PLoS ONE: Den Proton-Sensing G-protein koblet receptor GPR4 Fremmer angiogenese i hoved- og halscancer

Abstrakt

Planocellulært karcinom i hoved og hals (SCCHN) er en aggressiv sygdom med dårlig overlevelse og er den sjette mest almindelige kræftform i verden. Gastroøsofageal refluks er en almindelig begivenhed i SCCHN patienter. GPR4 er en proton-sensing G-protein-koblet receptor, som kan aktiveres ved acidose. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, GPR4 i syre eksponering og tumorangiogenese i SCCHN. I denne undersøgelse har vi bekræftet, at overekspression GPR4 i SCCHN-celler kunne øge ekspression og sekretion af IL6, IL8 og VEGFA ved pH 5,9. Denne virkning kunne inhiberes af SB203580 (a p38-inhibitor). Western blot-analyse viste, at phosphorylering af p38 steg i GPR4 inficerede celler ved pH 5,9, som kunne inhiberes af SB203580. I rør-dannelse assay blev HMEC-1-celler inkuberet med konditioneret medium (CM, pH 5,9, 6,5, 7,4) afledt af kontrol og GPR4 inficerede SCCHN-celler. Tube længde blev øget betydeligt i HMEC-1 celler inkuberet med CM fra GPR4 inficerede celler sammenlignet med kontrol celler på pH5.9, der er angivet den pro-angiogene effekt af GPR4 i sur pH. De neutraliserende antistoffer af IL6, IL8 og VEGFA kunne inhibere rør dannelsen af ​​HMEC-1-celler. In vivo, blev virkningen af ​​GPR4 på angiogenese undersøgt med kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) model. Kontrol og GPR4 inficerede SCCHN-celler blev podet på den øvre overflade CAM (n = 5 i hver gruppe) og 5 pi DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) blev tilsat til overfladen af ​​cellen hver 24 timer. Fire dage senere blev den øvre CAM høstet og forholdet mellem det vaskulære område til CAM området blev kvantificeret ved anvendelse af Image-Pro Plus 6.0 software. GPR4 inficerede celler kunne rekruttere mere vaskulære end kontrol celler ved pH5.9. Afslutningsvis vi foreslog, at GPR4 inducerer angiogenese via GPR4-induceret p38-medieret IL6, IL8 og VEGFA sekretion ved sur ekstracellulære pH-værdi i SCCHN

Henvisning:. Jing Z, Xu H, Chen X, Zhong Q, Huang J, Zhang Y, et al. (2016) Den Proton-Sensing G-protein koblet receptor GPR4 Fremmer angiogenese i hoved- og halscancer. PLoS ONE 11 (4): e0152789. doi: 10,1371 /journal.pone.0152789

Redaktør: Ramani Ramchandran, Medical College of Wisconsin, USA

Modtaget: September 29, 2015; Accepteret: 18 Mar 2016; Udgivet: 14 April, 2016

Copyright: © 2016 Jing et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af bevilling fra Yangfan Program for Beijing Municipal Administration af hospitaler (nr XMLX201507.). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Planocellulært karcinom i hoved og hals (SCCHN) er en aggressiv sygdom med dårlig overlevelse og er den sjette mest almindelige kræftform i verden [1]. Den globale hyppigheden ca. 600.000 tilfælde hvert år [2]. Rygning og alkoholmisbrug er væsentlige risikofaktorer for SCCHN. Gastroøsofageal refluks er en almindelig hændelse i SCCHN patienter [3], hvilket indikerer, at det er forbundet med en forhøjet risiko for larynx cancer og svælg kræft [4]. Fireogtyve-timers dobbelt-sonde pH overvågningen viser pH i den øvre esophageal sphincter som værende under 4 [5]. Syre eksponering kan føre til forskellige otolaryngologiske lidelser, såsom kronisk laryngitis, vokal knuder, Reinke ødem, kontakt ulcus og granuloma, larynx stenose, og paroxysmal laryngospasme [6]. I esophageal planocellulært karcinom, kontinuerlig syre eksponering fremmer vaskulær udvikling [7], som spiller en afgørende rolle under tumor initiering og malign progression [8].

