PLoS ONE: oxidativ stress Modstand i metastatisk prostatacancer: Fornyelse af Self-Eating

Abstrakt

Resistent kræft fænotype er en afgørende hindring i den vellykkede terapi for prostatakræft. Det primære mål med vores undersøgelse var at udforske resistensmekanismer i den avancerede type prostata kræftceller (PC-3) og for at præcisere den rolle autophagy i disse processer. Vi udførte tidsforskudt eksperimentet (48 timer) med ROS generere plumbagin ved hjælp af multimodal holografisk mikroskop. Endvidere udførte vi også flowcytometrisk analyse og QRT-PCR-genekspression analyse på 12 udvalgte tidspunkter. TEM og konfokal mikroskopi blev brugt til at kontrollere resultaterne. Vi fandt ud af, at autofagi (nemlig mitophagy) er en vigtig resistensmekanisme. De store ROS producerende mitokondrier blev coatet ved en autophagic membran afledt af endoplasmatisk reticulum og nedbrudt. Ifølge vores resultater, kan øge ROS modstand også ledsaget af øget gennemsnitlig cellestørrelse og polyploidization, som synes at være nøglen modstand mekanisme, når forbundet med en flugt fra ældning. Mange forskellige typer af celle-celle-interaktioner blev registreret herunder entosis, vesikulær overførsel, spisning af døde eller døende celler, og engulfment og kannibalisme af levende celler. Entosis blev afsløret som en mulig mekanisme for polyploidization og gjorde det muligt for overlevelsen af ​​kræftceller lang sigt. Signifikant reduceret cellemotilitet blev fundet efter plumbagin behandling. Vi fandt også en omfattende induktion af pluripotens gener udtryk (

NANOG

,

SOX2

, og

POU5F1

) på tidspunktet-punkt på 20 timer. Vi formoder, at overekspression af pluripotens gener i den del af prostata tumor celle population eksponeret for ROS fører til højere udviklingsmæssige plasticitet og evne til hurtigere at reagere på ændringer i det ekstracellulære miljø, der i sidste ende kan føre til en ændring af celle skæbne.

Henvisning: Balvan J, Gumulec J, Raudenska M, Krizova A, Stepka P, Babula P, et al. (2015) Oxidative Stress Modstand i metastatisk prostatacancer: Fornyelse af Self-Eating. PLoS ONE 10 (12): e0145016. doi: 10,1371 /journal.pone.0145016

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: September 15, 2015; Accepteret: November 25, 2015; Udgivet: 15 December, 2015

Copyright: © 2015 Balvan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Masaryk Universitet til junior forsker (Michal Masarik) og af projektet MUNI /A /1549/2014 og Muni /A /1326/2014 med støtte fra Specific University Research Grant, som fastsat af Ministeriet for uddannelse, ungdom og sport, den Tjekkiske Republik i år 2015. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, dataindsamling og analyse, at afgørelsen offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Den kommercielle selskab (TESCAN) ydet støtte i form af løn for forfatteren Aneta Krizova, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Specifikke rolle denne forfatter artikuleres i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Samarbejdet med et kommercielt selskab (TESCAN) ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om deling af data og materialer .

Introduktion

Prostatakræft (PC) er en af ​​de hyppigst diagnosticerede kræftformer hos mænd. De fleste af prostatakræft er oprindeligt lydhøre over for androgen deprivation terapi, men senere ville dukke en aggressiv, androgen-uafhængig fænotype resistente over for konventionelle behandlinger. Denne avancerede form for prostatakræft let metastaserer. Hematogeneous metastaser er sædvanligvis til stede i 35% af patienter med prostatacancer med den hyppigste lokalisering i knoglerne (90%). Den udbredte studerede model for androgen-uafhængig, avancerede, metastaser-producerende prostatakræft er PC-3-cellelinje etableret fra lumbal metastase af en 62 år gammel kaukasisk mand med grad 4 af prostata adenocarcinom. PC-3-celler er hemizygote for 17p kromosom, og deres eneste kopi af

p53

genet har en stopkodon i position 169 [1]. Som et resultat, PC-3-celler ikke udtrykker funktionelt p53-protein, hvilket gør det temmelig resistent over for p53-medieret apoptose [2]. Endvidere har vi valgte PC-3-cellelinjen og ikke DU145, fordi DU145 prostatacancerceller udtrykker PTEN, som ikke udtrykkes af PC-3-celler [3, 4]. Flere funktionelle studier understøtter rollen som PTEN som en kritisk tumorsuppressor i prostatacancer [5-7].

