PLoS ONE: High-Quality NMR Struktur for Human antiapoptotiske Protein Domain Mcl-1 (171-327) for Cancer Drug Design

Abstrakt

En høj kvalitet NMR løsning struktur præsenteres for protein hMcl- 1 (171-327), som omfatter resterne 171 til 327 af det humane anti-apoptotisk protein Mcl-1 (hMcl-1). Da denne konstruktion indeholder tre Bcl-2 homologi (BH) sekvens motiver, som deltager i at danne et bindingssted for hæmmere af hMcl-1, anses den for at være afgørende for struktur-baseret design af nye kræftlægemidler blokerer Mcl1 relaterede anti-apoptotiske vej. Mens koordinaterne for et NMR opløsning struktur for en tilsvarende konstruktion af muse homologen (mMcl-1) er offentligt tilgængelige, vores struktur er den første atomar opløsning struktur rapporteret til »apo form« af det humane protein. Sammenligning af de to strukturer afslører, at hMcl-1 (171-327) har en noget bredere ligand /inhibitor bindende rille samt et andet ladningsfordeling i BH3 bindende fure. Disse resultater tyder på, at tilgængeligheden af ​​den menneskelige struktur er af afgørende betydning for at støtte fremtidige udformning af kræftlægemidler

Henvisning:. Liu G, Poppe L, Aoki K, Yamane H, Lewis J, Szyperski T (2014 ) High-Quality NMR struktur for human antiapoptotiske Protein Domain Mcl-1 (171-327) for Cancer Drug design. PLoS ONE 9 (5): e96521. doi: 10,1371 /journal.pone.0096521

Redaktør: Annalisa Pastore, National Institute for Medical Research, Medical Research Council, London, England

Modtaget: 17. december, 2013; Accepteret: April 8, 2014; Udgivet: Maj 2, 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Amgen Inc. (www.amgen.com). LP, KA, HY og JL er medarbejdere i Amgen Inc. og Amgen Inc. spillet en rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse var finansieret af Amgen Inc. men der er ingen konkurrerende interesse, der kan forspænde dette arbejde. Dette tilhørsforhold ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

dårligt fungerende cellulære apoptose [1] er en væsentlig kendetegnende for kræft. Reguleringen af ​​apoptose afhænger af familien af ​​Bcl-2-proteiner, som indeholder en eller flere Bcl-2-homologi (BH) sekvensmotiver. Baseret på deres funktion og ligheden mellem deres respektive BH sekvens motiver, kan disse proteiner inddeles i tre klasser [2], [3]: (i) multi-domæne pro-apoptotiske proteiner såsom Bax og Bak, (ii) anti -apoptotic (dvs. pro-overlevelse) proteiner, såsom Mcl-1, Bcl-1, Bcl-x

L, Bcl-w og Bfl-1 /A1, der alle udviser en lignende arkitektur som Bax og Bak, og (iii) flere pro-apoptotiske proteiner omfattende kun en enkelt BH3 sekvens motiv som Bid, Bad, Bim, Puma, Noxa, HRK, BMF, og NBK /Bik ( ‘BH3 kun for’ proteiner). BH3 motiv af klasse (iii) proteiner danner en amfipatisk α-helix, som interagerer specifikt med en hydrofob lomme dannet i både pro-apoptotisk klasse (i), og anti-apoptotisk klasse (ii) proteiner med at inddrage deres BH-motiver [ ,,,0],2], [3]. Inhibering af det resulterende protein-protein-kompleks-dannelse er en lovende strategi til behandling af kræft. For eksempel er den lille molekyle Bcl-2 antagonist ABT-737 [4] inhiberer anti-apoptotisk klasse (ii) proteiner Bcl-x

L, Bcl-w og Bcl-1, og en beslægtet stof [5], der kan være indgivet oralt i øjeblikket i kliniske forsøg.