proton-sensing G-protein-koblede receptorer (GPCR), herunder GPR4, GPR65 (TDAG8), GPR68 (OGR1), og GPR132 (G2A) er for nylig blevet identificeret som nye pH-sensorer, der er foreslået til at blive aktiveret af sure ekstracellulære pH [9]. Det er blevet påvist, at GPR4 overudtrykkes i forskellige typer af maligniteter [10, 11]. I epitelial ovariecancer, er GPR4 udtryk tæthed ledsaget af en højere mikrovaskulære densitet (MVD) [10], og dette korreleret med status af lymfeknude metastaser og klinisk fase. Dette viser, at GPR4 kan være involveret i cancer-relaterede angiogenese. I SCCHN, sammenhængen mellem syre eksponering, tumor angiogenese og GPR4 er ikke blevet godt undersøgt. I en tidligere undersøgelse, vi bekræftet, at GPR4 kunne aktivere AP1 og ERK signalveje ved sur ekstracellulære pH [12]. AP1 er en af ​​de regulatoriske steder af IL6, IL8 og VEGFA [13-15]. GPR4 som en pH-sensor er positivt korreleret med højere mikrovaskulær densitet, så vi antager, at det vil kunne øge ekspressionen af ​​IL6, IL8 og VEGFA og inducere angiogenese ved sur ekstracellulære pH. I denne undersøgelse, vi foreslog, at GPR4 induceret angiogenese via GPR4-induceret IL6, IL8 og VEGFA sekretion ved sur ekstracellulære pH-værdi i SCCHN.

Materialer og metoder

Etik Statement

Etisk tilladelse til denne undersøgelse blev ydet af Research Ethics Committee of Beijing Tongren Hospital (Beijing, Kina).

Cell kultur

SCCHN cellelinjer FaDu celler og Tca8113 celler, humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) blev anvendt i undersøgelsen. FaDu celler blev opnået fra State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University [16]. Tca8113 celler blev opnået fra Kina Infrastruktur af cellelinie Resources. HMEC-1-celler, opnået fra Thermo Fisher, blev genereret ved Ades et al [17]. Alle celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Hyclone, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1% penicillin /streptomycin. Alle celler blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

Fremstilling af rekombinant adenovirus Carrying GPR4 Gene

Det rekombinante adenovirus, der udtrykker GPR4 (Ad-GPR4) blev frembragt ifølge fremgangsmåderne tidligere [18] beskrevne. Kort fortalt GPR4 blev sub-klonet ind adenovirusvektoren pAdxsi (Sinogenomax, Kina). Det rekombinante adenovirale konstruktion blev transficeret ind i emballagen HEK293-celler og derefter blev disse celler fryse-optøet adskillige gange for at frigive intracellulære virale partikler. De virale titere blev testet i HEK293-celler, og antallet af plaque-dannende enheder (pfu) blev opnået ved anvendelse af et plakdannelse assay.

celleinfektion og Acid Stimulation

FaDu celler og Tca8113 celler podet i seks-brønds plader, og nåede 80% konfluens ved følgende dag. Derefter blev cellerne inficeret med Ad-GPR4 eller Ad-nul (en tom rekombinant adenovirus som kontrol). Atten timer senere blev syre stimulation udført som tidligere [12] beskrevne. Kort fortalt, 18h efter infektion, dyrkningsmedierne blev erstattet af serumfrit DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5 og 7,4). Cellerne blev høstet efter stimulering i 6 timer. SB203580 (a p38-inhibitor, 1 uM) blev anvendt til at bestemme, om p38 medieret sekretion fra pro-angiogene cytokiner. For at udføre p38-inhibering, GPR4 inficerede celler blev serum-udsultet i 4 timer og behandlet med 1 pM SB203580 i 1 time før syre stimulering og derefter dyrkningsmedierne blev erstattet af serumfrit DMEM /F12 (pH 5,9). Cellerne blev høstet 6h senere.

medium

For at forberede konditioneret medium (CM) de FaDu celler og Tca8113 celler blev inficeret med Ad-GPR4 eller Ad-nul i 18 timer, kulturen medier blev erstattet af serumfrit DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5 og 7,4), og celler uden infektion fungerede som kontrol. Seks timer senere blev mediet centrifugeret (4 ° C, 1500 rpm), og supernatanten blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse.