I vores tidligere undersøgelse har vi påvist, at PC-3-cellelinjen udviste højere resistens over for cisplatin-induceret apoptose og ingen faldende andel af G2 /M-fraktion (4N DNA-indhold) tydelig i 22Rv1 celler [8]. Cisplatin er primært betragtes som en DNA-beskadigende middel, der danner forskellige typer hårdt genoprettes addukter med cellulært DNA [9]. Bortset fra DNA-skader, cisplatin inducerer også reaktive oxygenarter (ROS) [10]. På grund af det faktum, har vi fokuseret på en anden ROS-producerende reagens, plumbagin [11], som ikke danner DNA-addukter, for at vurdere vigtigheden af ​​celledød modulation og beskæftiger sig med ROS til PC-3 resistens. Plumbagin (5-hydroxy-2-methyl-1,4-naphthoquinon) forekommer naturligt i lægeurt

Plumbago zeylanica L

. og tilhører naphthoquinoner. Naphthoquinoner vise deres cytotoksiske handlinger gennem to måder: som pro-oxidanter, reducere ilt til reaktive ilt arter; og som elektrofiler, der danner kovalente bindinger med væv nukleofiler [12]. Endvidere plumbagin blev også vist at undertrykke aktiveringen af ​​nuklear faktor-KB (NF-KB) [13].

I de seneste undersøgelser blev ROS-generering i forbindelse med mitokondrierne som følge af nedsat mitokondrie proteinsyntese [ ,,,0],10]. Endvidere blev det påpeget, at celler med et underskud på funktionelle mitokondrier er mere modstandsdygtige over for celleskader af cisplatin [14]. Men Panov

et al

. fundet ud af, at prostata cancercellelinjer LNCaP, PC-3, og DU145 indeholdt 2 til 4 gange mere mitokondrier per gram celler end normale prostata-epitelceller. Respiratoriske aktiviteter af mitokondrier isoleret fra normale prostata-epitelceller var også 5-20 gange lavere end for mitokondrier isoleret fra prostatacancerceller [15]. Derfor formoder vi, at der findes nogle beskyttelsesmekanismer mod ROS i PC-3 celler. Mange celle skader forårsaget af ROS kunne være subletale (især hvis de undersøgte celler har forstyrret apoptose-udløser mekanismer) og resultere i en ændret stabil tilstand, hvor de beskadigede celler er i stand til at overleve. Selv hvis en beskadiget celle drives til oncosis (oncosis er en pre-dødbringende fase, der følger en alvorlig cellebeskadigelse) eller ældning, er der sandsynligvis nogle mekanismer til at ændre denne proces [16-18], især hvis cellen er i stand til at få slippe af skadelige faktorer og genoprette ATP-produktion. En mulig måde at få nok energi for overlevelse kunne være autofagi [19], kannibalisme eller entosis [20, 21]. Autophagy var først betragtet som en mekanisme, der undertrykker malign transformation. stærke beviser for en dobbelt rolle autophagy blev dog opdaget [22]. I begyndelsen af ​​tumorer, kunne autofagi være virkelig en potent tumorsuppressor, fordi det kan forsikre organel og protein kvalitetskontrol og forebygge genomisk ustabilitet og aneuploidi organel [23]. Men der er betydelige beviser, at autophagy har en kræft-fremmende rolle i etablerede tumorer [24].

En af de væsentlige histopatologiske træk af humane solide tumorer er forekomsten af ​​store atypiske kræftceller med multiplicated nukleare DNA, er kendt som polyploide giant cancerceller (PGCCs). Øget PGCCs numre normalt vises i sene sygdom stadier og kvaliteter, eller som følge af kemoterapi [25]. Et vigtigt mål for vores undersøgelse var at undersøge mulige mekanismer for forsvar mod ROS i den avancerede type prostata kræftceller. Vi forsøgte at vurdere, hvilken rolle autofagi og dannelsen af ​​polyploide gigantiske kræftceller (PGCCs) i den avancerede type prostatacancer. Vi forsøgte også at verificere en hypotese om, at autofagi kunne være den mekanisme af resistens mod ROS snarere end mekanismen for celledød. Denne hypotese understøttes af de seneste resultater tyder på, at velkarakteriseret autofagi aktivatorer og mTOR-hæmmere (såsom rapamycin, PP242, eller resveratrol) markant forbedre hastigheden og effektiviteten af ​​puripotent stamceller generation [26].

