HCT-R celler kan beskytte cellerne ikke kun mod apoptose induceret af HDAC-hæmmere, men også mod andre apoptotiske stimuli . For at evaluere denne mulighed, sammenlignede vi respons af HCT-R-celler og deres HDACi-følsomme modparter, HCT-116 celler, til 5-fluoruracil (5-FU), et udbredt kemoterapeutisk middel til CC. Koncentrationen af ​​5-FU kræves til 50% vækstinhibering er blevet rapporteret for HCT-116-celler, og lægemiddelresistente cellelinier afledt fra HCT-116-celler, og er i området fra 0,09 mM til 2,4 mM [24]; derfor, vi analyserede opfølgningen af ​​HCT-116 og HCT-R-celler til 1,5 mM 5-FU (fig. 2B). Behandling af HCT-116 celler med 5-FU medførte et signifikant fald i antallet af levende celler fra 86,7 ± 8,3 til 48,1 ± 8,0 (P 0,05); henviser til, at har den samme eksponering af HCT-R-celler ikke signifikant ændre antallet af levende celler. Således mock-behandlede celler udviste 95,8 ± 2,1% levende celler, og 5-FU – behandlede celler udviste 91,6 ± 4,2% levende celler, P . 0,05 (. Figur 2B)

Muligheden for en kausal sammenhæng mellem øgede niveauer af Pakt og udtryk for WNT5A og ROR2 blev testet via gendæmpning og gen-overekspression eksperimenter. Silencing af

ROR2

ekspression i HCT-R-celler ved siRNA resulterede i et moderat fald i Pakt niveauer, og forskellen i Pakt niveauer var statistisk signifikant kun mellem butyrat-behandlede celler (fig. 2C), overekspression af WNT5A i HCT-116 celler førte til øgede niveauer af Pakt, og forskellen var også statistisk signifikant (fig. 2D).

Yderligere undersøgelser med humane tyktarmskræft celler SW620, og afledt heraf SW620R celler, at vokse med 3 mM butyrat, indikerede, at disse celler ikke udtrykker detekterbare niveauer af ROR2 (data ikke vist); dog de udtrykker WNT5A, og udsættelse for butyrat stiger Pakt niveauer (fig. 2E). Interessant exogen ekspression af WNT5A i SW620 celler undertrykt Wnt /beta-catenin afhængig transkription, selv i fravær af påviselig ROR2 udtryk: i nærvær af butyrat Wnt aktivitetsniveauer i WNT5A-udtrykkende SW620-celler var 271 ± 32, og disse i kontrol-transficerede celler var 389 ± 35 (fig. 2F). Derfor, i tillæg til ROR2, kan andre receptorer medierer WNT5A signal, og den nedstrøms aktivering af AKT kinase.

Suppression af Pakt niveauer forøger apoptotiske respons af CC-celler til HDAC-hæmmere

Siden AKT signalering er en vigtig celleoverlevelse pathway, vi ræsonnerede, at dens undertrykkelse i CC-celler eksponeret for HDAC-hæmmere vil forøge de apoptotiske virkninger af disse midler. Vi udnyttede MK2206, som er en allosterisk inhibitor af AKT [25], og konstateret, at agenten ved 5 uM undertrykker Pakt niveauer i både HCT-116 og HCT-R-celler (fig. 3A). At bestemme, hvordan Wnt /beta-catenin signalering påvirkes af AKT kinase inhibitor MK2206 alene eller i kombination med en HDACi (butyrat eller LBH589), analyserede vi niveauerne af transkriptionelt aktive (dephosphoryleret) beta-catenin i HCT-116-celler behandlet for 8 eller 17 timer (fig. 3B). Efter 8 timer, HDACi-sensitive HCT-116-celler ikke udviser tegn på apoptose, som konstateret ved flowcytometri analyser med Annexin V (data ikke vist); dog på 17 timer apoptose er allerede registreret og beta-catenin spaltes ved dets N- og C-terminale ende af caspaser (se pilen på anden panelet i fig. 3B). Derfor analyser af transkriptionelt aktive beta-catenin-niveauer blev udført ved 8 timer i HCT-116 og HCT-R-celler (fig. 3B og 3C). I begge cellelinjer, har MK2206 ikke medføre væsentlige ændringer i niveauerne af aktiv beta-catenin i forhold til prøver behandlet med en HDACi alene; Imidlertid blev niveauerne af Pakt undertrykt af MK2206 i alle behandlinger (fig. 3D).