Real Time PCR (qPCR) og Semikvantitativ PCR

Total RNA’er af FaDu og Tca8113 celler og SCCHN væv blev isoleret under anvendelse TRlzol Reagent (Life Technologies, USA). Revers transkription blev udført under anvendelse af en FastQuant RT Kit (TIANGEN, Kina). qPCR blev udført som anbefalet af producenten. Følgende primere blev anvendt til qPCR: IL6 sense 5′-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3 ‘, antisense 5′-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3′; IL8 sense 5’-CCTGATTTCTGCAGCTCTGTGT-3 ‘, antisense 5′-GGTGGAAAGGTTTGGAGTATGTCT-3′; VEGFA sense 5’-GCCCACTGAGGAGTCCAACATC-3 ‘, antisense 5′-CAAGGCCCACAGGGATTTTCT-3’. Primerne til PCR af GPR4 var som følger: sense 5′-AACCTCTATCGGGTGTTCGTG-3 ‘, antisense 5′-TTGGCTGTGCTGTTCCTCTTGG-3’. GAPDH blev amplificeret som en intern standard. Den relative RNA-niveau i hver prøve blev bestemt ved de 2 (-delta Delta C (T)) metode.

enzymmaerket Assay (ELISA)

De kontrol- celler og GPR4 inficerede celler blev stimuleret i 6 timer under anvendelse af serum-frit DMEM /F12 (pH 5,9). Derefter blev mediet centrifugeret (4 ° C, 1500 rpm), og supernatanten blev opsamlet. Koncentrationen af ​​IL6, IL8 og VEGFA i dyrkningsmediet blev kvantificeret med et ELISA-kit ifølge producentens instruktioner (ABCAM).

Western blot-analyse Salg

Celler blev lyseret i RIPA-puffer ( Beyotime, Kina) suppleret med en 1 mM PMSF. I alt 100 ug proteiner blev elektroforesebehandlet på 10% SDS-PAGE-geler, og elektrooverført på nitrocellulosemembraner (Invitrogen, USA). Western-blot blev udført som tidligere beskrevet [12]. GPR4 antistof blev købt fra LifeSpan BioSciences (LifeSpan, USA). Phospho-p38 (p-p38), total p38 (p38), phospho-VEGF receptor 2 (Tyr1175) og VEGF receptor 2-antistof blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Cell Signaling, USA). GAPDH (Santa Cruz, CA) blev anvendt som et lysat loading kontrol.

Tube Formation Assay

For at bekræfte virkningen af ​​GPR4 på dannelse rør i HMEC-1, udførte vi en angiogenese assay på vækstfaktor-reduceret Matrigel (BD Biosciences). En dag før dannelse rør assay blev HMEC-1-celler podet på en 10-cm disk. Efter coating af 96-brønds plade med Matrigel at følge producentens instruktioner, blev HMEC-1-celler høstet og resuspenderet ved 1 x 10

5 /mL ved anvendelse af CM suppleret med 2% FBS. Derefter 0,1 ml cellesuspension blev tilsat til 96-brønds plade. VEGFA (1 ng /ml) blev anvendt som en positiv kontrol og DMEM tjente som en negativ kontrol. Pladen blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 12 h tillade dannelse af kapillære-lignende strukturer. Billeder blev taget ved hjælp af et lysmikroskop og røret længde (pixels) blev talt under anvendelse af Image-Pro Plus 6.0 software.

kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) Model

Fertiliserede SPF (SPF) æg blev opnået fra Beijing Laboratory Animal Research center. Æggene blev klækket i en befugtet inkubator ved 37,0 ° C med 60% fugtighed. På dag 10 blev store blodkar og sæk mærket på ægget ved hjælp Cold Light Fountain (STORZ, Tyskland). Efter desinfektion ved hjælp af 75% alkohol, blev et rundt vindue åbnes på toppen af ​​æggeskallen og fastholde den ydre æggeskal membran. En lokalisere hul blev boret på placeringen af ​​luftsækken. Derefter 20 pi normal saltopløsning blev sat til æggeskallen membran. Æggeskallen membran blev punkteret under anvendelse af en fin nål og den lille lokalisere hullet i luftsækken blev støvsuget under anvendelse af en gummi pipette pære, således at den normalt saltvand adskilt den ydre æggeskal membran fra CAM. Den æggeskal membran blev skrællet af uden at forstyrre CAM. Vinduet blev dækket med parafilm og ægget blev anbragt i inkubatoren i en anden dag. Derefter 1 x 10