Materialer og fremgangsmåder

kemiske og biokemiske reagenser

Hams F12-medium, føtalt bovint serum (FBS), (mycoplasma free), penicillin /streptomycin og trypsin blev indkøbt fra PAA Laboratories GmbH (Pasching, Østrig). Phosphatbufret saltvand (PBS) blev købt hos Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA, USA). Ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), blev plumbagin og andre kemikalier af ACS renhed indkøbt fra Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA), med mindre andet er angivet.

cellekulturer og dyrket celle betingelser

humant PC-3 prostatacancerceller blev anvendt i denne undersøgelse (passage 18-24). PC-3-cellelinje blev etableret fra lønklasse 4 prostataadenocarcinom fra 62 år gammel kaukasisk mandlige og stammer fra det metastatiske websted i knoglerne. PC-3-cellelinjen blev indkøbt fra HPA kultursamlinger (Salisbury, UK).

PC-3-celler blev dyrket i Hams F12-medium med 7% FBS. Mediet blev suppleret med penicillin (100 U /ml), og cellerne blev holdt ved 37 ° C i befugtet inkubator med 5% CO

2. Hypoxy /sult-resistente PC-3 blev udvalgt ved dyrkning uden adgang af ilt og uden medium erstatning for en måned.

plumbagin behandling

stamopløsning af plumbagin blev udarbejdet i dimethylsulfoxid ( DMSO) og fortyndet med mediet. Et tilsvarende volumen af ​​DMSO (slutkoncentration ≤ 0,1%) blev sat til kontrollerne. Den plumbagin behandlingen blev initialiseret efter at cellerne nåede konfluens på ~ 50%. For cytotoksicitet vurdering, en række koncentrationer 0, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, og 6 pmol /l plumbagin blev anvendt. Tidspunkter for celle høst og dermed for efterfølgende analyser var 0 timer, 40 min., 1,5, 4, 6, 8, 10, 16, 20, 24, 36 og 48 h.

Cell indhold kvantificering

Samlet indhold celle blev målt ved hjælp Casy model TT-system (Roche Applied Science, USA) og følgende protokol: først, kalibrering blev udført fra prøver af levedygtige og nekrotiske celler. For de nekrotiske celler, blev 100 pi cellesuspension og 800 pi Casy blå opløsning blandes og henstår i 5 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende 9 ml CasyTone blev tilsat. Til fremstilling af en levedygtig celle standard blev 100 pi cellesuspension blandet med 10 ml CasyTone. Alle efterfølgende målinger blev udført på 100x fortyndet 100 pi cellesuspension. Før hver måling blev baggrunden fratrukket. Alle prøver blev målt i dubletter.

Måling af cellelevedygtighed-MTT test

Suspensionen af ​​5000 celler blev tilsat til hver brønd af standard mikrotiterplader. Volumen på 200 pi blev overført til brønde 2-11. Mediet (200 pi) blev tilsat til den første og den sidste kolonne (1 og 12, kontrol). Pladerne blev inkuberet i 2 dage ved 37 ° C for at sikre cellevækst. Mediet blev fjernet fra kolonne 2 til 11. Columns 3-10 blev fyldt med 200 pi medium indeholdende en forøget koncentration af plumbagin (0-6 pmol /l). Som kontrol blev kolonne 2 og 11 fyldt med mediet uden plumbagin. Pladerne blev inkuberet i 12 og 24 timer, derefter blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket i PBS. Kolonner 1-11 blev fyldt med 200 pi medium indeholdende 50 pi MTT (5 mg /ml i PBS), inkuberet i befugtet atmosfære i 4 timer ved 37 ° C, og omviklet med aluminiumfolie. Efter inkubation blev MTT-holdige medium udskiftet med 200 pi 99,9% dimethylsulfoxid (DMSO) for at opløse MTT-formazan krystaller. Efterfølgende blev 25 pi glycinbuffer tilsat til alle brønde og absorbansen blev bestemt umiddelbart ved 570 nm (VersaMax mikropladelæser, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