(A) Suppression af Pakt niveauer i CC celler ved allosterisk inhibitor MK2206. Repræsentativ Western blot-analyse af CC celler eksponeret i 17 timer for at spotte (m), 5 mM butyrat (B), butyrat og 1 uM MK2206 (MK1B), eller butyrat og 5 uM MK2206 (MK5B). (B) Steady state niveauer af transkriptionelt aktiv beta-catenin er ikke faldet i HCT-116 celler ved kombineret behandling med en HDACi og MK2206. Cellerne blev udsat i 8 eller 17 timer til mock behandling (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). Totale cellelysater blev analyseret for steady state niveauer af total og Ser37 /Thr41 dephosphorylerede beta-catenin. er vist repræsentativt Western blot analyse. (C) Aktive beta-catenin-niveauer i HCT-R-celler eksponeret i 8 timer at spotte (m), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (l) eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). (D) repræsentant western blot-analyse af Ser473-phosphoryleret AKT (Pakt) og total AKT (AKT) niveauer i CC celler eksponeret i 17 timer for at spotte (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK) , 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). (E) Induktion af Wnt /catenin-afhængig transkriptionel aktivitet (TopFlash /FopFlash) i CC celler ved en HDACi (butyrat eller LBH589) ikke undertrykt af en Pakt inhibitor. Celler blev nucleofected på en million med 1 ug plasmid (TopFlash eller FopFlash) og pRL-TK, fortyndet og udpladet på 30.500 celler per brønd i 96-brønds plader. Ved 24 timer efter nucleofection blev celler behandlet i 8 timer med mock (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 um MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). Dataene repræsenterer gennemsnittet fra resultaterne af mindst tre eksperimenter. Statistisk signifikante forskelle bemærket af en stjerne. (F) Apoptotiske niveauer i HCT-116 og HCT-R-celler eksponeret for HDAC-hæmmere og en Pakt inhibitor. Cellerne blev eksponeret i 28 timer til: mock behandling (M), 5 mM butyrat (B), butyrat og 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), eller 100 nm LBH589 og 5 uM MK2206 (LMK). Procent apoptose og nekrose blev beregnet ved at dividere antallet af apoptotiske og nekrotiske celler med det samlede antal analyserede celler. Hvert forsøg havde tredobbelte prøver pr behandling; Dataene repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter. Statistisk signifikante forskelle bemærket af en stjerne. (G, H) SW48 humane CC celler med vildtype KRAS er så følsomme som HCT-116 celler med mutant KRAS til kombineret behandling med en HDACi og en Pakt inhibitor. SW48-celler blev behandlet og analyseret som beskrevet i Figs.3D og 3F. Repræsentative western blots og apoptotiske data, som repræsenterer gennemsnittet af tre eksperimenter, er vist. Statistisk signifikante forskelle bemærket af en stjerne.