6control og GPR4 inficerede celler blev podet på den øvre overflade CAM (n = 5 i hver gruppe). Den firkantede vindue på ægget blev forseglet. Derefter blev 5 pi DMEM /F12 (pH 5,9, 6,5, 7,4) blev tilsat til overfladen af ​​cellen hver 24 timer. Fire dage senere blev den øvre CAM høstet og forholdet mellem det vaskulære område til CAM området blev kvantificeret ved anvendelse af Image-Pro Plus 6.0 software.

Bioinformatik

Bioinformatik metode blev anvendt som Li [ ,,,0],19] beskrevet, kort, array-data vedrørende kræft fra Affymetrixhuman genom U133 plus 2,0 platform blev downloades fra GEO-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), og udtrykkes forskelligt gener i tumorer blev analyseret ved anvendelse TumourProfile database (https://tumour.bjmu.edu.cn/, upubliceret) som Wang et al tidligere beskrevne databehandling og microarray analysemetoder [20, 21]. Udtrykket profil GPR4 i en række forskellige kræftformer og den tilsvarende kontrol (normal eller ikke-tumor) væv blev søgt i denne database, og ekspressionsniveauerne var repræsenteret gennemsnitlige rang scorer (ARS).

Immunhistokemi ( IHC)

Paraffin-indlejrede eksemplarer af larynx eller hypopharyngeal pladecellekræft prøver kombineret med peri-karcinom normale vævsprøver blev opnået fra hoved og hals tumor eksemplar bank af Beijing Tongren Hospital [12]. Paraffin væv objektglas blev afvokset, rehydreret og anbragt i 10 mmol /l citratbuffer (pH 6,0) og opvarmet to gange i en mikrobølgeovn i 5 min hver. Objektglas blev inkuberet med 3% H2O2 i 10 minutter, vasket med PBS, blokeret med 10% normalt gedeserum i 30 minutter, og derefter inkuberet med anti-GPR4 (fortyndet 1: 100; slutkoncentration, 2 ug /ml, LifeSpan, USA ) eller normalt kanin IgG som kontrol ved 4 ° C natten over. Efter vask blev objektglassene farvet med den katalyserede underskrevet forstærkersystem kit (DAKO kode k5007) og billeder blev fotograferet med et Olympus IX70 mikroskop. Semikvantitativ udtryk for GPR4 blev beregnet ved hjælp af Image-Pro Plus 6.0 software.

Dataanalyse

bioinformatik analyse af forskellene i GPR4 udtrykket mellem kræft og kontrol væv blev evalueret ved hjælp af Wilcoxon rank- sumtest i R (https://www.r-project.org/) software miljø. Bonferroni korrektion for R funktionen “p.adjust” blev brugt til at justere P-værdier. De eksperimentelle data blev analyseret under anvendelse af Students t-test med SPSS19.0 software. En p-værdi 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

GPR4 Stimulerer Pro-angiogenetisk cytokinsecernering ved sur Ekstracellulær pH ​​

For at undersøge om GPR4 kunne fremkalde. ekspressionen af ​​pro-angiogene cytokiner ved sur ekstracellulære pH, detekteres vi ekspressionen af ​​IL6, IL8 og VEGFA ved forskellige pH-værdier (pH 7,4, 6,5 og 5.9). Den overekspression af GPR4 i GPR4 inficerede celler blev valideret af qPCR og western blot (Fig 1A). De mRNA niveauer af IL6, IL8 og VEGFA i Ad-GPR4 celler steg statistisk signifikant sammenlignet med de Ad-nul celler kun ved pH 5,9 (Fig 1B). Sammenlignet med kontrollerne, der var 67.8-, 118- og 12,5 gange induktion for IL6, IL8 og VEGFA henholdsvis i Ad-GPR4 celler. Dette indikerede, at sure ekstracellulære pH forbedret pro-angiogen cytokinekspression via GPR4, som blev yderligere bekræftet på proteinniveau. Koncentrationerne af IL6, IL8 og VEGFA blev øget betydeligt i supernatanten af ​​GPR4 overudtrykte celler sammenlignet med kontrollen cellerne ved pH 5,9 (Fig 1C). Inhibitoren, SB203580, kan reducere ekspression og sekretion af IL6, IL8 og VEGFA (fig 2A og 2B), hvilket antyder, at p38 kan være involveret i cytokininduktion af GPR4. Western blot blev udført for at undersøge om GPR4 kunne øge p38 phosphorylering ved forskellige pH. Phosphorylering af p38 steg i GPR4 overudtrykte celler ved pH 5,9 (Fig 2C), som kunne inhiberes af SB203580 (Fig 2D). Vores resultater var korrespondent med at i SCCHN, p38 er konstitutivt aktiveret og fører til øget udskillelse af cytokiner IL6 og IL8 [22].