cellevækst og proliferation assay under anvendelse af impedansmåling

Cell vækst blev analyseret ved hjælp af real-time-celle analyse (RTCA) systemet (xCELLigence; Roche Applied Science og ACEA Biosciences). For det første blev den optimale seeding koncentration for proliferation og cytotoksisk assay bestemmes. PC-3-celler blev podet ved en densitet på 7000 celler per brønd i E-plader 16. Efter podning det samlede antal celler i 200 pi medium til hver brønd, i E-Plate 16, fastgørelsen, proliferation og spredning af cellerne blev overvåget hvert 15. minut. Efter 24 timer blev plumbagin tilsat, og celle (Cl), som afspejler cellelevedygtighed, blev overvåget. Alle forsøg blev udført for 250h. Resultaterne udtrykkes som en celle indeks ved hjælp af producentens software (Roche Applied Science og ACEA Biosciences). Forsøgene blev foretaget i dubletter.

Flowcytometrisk analyse af celledød

Dobbelt-farvning med fluorescein isothiocyanat (FITC) /propidiumiodid (PI) blev foretaget under anvendelse af Annexin V-FLUOS-farvning kit (Roche Applied Science) ifølge producentens protokol for at bestemme procentdele af levedygtige, apoptotiske og nekrotiske celler efter udsættelse for plumbagin. Kort fortalt blev cellerne høstet ved gentagen pipettering og vasket to gange med PBS (centrifugeret ved 2000 rpm i 5 min), resuspenderet i 100 pi Annexin-V-FLUOS mærkning opløsning og inkuberet i 15 min. i mørke ved 15-25 ° C. Annexin V-FITC binding blev påvist ved flowcytometri (PARTEC GmbH, Munster) (Ex = 488 nm, Em = 533 nm, FL1 filter for annexin-V-FLUOS og FL3 filter til PI).

flowcytometrisk påvisning af autophagosomes Salg

Autophagosome dannelse i PC-3-celler blev påvist under anvendelse CYTO-ID Autophagy Detection Kit (Enzo, PA, USA) ifølge producentens instruktion. CYTO-ID grønt fluorescerende reagenser specifikt at påvise sure autophagic vakuoler dannet under autofagi. Kort fortalt blev cellerne høstet ved forsigtig gentagen pipettering, spundet ned og vasket to gange i RPMI 1640 med 5% føtalt bovint serum (FBS). Cellerne blev resuspenderet i 500 pi frisk fortyndet CYTO-ID farvning reagens og inkuberet i mørke ved 37 ° C i 30 minutter. CYTO-ID fluorescens af celler blev straks analyseret ved flowcytometri under anvendelse af strømmen cytometr (PARTEC GmbH, Munster) (Ex = 480 nm, Em = 530 nm, FL1 filter til CYTO-ID, SSC i cellulær kornethed). Procentdelen af ​​celler med CYTO-ID-farvning blev anvendt til at repræsentere dannelsen af ​​autophagosomes.

Flowcytometrisk analyse af intakte raske celler

Cellepelleten blev fremstillet som nævnt ovenfor. Cellerne blev resuspenderet i 500 pi frisk fortyndet 1 pM SYTO 16 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) farvningsopløsning og inkuberet i mørke ved 37 ° C i 45 minutter. SYTO 16 fluorescens af celler blev straks analyseret på samme instrument som nævnt ovenfor (Ex = 488 nm, Em = 518 nm, FL1 filter til SYTO 16, FSC for cellestørrelse). Procentdelen af ​​SYTO 16-positive celler blev analyseret. Data blev analyseret ved hjælp af Flagyl software (PARTEC GmbH, Münster, Tyskland).

Fluorescens mikroskopi og cellefarvning

For fluorescens mikroskopi, cellerne blev dyrket direkte på mikroskop objektglas (75×25 mm , tykkelse 1mm, Menzel Glässer, Braunschweig, Tyskland) i petriskåle i den ovenfor beskrevne dyrkning medier (se dyrket celle betingelser). Cellerne blev overført direkte på objektglassene, som blev nedsænket i dyrkning medier. Efter behandlingen blev mikroskop objektglas med et monolag af celler fjernet fra petriskålene, skyllet i dyrkningsmediet uden plumbagin tilskud og PBS-buffer og anvendes direkte til farvning og fluorescensmikroskopi.