anti-apoptotiske, pro-overlevelse 350-rest protein Mcl-1 ( ‘myeloid celleleukæmi-1’) [2] er primært forankret i den ydre mitokondriske membran ved et C-terminalt transmembrane domæne og indeholder tre BH sekvens domæner: BH3 (resterne 209-223), BH1 (252-272) og BH2- (resterne 304-319) [2]. MCL-1 inhiberer dødsreceptor-induceret apoptose ved selektivt at binde til trunkeret Bud (tBid) [6] og kan sekvestrere endogent Bak til at blokere Bak-medieret celledød. Desuden Mcl-1 interagerer med flere BH3-kun proteiner (Bim, Bid og Puma, Noxa og Bak). Derfor Mcl-1 spiller en tidlig rolle som reaktion på signaler, der dirigerer enten celleoverlevelse eller celledød [2] og er blevet vist at være opreguleret i talrige maligne tumorer. Approaches ophævelse MCL-1 anti-aptototic funktion enten ved at reducere sin overflod eller ved at inaktivere sin funktionelle BH3-bindende rille show meget lovende for kræftbehandlingen [2], [4], [6], [7]. Her præsenterer vi den høje kvalitet NMR løsning struktur polypeptid segment 171-327 af humant Mcl-1 (hMcl-1), der omfatter de tre BH motiver anses for at være afgørende for struktur baseret drug design.

Resultater og diskussion

En høj kvalitet NMR struktur hMcl-1 (171-327) blev opnået (tabel 1) og koordinaterne blev aflejret i FBF [8] (tiltrædelse kode 2mhs). Konstruktionen omfatter syv α-helixer α1-a7 (resterne 173-191, 204-235, 240-253, 262-280, 284-301, 303-308 og 311-319) indrettet til at danne den karakteristiske “Bcl-2 kerne »strukturen [9] (Figur 1). Helixerne er lokalt og globalt veldefineret, mens C-terminalen (resterne 320-327) og løkkerne forbinder henholdsvis helixer α1 og α2, helixer α3 og α4, og helixer α4 og α5 er fleksibelt uordnede. Den centrale helix α4 er omgivet af de andre seks helixer, med α1, α2, α3 og α5 pakket omkring den ene side og α6 og α7 pakket mod dets N-terminale ende. Helices α2, α3, α4 og α7 deltager i dannelse af BH3 bindende fure. Det elektrostatiske protein overflade potentiale er positiv ved begge ender af BH3 bindende rille (på grund af tilstedeværelsen af ​​Arg 233, Lys 234, Arg 248 og Arg 263) og negative på siden af ​​helix α3 side (grundet Asp 256) (figur 2). Dette viser, at ladningsfordelingen i BH3 bindende fordybning af hMcl-1 (171-327), afviger tydeligt fra andre anti-apoptotiske proteiner [10].

(A) Backbone af de 20 Cyana konformere repræsenterer opløsningen struktur hMcl-1 (171-327) efter superposition af rygraden N, C

α og C ‘atomerne af a-helixer for minimal rmsd. De tre BH sekvensmotiver er farvet i grøn (BH3), rød (BH1) og blå (BH2), hhv. (B) Ribbon tegning af laveste energi konformer af hMcl-1 (171-327). α-helixer α1-α7 er mærket og farvet forskelligt, og N- og C-termini er mærket som “

N ‘

” og “

C

“. Tallene blev genereret ved hjælp af programmerne molmol [36] og PyMOL [37].

(A) Til human hMcl-1 (171-327) i retningen vist i figur 1 (venstre) og efter rotation 180 ° omkring den lodrette akse (højre). Surface farver (blå for positivt ladede, rød for negativt ladede) indikerede elektrostatiske potentiale beregnet ved anvendelse PyMOL [37] og dens standard vakuum electrostatics protokol. (B) Samme som i (A), men for mus mMcl-1 (152-308). |

Herunder vores hMcl-1 (171-327) struktur, tyve atomare opløsning strukturer indeholdende forskellige Mcl-1-konstruktioner i øjeblikket deponeres i FBF. Ud over de to “apo” proteiner hMcl-1 (171-327) og muse mMcl-1 (152-308) [10] [PDB optagelse kode 1wsx, 89% sekvensidentitet med det humane protein], strukturerne for nitten protein-ligand-komplekser blev deponeret (tabel 2) [9], [11] – [18]. Det er klart, det store antal tilgængelige strukturer afspejler den udestående interesse i Mcl-1 som et mål for udviklingen af ​​nye kræftlægemidler. Superposition af a-spiraler afslører, som forventet, tæt strukturel lighed for alle Mcl-1 proteiner strukturer (figur 3): den geometriske middelværdi afvigelse (RMSD) værdier spænder fra 1,05 til 1,54 Å i forhold til hMcl1-1 (171-327 ) (tabel 2). Men sammenligning af de to apo proteinstrukturer hMcl-1 (171-327) og mMcl-1 (152-308) med de komplekse strukturer viser, at bindingslommen udvides ved kompleksdannelse (tabel 2): ​​afstandene mellem C

α-atomer rester His 224 i helix α2 (His 205 i mMcl-1) og His 252 (His 233 i mMcl-1) ved C-terminalen af ​​helix α3 er henholdsvis ~16 Å og ~ 14 Å i hMcl-1 (171-327) og mMcl-1 (152-308), og ~18-21 Å i komplekserne.