For direkte at måle Wnt /beta-catenin transskription i celler udsat for en Pakt-hæmmer og /eller HDAC-hæmmere, vi transficerede celler med en reporter for Wnt /beta- catenin aktivitet (TopFlash) eller med en kontrol reporter (FopFlash) (fig. 3E). Den Wnt /catenin transkriptionel aktivitet (TopFlash /FopFlash) i HCT-116 celler udsat for håne eller MK2206 behandling var 3,9 ± 0,4 og 2,8 ± 0,8 henholdsvis (P 0,05). I HCT-116 celler udsat for butyrat eller butyrat og MK2206, aktiviteten steg til 8,73 ± 2,9 og 12,8 ± 1,3 (for begge behandlinger, P 0,05). Endelig, når HCT-116 celler blev udsat for LBH589 eller LBH589 og MK2206, Wnt /beta-catenin aktivitet steg til 7,1 ± 0,6 og 11,3 ± 2,1 henholdsvis (P 0,05). I HCT-R-celler, at eksponering spotter, MK2206, butyrat, butyrat og MK2206, LBH589 eller LBH589 og MK2206 resulterede i Wnt /beta-catenin aktivitet på 6,1 ± 0,9, 4,6 ± 1,2, 11,7 ± 2,8, 16,0 ± 2,9, 15,2 ± 0,5, og 17,2 ± 1,2 henholdsvis (P 0,05 for kombinatoriske behandlinger sammenlignet med behandlinger med en HDACi alene). Således ikke MK2206 ikke undertrykke opregulering af Wnt transkriptionel aktivitet af HDAC-hæmmere.

Den kombinerede effekt af HDAC-hæmmere og MK2206 om apoptose blev målt via flowcytometri analyser. Selv om der ikke var nogen statistisk signifikant forskel mellem de apoptotiske niveauer i mock og MK2206-behandlede celler, tilsætning af MK2206 og butyrat eller LBH589 resulterede i en statistisk signifikant stigning i apoptose sammenlignet med behandling med hver HDACi alene (fig. 3F). Således HCT-116 celler udsat for spotte eller MK2206 udviste apoptotiske niveauer af 12,8 ± 2,2% og 14,3 ± 3,5%, henholdsvis (P 0,05). Behandling af HCT-116 celler med butyrat, eller butyrat og MK2206 resulterede i 44,2 ± 1,5% og 64,2 ± 4,4% apoptose, henholdsvis (P 0,05). I nærvær af LBH589 eller LBH589 og MK2206, HCT-116 celler udviste 55,7 ± 6,9% og 73,5 ± 4,7% apoptose, henholdsvis (P 0,05). I, HCT-R-celler, at eksponering spotter eller MK2206 behandling resulterede i 11,4 ± 3,6% og 11,0 ± 4,0% apoptose, henholdsvis (P 0,05); udsættelse for butyrat eller butyrat og MK2206 resulterede i 14,4 ± 3,6% og 25,2 ± 4,1% apoptose (P 0,05), og udsættelse for LBH589, eller kombinationen af ​​LBH589 og MK2206 førte til 31,6 ± 5,3 og 45,7 ± 4,4% apoptose ( P. 0,05)

i øjeblikket er Pakt hæmmeren MK2206 er i et klinisk forsøg for tyktarmskræft med vildtype-KRAS; Kombinationen af ​​en HDACi og en Pakt kinase inhibitor var meget effektivt inducerer apoptose i HCT-116-cellelinjen, som er

KRAS

-mutant, og i re-sensibiliserende HCT-R-celler til den apoptotiske effekter af HDAC-hæmmere. For at sammenligne effektiviteten af ​​lægemiddelkombinationen i CC-celler med vildtype-KRAS, analyserede vi den apoptotiske respons af humane coloncancer-celler SW48-celler. SW48-celler reagerede på kombinationen af ​​en HDACi og MK2206 med statistisk signifikant stigning i apoptose (. Fig 3G): mock og MK2206 behandlinger resulterede i 16,6 ± 0,7% og 16,9 ± 0,7% apoptose, henholdsvis (P 0,05). Behandling af SW48 celler med butyrat, eller butyrat og MK2206 resulterede i 49,7 ± 4,4 og 75,6 ± 1,2% apoptose, henholdsvis (P 0,05), og udsættelse for LBH589 eller LBH589 og MK2206 resulterede i 56,1 ± 6,3% og 78,3 ± 3,7% apoptose, henholdsvis (P 0,05). Western blot analyser bekræftet, at MK2206 pålideligt undertrykt HDACi-inducerede niveauer af Pakt i SW48 CC-celler (fig. 3H).