Total RNA og protein af Ad-GPR4-FaDu celler, Ad-null- FaDu celler blev isoleret efter sur stimulering i 6 timer. qPCR og western blot blev udført. (A) Overekspression af GPR4 i Ad-GPR4-FaDu celler comfirmed af qPCR og western blot. (B) Udtrykket af IL6, IL8 og VEGFA steget betydeligt i GPR4 inficerede celler ved pH 5,9. (C) Supernatanterne af cellerne blev opsamlet, og koncentrationen af ​​IL6, IL8 og VEGFA blev påvist ved ELISA. Lignende resultater blev observeret i Tca8113 celler (S1 Fig).

(A) I Ad-GPR4-FaDu celler, SB203580 reducerede udtryk for IL6, IL8 og VEGFA ved pH 5,9. (B) SB203580 reduceret sekretion af IL6, IL8 og VEGFA. (C) GPR4 øget p38 phosphorylering på pH5.9. (D) SB203580 inhiberer phosphorylering af p38 i GPR4 overudtrykte celler. Lignende resultater blev observeret i Tca8113 celler (S2 Fig).

GPR4 Fremmer angiogenese in vitro

For at teste om GPR4 kunne fremme dannelse rør, HMEC-1 celler blev inkuberet med CM afledt fra kontrolceller og GPR4 overudtrykte celler. Længderne af rør (pile) blev øget betydeligt i HMEC-1 celler inkuberet med CM fra GPR4 inficerede celler sammenlignet med kontrol celler ved pH 5,9 (Fig 3A). Dette indikerede, at overekspression af GPR4 i SCCHN kunne inducere angiogenese in vitro ved sur pH. I SCCHN, er angiogenese udløst af IL-8, IL-6 og VEGF [23, 24]. For at teste hvorvidt virkningen af ​​GPR4-induceret angiogenese blev direkte medieret af IL6, IL8 og VEGFA sekretion, monoklonale neutraliserende antistoffer (R datasættet deponeret i Cancer Genome Atlas (TCGA) fra i alt 72 patienter er blevet indsamlet og anvendt til analyse [25].

Vi samlet 12 SCCHN prøver (tabel 2) og udføres RT-PCR (fig 5A og 5B) og immunhistokemiske (IHC) farvning (fig 5C og 5D). Alle patienterne led af gastroøsofageal refluks. Som vist i figur 5, blev GPR4 amplificeret i 9/12 prøver og opreguleret i tumorvæv (figur 5A) sammenlignet med de peri-tumor normale væv (Fig 5B). Den GPR4 protein udtrykt ved højere niveauer (røde pile) i tumorcellerne sammenlignet med de epiteliale celler af peri-tumor normale væv. Lignende resultater blev observeret i både larynx og hypopharyngeal kræftformer.

(A) RT-PCR af GPR4 i kræft væv. (B) RT-PCR af GPR4 i peri-kræft normale væv. GAPDH blev anvendt som en intern standard. (C) Repræsentant billede af IHC af moderat differentieret hypopharyngeal kræft. (D) Peri-kræft normalt væv fra den samme patient som C. (E) Integreret optisk densitet (IOD) af positivt udtryk celler (pile) blev beregnet ved anvendelse Image-Pro Plus 6.0 software. I alt blev 12 tilfælde af SCCHN inkluderet. Niveauet af immunreaktivitet blev gradueret ved at beregne den integrerede optiske densitet (IOD) af positive udtryk celler.