(A) strukturer af hMcl-1 (171-327) (grøn) og mMcl-1 (152-308) (cyan, PDB optagelse kode 1wsx) efter overlejring af rygraden N, C

α og C ‘atomerne af a-helixer for minimal rmsd. (B) Ribbon tegning (zoomet ind (A)), der viser de forskellige bindingssteder notbredder af human (grøn) og mus (cyan) protein. Afstandene mellem Ca-atomerne af rester His 224 i helix α2 (His 205 i mMcl-1) og His 252 (His 233 i mMcl-1) ved C-terminalen af ​​helix α3 fremhæves: ~16 Å i hMcl- 1 (171-327) og ~14 Å mMcl-1 (152-308) (C) Overlejring som i (A), i hMcl-1 (171-327) (grøn) og mMcl-1 (152-308) (cyan , 1wsx), og seks udvalgte MCL-1 komplekse strukturer (se også tabel 2): ​​human Mcl-1 kompleksbundet med Bim BH3 (magenta, 2nla); kimære rotte-human rMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleks med musen mNoxaB BH3 (gul, 2rod); mus mMcl-1 (152-308) kompleks med musen NoxaA BH3 (pink, 2roc); mus mMcl-1 (152-308) kompleks med musen Puma BH3 (grå, 2jm6); mus mMcl-1 (152-308) kompleks med musen NoxaB BH3 (lilla, 2rod); kimære rotte-human mMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleks med human Bim BH3 (orange, 2nl9); kimære rotte-human mMcl-1 (171-208) hMcl-1 (209-327) kompleks med human Bim BH3 (L62A, F68A) (lys grøn, 3d7v) .De tal blev forberedt med programmerne molmol [36] og PyMOL [37].

det faktum, at det humane apo protein udviser en noget bredere bindende fordybning end musehomologen (tabel 2) kan være i det mindste delvist, tilskrives sidekæden af leu 246 i det humane protein, som ikke er begravet så dybt som den tilsvarende Phe sidekæden i museprotein. Endvidere, når man sammenligner den humane og muse-proteinet er forskellene observeret for ladningsfordelinger i BH3-bindende rille (figur 2): det humane protein er negativt ladet på den side af helixen α3, mens den tilsvarende overflade af museprotein er positivt ladet. Denne forskel skyldes Ser 255 svarende til Lys 236 i musen protein. Bemærkelsesværdigt, hMcl-1 (171-327) er strukturelt mere ligner hMcl1 (171-327) -hBim BH3-kompleks (figur 3) end til apo mMcl-1 (152-308) (tabel 2).

tilsammen strukturelle sammenligninger viser, at på trods af sekvensidentiteten 89% mellem human og muse-protein, kan forventes tilgængeligheden af ​​humane hMcl-1 (171-327) struktur for at være af afgørende betydning for at støtte fremtidige design af kræftlægemidler.

Materialer og metoder

NMR Prøveforberedelse

Foreløbige undersøgelser viste, at hMcl-1 (171-327) (UniProtKB /Swiss-Prot ID Q07820 /MCL1_HUMAN ) er ikke stabil i opløsning. Men mutant Cys 286 → Ser er stabil i flere uger ved koncentrationer ~0.7 mM, og både vildtype og mutant binder den Bim-BH3 peptid med samme affinitet (K

d ~ 60 pM) i en Biacore assay . Derfor har vi løst NMR struktur hMcl-1 (171-327) Cys 286 → Ser som hMcl-1 (171-327) i denne publikation er nævnt.

hMcl-1 (171-327) blev klonet, udtrykt, genfoldet og oprenset ifølge standardprotokoller for at fremstille en ensartet

13C,

15N-mærkede proteinprøve [19]. Kort fortalt blev klonet ind i en pET21d (Novagen) derivat gav plasmid pSR482-21.1. Den resulterende konstruktion indeholder syv ikke-native rester ved C-terminalen (LHHHHHH) for at lette proteinoprensning.