Kost-afledte stoffer, som efterligner virkningen af ​​syntetiske HDAC-hæmmere og Pakt hæmmere

de kombinationen af ​​syntetisk HDAC-hæmmere og Pakt hæmmere kan anvendes i CC terapi eller forebyggelse for patienter med øget risiko for CC (fx patienter med opereret CC og /eller kronisk IBD), kosten regimer, der giver metabolitter med HDAC- og Pakt -inhibitory funktioner kunne blive en forebyggende CC tilgang til den almindelige befolkning. Da butyrat er de mest potente kost-afledte HDACi produceret i tyktarmen [26], bør en CC-forebyggende kost indeholde tilstrækkelige niveauer af fermenterbare fibre. For at finde en Pakt inhibitor, der kan udledes af kost, vi udført en litteratursøgning og fundet publikationer om sulforaphane, naturlige sphingadienes, hvidløg-afledte diallyl trisulfid (DATS), kaffesyre phenethyl ester (CAPE, fra honningbier propolis), curcumin, og resveratrol, som alle inhiberer Pakt niveauer i forskellige celletyper [27] – [33]. Vi testede nogle af disse forbindelser for deres evne til at undertrykke niveauerne af butyrat-induceret Pakt i CC-celler, og fandt, at CAPE, DATS, og sulforaphane undertrykkes forøgelsen af ​​Pakt kinase niveauer i butyrat-behandlet HCT-116 celler, og kun CAPE og DATS var aktive i HCT-R-celler (fig. 4A). Af de tre testede forbindelser, CAPE var mest kraftfulde til undertrykkelse butyrat-inducerede niveauer af Pakt i begge celletyper; Men var det ikke inducere apoptose i en af ​​disse celler i sig selv (fig. 4B). Således i HCT-116-celler, mock eksponering og behandling med 4 ug per ml CAPE resulterede i 12,2 ± 3,1% og 11,9 ± 0,8% apoptose, henholdsvis; udsættelse for butyrat eller kombinationen af ​​butyrat og CAPE resulterede i 44,8 ± 1,8% og 78,4 ± 6,5% apoptose, henholdsvis (P 0,05). I HCT-R-celler, mock eksponering, behandling med butyrat, og behandling med CAPE alene resulterede i 8,9 ± 1,2%, 12,6 ± 1,7%, og 10,9 ± 3,0% apoptose, henholdsvis (P 0,05). Men når HCT-R-celler blev udsat for kombinationen af ​​CAPE og butyrat, de apoptotiske niveauer steget med næsten tre gange, til 30,6 ± 3,6% (P 0,05) (fig 4B.). Efterfølgende analyser viste, at i butyrat-behandlet HCT-R-celler, CAPE undertrykker phosphorylerede niveauer af p55-underenheden af ​​phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K), en større opstrøms aktivator af AKT kinase (fig. 4C). Imidlertid er den præcise trin, hvor denne undertrykkelse sker ikke kendt, og det er et fokus for fremtidig forskning. Vi har ikke registrerer konsekvent undertrykkelse af phospho-p55 PI3K niveauer i HCT-116 celler udsat for CAPE og butyrat (data ikke vist).

(A) Kost-afledte forbindelser undertrykker butyrat-induceret Pakt niveauer i CC celler. Repræsentant western blot af celler udsat i 14 timer til mock behandling (M), 5 mM butyrat (B), 5 mM butyrat og 4 pg /ml CAPE (BC), 5 mM butyrat og 20 uM sulforaphane (BS), 5 mM butyrat og 40 pm DATS (BD). Påvisning af Pakt blev totalt AKT (AKT), og actin udført med det totale antal celler lysater.