Diskussion

I denne undersøgelse har vi foreslået, at, når de udsættes til et surt miljø, kunne GPR4, en af ​​proton-sensing GPCR’er, inducerer angiogenese via pro-angiogen cytokinsekretion i SCCHN. Cytokinerne inkluderet IL6, IL8 og VEGFA, og dette blev bekræftet ved qPCR og ELISA. Den pro-angiogene effekt af GPR4 blev observeret ved dannelse rør assay og CAM model.

Angiogenese er et af kendetegnene for kræft [26]. Tumorer kan ikke vokse ud over en kritisk størrelse eller metastaserer til et andet organ uden blodkar [27], så de skal rekruttere nye blodkar ved angiogenese. Den “angiogene omskifter” afbalanceres af pro-angiogeniske og anti-angiogene molekyler [27]. En af de signaler, der udløser denne kontakt er lav pH. I humane melanomceller, surt pH øger ekspressionen af ​​de proangiogene faktorer VEGFA og IL8 [28]. GPR4 overvejende fungerer som en proton-sensor og udtrykkes endogene i HMEC-1 og HUVEC. Ekstracellulær acidose kan aktivere GPR4 og føre til cAMP-produktion [29]. Hyperkapni acidose kan også aktivere GPR4 at stimulere HUVEC adhæsionsmolekyleekspression og klæbeevne [30]. I en anden undersøgelse blev det påvist, at GPR4 spillede afgørende roller i vækst, migration og dannelse røret ved endotelcelle, men pH-ændringer kunne ikke regulere cAMP-produktion i HMEC-1 og HUVEC [31]. I HUVEC, acidose aktiverer GPR4 og øger ekspressionen af ​​IL1, IL2, IL6 og IL8 [32]. GPR4, som pH-sensor, er fuldt aktiveret ved sur pH 6,8 og delvist aktiveres i det fysiologiske område (pH 7,4-6,8) [33, 34]. Gastroøsofageal refluks er en almindelig begivenhed i hoved og hals kræftpatienter [3], hvilket betyder, at slimhinden og carcinoma ofte er udsat for lavt pH. Forholdet mellem lav pH og tumorangiogenese i SCCHN er ikke blevet godt undersøgt. I denne undersøgelse foreslog vi, at i Ad-nul-FaDu og Ad-null-Tca8113 celler, kunne lave pH ikke øge ekspressionen af ​​IL6, IL8 og VEGFA. I Ad-GPR4 celler, øget ekspression af IL6, IL8 og VEGFA væsentligt i forhold til kontrol ved pH 5,9, men ikke ved pH 6,8 og pH 7,4, hvilket kan indikere, at GPR4 er fuldt aktiveret ved pH 5,9 i SCCHN og dette er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [12].

røret dannelse assay og CAM model verificeret pro-angiogene effekt af GPR4. CM afledt fra Ad-GPR4-FaDu celler induceret længere rør på HMEC-1-celler og mere vaskulær densitet i CAM end i de andre grupper ved pH 5,9. De neutraliserende antistoffer af IL6, IL8 og VEGFA reducerede rørlængder af HMEC-1-celler, hvilket indikerer, at GPR4 induceret angiogenese via IL6, IL8 og VEGF-sekretion. VEGFA og IL6 anerkendes som de vigtigste pro-angiogene molekyler i SCCHN og har været forbundet med sygdom aggressivitet og dårlig patient resultat [35-40]. IL8, et slutprodukt af VEGF-vejen, blev også observeret i høje niveauer i SCCHN [40]. På grund af den vigtige rolle, som angiogenese i tumorudvikling, har antiangiogene midler blevet udviklet. I FaDu SCCHN xenografter, langvarig administration af bevacizumab, en vaskulær endotel vækstfaktor antistof, effektivt moduleret kemoterapeutiske effekt [41]. I fase II kliniske forsøg i SCCHN patienter, bevacizumab plus cetuximab eller kemoterapi viste opmuntrende effektresultater [42, 43]. Overekspression af IL8 førte til resistens over for bevacizumab i SCCHN, så co-målretning af VEGF og IL8 kan hjælpe med at overvinde modstand og forbedre terapeutisk effekt.