Escherichia Coli

BL21 (DE3) pMGK celler, en kodon forbedret stamme, blev transformeret med pMcl1-21.1 og dyrket i MJ9 minimalmedium [20] indeholdende (

15NH

4)

2SO

4 og

U

–

13C-glucose som eneste nitrogen og kulstof kilder. Dobbelte-vasket inklusionslegemer indeholdende hMcl-1 (171-327) blev solubiliseret i 8 M pufret guanidinhydrochlorid (VWR) indeholdende 5 mM DTT, langsomt fortyndet i ni volumener 20 mM Tris-HCI, 250 mM NaCl, 0,5 M urinstof, 10% glycerol, pH 7,4, og refoldes inden for 72 timer ved 4 ° C. hMcl-1 (171-327) blev oprenset under anvendelse af en Talon affinitetsharpiks (Clontech) påsat en HiTrap SP High Performance-søjle (GE Healthcare). Det endelige udbytte af renset

U

–

13C,

15N protein ( 98% homogent ved SDS-PAGE; 20,3 kDa ved MALDI-TOF massespektrometri) blev -25 mg /L. Desuden er en

U

–

15N og 5% biosyntetisk rettet fraktioneret

13C-mærkede prøve [21] blev genereret for stereo-specifik tildeling af isopropyl methylgrupper. NMR-prøver blev forberedt på 0,7 mM protein koncentration. En isotropisk samlet roterende korrelation tid på ~ 10 ns blev udledt

15N spin-relaksationstider indikerer, at hMcl-1 (171-327) er monomer i opløsning.

NMR spektroskopi

NMR spektre blev registreret ved 25 ° C. Fem G-matrix Fourier transformation (GFT) NMR eksperimenter [22], [23] og en samtidig 3D

15N /

13C

alifatiske /

13C

aromatisk-løst NOESY [24] [25] spektrum (blandetid 60 ms, måling tid: 48 timer) blev erhvervet på et Varian INOVA 750 MHz spektrometer udstyret med en konventionel sonde. 2D konstant-tid [

13C,

1 H] -HSQC spektre (18 timer) blev registreret for de 5% biosyntetisk rettet fraktioneret

13C-mærket prøve på en Varian INOVA 600 MHz spektrometer forsynet med en kryogen sonde som det blev beskrevet [21], [26]. Spectra blev bearbejdet og analyseret ved hjælp af programmer NMRPipe [27] og XEASY [28].

Sequence specifik rygrad (H

N, H

α, N, C

α) og H

β /C

Ø resonans tildelinger blev opnået ved hjælp af (4,3) D HNNC

αβC

α (63 timer) /(4,3) DC

αβC

α (CO) NHN (62 timer), og (4,3) DH

αβC

αβ (CO) NHN (69 timer) [23] sammen med programmet AUTOASSIGN [29]. Mere perifere side kæde kemiske skift blev tildelt med alifatiske (4,3) D Haagerkonferencen (87 timer) [23] og 3D

15N /

13C

alifatiske /

13C

aromatisk-løst [

1 H,

1 H] -NOESY [24], [25]. Samlet set blev opgaver opnået for 96% af rygrad og

1 H

β /

13C

Ø resonanser, og for 93% af de side chain resonanser som er overdrages med NMR eksperimenter, der er anført ovenfor (undtagen N-terminal NH

3

+, Pro

15N,

13C ‘foregående prolylrester, Lys NH

3

+, Arg NH

2, OH, sidekæde

13C ‘og aromatiske

13C

γ). Endvidere 100% /100% for Val og Leu isopropyl-dele med ikke-degenererede proton kemiske skift var stereo-overdraget (tabel 1). Kemiske skift blev deponeret i BioMagResBank [30] (accession kode 19654).

1 H-

1 H øvre distance limit begrænsninger for struktur beregninger blev opnået fra NOESY (tabel 1). Desuden blev backbone toplansvinkel begrænsninger afledt fra kemiske skift ved hjælp af programmet TALOS [31] for rester placeret i veldefinerede sekundære strukturelementer (tabel 1). Den programmer Cyana [32], [33] og AUTOSTRUCTURE [34] blev anvendt parallelt til at tildele langtrækkende NOE [24]. De endelige struktur beregninger blev udført ved hjælp Cyana efterfulgt af eksplicit vandbad raffinement ved hjælp af programmet CNS [35].

Tak

Vi takker Dr. Janet Cheetham for det værdifulde forslag til at overveje C286S mutant af hMcl-1 (171-327) til NMR struktur beslutsomhed.