Cellerne blev inkuberet med følgende meget specifikke fluorescerende prober: reaktive ilt arter blev visualiseret ved hjælp CellROX Deep Red reagens (life Technologies, USA, 5 uM, celle-permeant, life-celle plet med absorption /emission maksima af 644/665 nm), blev mitokondrier visualiseret hjælp MitoTracker Green FM (Life Technologies, USA, 300 nM, celle-gennemtrængende liv-celle pletten med absorption /emission maksima af 490/516 nm), og endoplasmatisk reticulum blev visualiseret ved hjælp af eR-Tracker Rød (Life Technologies, USA, 1 pM , celle-gennemtrængende, life-celle pletten med absorption /emission maksima af 587/615 nm). Efter inkubation (45 min, 37 ° C, mørke) blev cellerne vasket tre gange med PBS-buffer (0,05 M, pH 7,0) og observeret under det konfokale mikroskop (Leica TCS SP8 X, Tyskland) ved anvendelse af passende excitations- og emissionsbølgelængder.

TEM visualisering af PC-3 ultrastruktur

PC-3 celler blev forsigtigt høstet ved gentagne pipettering og spundet ned (2000 rpm, 5 min.). Kort fortalt blev cellerne fikseret med 3% glutaraldehyd i cacodylatbuffer i 2 timer og vasket tre gange i 30 minutter i 0,1 M cacodylatbuffer. Herefter blev de fast med 0,02 M Oso

4 opløst i 0,1 M cacodylatbuffer, dehydreret i alkohol, og infiltreret med acetone og No. 1 Durcuptan blandingen natten. Den følgende dag blev cellerne infiltreret med No. 2 Durcuptan blanding, indlejret og polymeriseret. Ultratynde snit (90 nm, ultramikrotom LKB, Bromma, Stockholm, Sverige) blev overført til gitre dækket med den Formvar membran (Marivac Ltd., Halifax, Canada). 2% uranylacetat og Reynolds opløsning blev anvendt til kontrast-farvning. Sektionerne blev set i transmissions elektron mikroskop (Morgagni 268, FEI Europe BV, Eindhoven Holland). Software analyse (Soft Imaging System, GmbH, Munster) blev anvendt til billedanalyse af celle ultrastruktur.

Kvantitativ fase billeddannelse

Kvantitativ fase billeddannelse er en ikke-invasiv teknik med høj iboende kontrast selv for naturligt transparente objekter såsom levende celler. Derfor er denne metode er velegnet til langsigtede observationer af celle reaktioner på behandling uden nogen yderligere farvning. I disse forsøg kvantitativ fase billeddannelse blev udført ved Tescan multimodal holografiske mikroskop Q-fase. Q-PHASE er baseret på det oprindelige koncept af sammenhæng-kontrollerede holografisk mikroskop [27, 28].

Kvantitativ fase imaging blev indledt umiddelbart efter plumbagin behandling. Cellerne blev dyrket i Flow kamre u-Slide I Lauer familie (Ibidi, Martinsried, Tyskland) For at billedet nok antal celler i et synsfelt, mål Nikon Plan 10 /0,30 blev valgt. Hologrammer blev erobret af CCD-kamera (XIMEA MR4021 MC-VELETA). Hele billedet genopbygning og billedbehandling blev udført i Q-PHASE kontrol software. Kvantitative billeder fase vises i gråtoner med enheder af pg /um

2, der blev genberegnet fra originale radianer i henhold til ringere til og Davies [29 30]. Filmer med identifikation pile udarbejdet i ImageJ software.

RNA Isolation og Reverse Transcription

TriPure Isolation Reagent (Roche, Basel, Schweiz) blev anvendt til RNA isolering. RNA-prøver uden revers transkription blev anvendt som negativ kontrol for QRT-PCR for at udelukke DNA forurening. Det isolerede RNA blev anvendt til cDNA-syntese. RNA (1000 ng) blev transkriberet under anvendelse af transcriptor første streng cDNA syntesekit (Roche, Schweiz), som blev anvendt ifølge producentens anvisninger. CDNA’et (20 pi) fremstillet ud fra total-RNA blev fortyndet med RNase-frit vand til 100 pi, og mængden af ​​5 pi blev analyseret direkte ved hjælp af LightCycler

®480 II System (Roche, Basel, Schweiz).

Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion

QRT-PCR blev udført under anvendelse af TaqMan genekspression assays og LightCycler

®480 II System (Roche, Basel, Schweiz). Det amplificerede DNA blev analyseret ved den sammenlignende Ct metoden under anvendelse af β-actin som reference gen. De primer og probe sæt til ACTB (assay ID: Hs99999903_m1), BECN1 (Hs00186838_m1), BIRC5 (Hs00153353_m1), CCL2 (Hs00234140_m1), MAP1LC3 (Hs00797944_s1), Sox2 (Hs01053049_s1), NANOG (Hs04260366_g1), POU5F1 (Hs04260367_gH), og HIF1A (Hs00153153_m1) blev udvalgt fra TaqMan genekspression assays (Life Technologies, USA). Den QRT-PCR blev udført under følgende amplifikationsbetingelserne: samlet volumen på 20 pi, initial inkubation ved 50 ° C /2 minutter efterfulgt af denaturering ved 95 ° C /10 min, derefter 45 cykler ved 95 ° C /15 sek og ved 60 ° C /1 min.

Statistik

Pearson korrelation, principal komponent analyse og klyngeanalyse blev udført for at afsløre sammenhænge mellem sager og variabler. Disse analyser blev udført på standardiserede data; klyngen analyse blev udført under anvendelse af Wards fremgangsmåde. Alle diagrammer er afbildet med gennemsnit og standardafvigelser. Software Statistica (StatSoft, Tulsa, OK, USA) blev anvendt til analyse.

Resultater

Bestemmelse af IC50 for plumbagin

For at vurdere den cytotoksiske effekt af plumbagin på pc’en -3 cellelinje, og til at vælge koncentrationer til yderligere analyser, MTT test og tidstro celleanalyse (RTCA) impedans baseret test blev udført med koncentrationer 0 (intet lægemiddel tilsat), 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 , 5, og 6 pmol /l. Ved hjælp af logistisk regression, blev IC50-koncentrationer bestemt ved tidspunkter 6 og 24 (se fig 1A, 1B, 1C og 1D). Udgangssignalet fra RTCA metode er en celle indeksværdi (CI), se fig 1A, som afspejler antallet af celler, såvel som morfologiske parametre, såsom størrelsen, formen og graden af ​​cellebinding til substratet. Det betyder, at en stigning i den gennemsnitlige størrelse af overlevende celler kan påvirke CI værdi og kunne hænge sammen med højere IC50-værdier (1,4 uM og 10 uM IC50 efter 6 h og 24 h behandling, henholdsvis). Vi udførte flow-cytometrisk analyse under anvendelse SYTO 16 double-positivitet som markør af levedygtige celler og fremadrettet spredning (FSC) for at detektere størrelsen af ​​overlevende celler efter 2 uM plumbagin behandling. Antallet af store sunde celler afbildet som en SYTO 16 ++ /FSC + (rød) klynge ved flowcytometrisk dot plot blev forhøjet ved 24 tiden-point i forhold til 6h tid-point; se fig 1F, 1G, 1I og 1J. Dette forsøg blev udført i triplikater. Den gennemsnitlige store SYTO 16 ++ var 15,92% efter 6h af plumbagin behandling og 19,58% efter 24 timer af plumbagin behandling (Fig 1E). Da vi ikke observeret delende celler under behandlingen (sammenlign behandlet og ubehandlet time-lapse, S1 og S5 Videoer, celledeling var tilsyneladende kun i ubehandlede celler), fremkomsten af ​​større kræftceller kunne antages nemlig fordi ingen stigning i procentdelen af ​​annexin blev observeret celler (raske celler, der ville følge af at dividere) mellem 5h tid-point og 24 time-punkt af behandlingen (fig 1E) – V- /propidiumiodid (PI). Ifølge disse resultater, kan skiftet i IC50-værdierne identificeret ved RTCA metoden afspejler den øgede cellestørrelse mellem 6h og 24T tidspunkter, som bestyrkes af mikroskopisk analyse; se fig 1H og 1K.