Antacida medicin, herunder histamin 2-receptorantagonist (H2RA) og protonpumpehæmmere (PPI ) altid anvendes i behandlingen af ​​SCCHN-patienter. Nogle undersøgelser har vist, at brugen af ​​syreneutraliserende medicin kan have betydelige terapeutiske fordele for SCCHN patienter [44, 45]. En af de mekanismer kan være, fordi syreneutraliserende medicin kan modulere adhæsion af tumorceller til endotel [44]. I den foreliggende undersøgelse har vi vist, at GPR4 fremmer pro-angiogene faktorer sekretion ved sur pH. Disse resultater indikerer, at inhibering af GPR4 eller sur pH kan føre til inhibering af tumorangiogenese. Så vi spekulere, at en anden mekanisme, der sandsynligvis er, at syreneutraliserende medicin kan hæmme pro-angiogene faktorer sekretion ved at forøge pH og derefter reducere angiogenese, der spiller en kritisk rolle under tumorprogression. Tidligere viste vi, at sure ekstracellulære pH forbedrer matrixmetalloproteinase (MMP) ekspression via ERK signalvejen i GPR4 overudtrykte celler. I denne undersøgelse viste vi, at GPR4 kunne øge phosphorylering af p38 ved pH 5,9, som kunne inhiberes af SB203580. SB203580 kan reducere ekspressionen af ​​pro-angiogene cytokiner, som kan indebære p38 spiller en vigtig rolle i mediering af ekspressionen af ​​cytokiner.

Som konklusion foreslog vi at GPR4 inducerer angiogenese via GPR4-induceret p38-medieret IL6, IL8 og VEGFA sekretion ved sur ekstracellulære pH i SCCHN.

Støtte Information

S1 fig. GPR4 stimulerer cytokinsekretion ved sur pH i Tca8113 celler.

Totalt RNA og protein af Ad-GPR4-Tca8113 celler blev Ad-null-Tca8113 celler isoleret efter syre stimulering i 6 timer. qPCR og western blot blev udført. (A) Overekspression af GPR4 i Ad-GPR4-Tca8113 celler comfirmed af qPCR og western blot. (B) Udtrykket af IL6, IL8 og VEGFA steget betydeligt i GPR4 inficerede celler ved pH 5,9. (C) Supernatanterne af cellerne blev opsamlet, og koncentrationen af ​​IL6, IL8 og VEGFA blev påvist ved ELISA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s001

(TIF)

S2 Fig. SB203580 reducerer cytokin sekretion ved at hæmme p38 fosforylering i Tca8113 celler. Hotel (A) I Ad-GPR4-Tca8113 celler, SB203580 reducerede udtryk for IL6, IL8 og VEGFA ved pH 5,9. (B) SB203580 reduceret sekretion af IL6, IL8 og VEGFA. (C) GPR4 øget p38 phosphorylering på pH5.9. (D) SB203580 hæmme fosforylering af p38 i GPR4 inficerede celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s002

(TIF)

S3 Fig. De neutraliserende antistof virkninger kunne vendes ved tilsætning af det overskydende beløb af IL6, IL8 eller VEGFA i rør dannelse assay

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s003

(TIF)

S4 Fig . Tube dannelse assay af Tca8113 celler.

(A) Røret længde (pile) af HMEC-1 celler blev øget i CM afledt fra Ad-GPR4-Tca8113 celler sammenlignet med Ad-null- Tca8113 celler ved pH 5,9. (B) De neutraliserende antistoffer ifølge IL6, IL8 og VEGFA inhiberede rør-dannelse i HMEC-1-celler. Isotype IgG antistof blev anvendt som en kontrol i neutraliserende antistof test

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s004

(TIF)

S5 Fig. De Ad-GPR4-Tca8113 celler rekrutteret mere vaskulære end Ad-nul-Tca8113 celler kun ved pH 5,9 i CAM model

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s005

(TIF)

S1 Fil . Excel-fil, der indeholder støtte informationsdata med denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0152789.s006

(XLSX)

Tak

Vi takker Dr. Pingzhang Wang ( Institut for Immunologi, Institut for Basic Medical Sciences, Peking University Health Science center, Peking University center for menneskelige sygdomme Genomics) for bioinformatik analyse

.