(A) Real-time overvågning af relativ celle impedans (viste som en celle indeks) ved hjælp af RTCA systemet. (B) MTT-vurderede respons til 6 timer plumbagin behandling. (C) MTT-vurderede respons på 24 times plumbagin behandling. (D) IC50-værdier i henhold til RTCA og MTT og længden af ​​behandlingen. (E) Time-afhængige ændringer i mængden af ​​store celler med intakte kerner (SYTO 16 ++ /FSC +) og intakte celler (AnnexinV- /PI-), der vurderes ved flow-cytometri. (F) Antal store raske celler afbildet som SYTO 16 ++ /FSC + (rød) klynge ved flowcytometrisk dot plot på 6 h tid-point; Fremadspredte lys (FSC) er proportional med celle-overfladeareal eller størrelse. (G) granulering store raske celler afbildet som SYTO 16 ++ /SSC + (rød) klynge ved flowcytometrisk dot plot på 6 h tid-point; Side-spredte lys (SSC) er proportional med celle granularitet eller intern kompleksitet. (H) Morfologi af PC-3 celler efter 6h plumbagin behandling, 20x forstørrelse, fasekontrast mikroskopi. (I) Antal store raske celler afbildet som SYTO 16 ++ /FSC + (rød) klynge ved flowcytometrisk dot plot på 24 time-point; Fremadspredte lys (FSC) er proportional med celle-overfladeareal eller størrelse. (J) granulering store raske celler afbildet som SYTO 16 ++ /SSC + (rød) klynge ved flowcytometrisk dot plot på 24 time-point; Side-spredte lys (SSC) er proportional med celle granularitet eller intern kompleksitet. (K) Morfologi af PC-3 celler efter 24 timer plumbagin behandling; giant PC-3-celler med polyploid giant cancercelle (PGCCs) -lignende morfologi er fremhævet med pile. 20x forstørrelse, fasekontrast mikroskopi.

PC3 cellelinie er disponeret for mitophagy

For at vurdere den relative intensitet af mitophagy gener udtryk (

Pink1

,

FUNDC1

,

SMURF1

, og

PARL

) i PC-3 cellelinie, brugte vi CellMiner Database (https://discover.nci.nih.gov/cellminer /). Det gør det muligt præcist at bestemme udvalgte gener ekspressionsmønstre fra 5 microarray platforme i 60 cellelinier (NCI60 panel) (S1 Appendiks). Pro-mitophagic gener

Pink1

,

FUNDC1

, og

SMURF1

blev relativt overudtrykt i PC-3 i forhold til andre cellelinjer; på den anden side,

PARL

(ansvarlig for Pink1 spaltning) blev underexpressed. Disse data tyder på, at PC-3 celler har muligvis et højt mitokondrie kvalitetskontrol og er i stand til effektivt at identificere og derefter nedbryde beskadigede mitokondrier.

endoplasmatisk reticulum-ramte mitophagy

For at etablere om størstedelen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) i cellen er produceret af mitokondrier, vi anvendte fluorescerende farvning efter plumbagin behandling. Generel akkumulering af ROS blev overvåget ved anvendelse CellROX Deep Red Reagent. Klar colocalisation af ROS og mitokondrier farvning blev fundet (se fig 2B og 2C). Major ROS producerende mitochondrier (se pile) blev coatet ved isolering membran afledt af ER (se fig 2D). Denne observation blev bekræftet af transmissionselektronmikroskopi (TEM) (se fig 2F). Hævede og beskadigede mitokondrier blev indpakket ved at opsluge membran og gradvist nedbrydes (se fig 2G). Ingen belægning membran blev fundet omkring de sunde mitochondrier (se fig 2E).

(A) fasekontrastmikroskopi af PC-3 celler efter plumbagin behandling. (B) Generel akkumulering af ROS efter plumbagin behandling overvåget ved konfokal mikroskopi under anvendelse CellROX Deep Red Reagent. Områder med ROS ophobning er fremhævet med pile. (C) Mitokondrier farvning overvåget ved konfokal mikroskopi under anvendelse MitoTracker Green; området er forbundet med ROS i figur 2B er fremhævet med pile. (D) endoplasmatisk reticulum (ER) -farvning overvåget ved konfokal mikroskopi under anvendelse ERTracker Red; områder i forbindelse med ROS i figur 2B er fremhævet med pile. (E) Ubehandlet PC-3 cell, tværsnit af ubeskadiget mitochondrier (fremhævet med rød pil); Transmission Electron Microscope (TEM) visualisering. (F) plumbagin-behandlede PC-3 cell, mitokondrier belagt med ER-membranen med ribosomer (fremhævet med rød pil); TEM visualisering. (G) plumbagin-behandlet PC-3-celle, gradvis nedbrydning af mitokondrier i autophagosomes visualiseret ved TEM (røde pile); Hævede mitokondrier som en markør for skader (gul pil).

Time-lapse imaging

En time-lapse video blev erobret af holografisk mikroskop til at observere intensiteten af ​​celle migration og også at kvantificere kinetikken af ​​PC-3 celler død hos 48 timers periode. Mange forskellige typer af celle-celle-interaktioner blev overvåget og identificeret i denne periode, herunder vesikulær overførsel (Fig 3F og 3G), spise af døde eller døende celler (hyppigheden af ​​observation 2,5%; Fig 3C, S3 video) og engulfment og kannibalisme leve celler (hyppigheden af ​​observation 0,8%, fig 3B). Under kannibalisme af levende celle, en cannibalic celle kom i kontakt med en målcelle. Det næste skridt var en gradvis engulfment af target celle. Kernen i målcellen optrådte oprindeligt uforandret mens oversvømmer cellens kerne begyndte at ændre sig til en mere halvmåneklappen form. Bird øje struktur typisk for kannibalisme blev observeret (Fig 3B S2 Video). Endelig målcellen døde ud. De 2 pM plumbagin behandling havde en særlig indvirkning på celle motilitet og om ændringer i celle-til-celle kommunikation. En betydelig reduktion af celle motilitet og kommunikation blev fundet efter plumbagin behandling (se fig 3H og 3I, S1 og S5 videoer).

For detaljerede time-lapse videoer se S1-S4 videoer. (A) Time-lapse billeddannelse af entosis; internaliseret celle (rød pil) spillede en aktiv rolle i sin engulfment, hvilket resulterede i fuldstændig internalisering. Begge typer af celler (oversvømmer og opslugt) var levedygtige i lang tid og levede med omkring fem timer længere end de andre observerede plumbagin-behandlede tumorceller. (B) Time-lapse billeddannelse af cellefusion med kannibalisme (fordøjelse af opslugt celle); under fusion-kannibalisme af levende celler, den cannibalic celle (rød pil) kom i kontakt med målcellen (blå pil). Det næste trin var gradvis omslutning af målcellen. Kernen i målcellen optrådte oprindeligt uforandret mens oversvømmer cellens kerne begyndte at ændre sig til en halvmåneklappen form. eye Bird struktur blev observeret som en konsekvens af target celle vacualisation (se grøn pil). (C) Time-lapse billeddannelse af kannibalisme uden fusion; den døende celle (blå pil) blev angrebet og udnyttes af den cannibalic celle (rød pil). Målet celle var død efter angrebet. (D) Time-lapse billeddannelse af oncosis; oncotiske celler dannet typiske cytoplasmatiske blærer, der normalt fører til nekrose (se rød pil). (E) Time-lapse billeddannelse af omvendt oncosis; indledende dannelse af onkogene bleb’er (se rød pil) førte ikke til nekrose; bleb blev absorberet og cellen forblev levedygtige. (A-E) Multimodal holografisk mikroskopi, 10x forstørrelse. (F) Kommunikation mellem PC-3 celler; visualiseret ved TEM (se røde pile). (G) vesikulær overførsel mellem PC-3-celler; visualiseret ved TEM (se røde pile). (H) Hastighed af migrationen af ​​ubehandlet PC-3 cellepopulation; vurderet ud fra holografiske mikroskopi data ved CellProfiller software ved måling af “distance” parameter. (I) Hastighed af migrationen af ​​PC-3 cellepopulation efter 2 pM plumbagin behandling.

I oncosis, inkluderet tidlige ændringer markante ændringer i cellens form og volumen (fig 3D, S1 Video). Onkogene celler dannet cytoplasmatiske bleb’er og viste kromatin klumpning efterfulgt af nekrotiske funktioner såsom celler membran brud og adskillelse fra overfladen.