PLoS ONE: Cetuximab øger cytotoksicitet med Poly (ADP-ribose) polymerase Hæmning i hoved- og halscancer

Abstrakt

Overekspression af epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) er kendetegnende for hoved og hals kræft og tillægger øget modstand og ringere overlevelsesrater. Trods målrettede midler mod EGFR, såsom cetuximab (C225), næsten halvdelen af ​​de behandlede patienter mislykkes denne behandling, hvilket nødvendiggør nye terapeutiske strategier. Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -inhibitorer (PARPi) har fået nylig opmærksomhed på grund af deres unikke selektivitet i at dræbe tumorer med defekt DNA-reparation. I denne undersøgelse, viser vi, at C225 øger cytotoksicitet med PARPi ABT-888 i UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu hoved- og halscancer celler. Mekanismen for øget modtagelighed for C225 og PARPi involverer C225-medieret reduktion af non-homolog endesammenbinding (NHEJ) – og homolog rekombination (HR) -medieret DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) reparation, den efterfølgende persistens af DNA-skader, og aktivering af den indre apoptotiske vej. Ved at generere et DSB-reparation mangel, kan C225 gøre hoved og hals tumorceller er modtagelige for PARP-inhibering. Kombinationen af ​​C225 og PARPi ABT-888 kan således være en innovativ behandlingsstrategi for potentielt forbedre resultaterne hos patienter med hoved- og halscancer. Endvidere kan denne strategi også være muligt for andre EGFR overudtrykker tumorer, herunder lunge- og hjernecancer

Henvisning:. Nowsheen S, Bonner JA, LoBuglio AF, Trummell H, Whitley AC, Dobelbower MC, et al. (2011) Cetuximab øger cytotoksicitet med Poly (ADP-ribose) polymerase Hæmning i hoved- og halscancer. PLoS ONE 6 (8): e24148. doi: 10,1371 /journal.pone.0024148

Redaktør: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Tyskland

Modtaget: Marts 7, 2011; Accepteret: August 5, 2011; Udgivet: 30 August, 2011

Copyright: © 2011 Nowsheen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af staten Alabama Investment Pool til aktion (IMPACT) Award fra University of Alabama i Birmingham School of Medicine, center for Klinisk og Translational Science (CCTS) og Rådet for centerledere (COCD) Translational Research Intramural Pilot Grant Program (tilskud nummer 5UL1 RR025777-04) fra NIH National center for Research Resources, og udviklingsmæssige støtte fra Comprehensive Cancer center og Institut for Strålebeskyttelse Onkologisk ved University of Alabama i Birmingham School of Medicine (til ESY). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) spiller en væsentlig rolle i carcinogenese ved at modulere proliferation, differentiering og DNA beskadigelse respons [1] – [5]. Navnlig overekspression og amplifikation af EGFR er til stede i 80-100% af skælcellecarcinomer i hoved og hals og varsler dårlig prognose, ringere overlevelse, radioresistance, og mislykkede behandlinger [3], [6]. Således EGFR er blevet stærkt målrettet som en kræft terapeutisk strategi, og det har forbedret svarprocenter, locoregional kontrol og samlet overlevelse i kombination med strålebehandling i hoved og nakke kræftpatienter [2], [7]. Dog vil næsten halvdelen af ​​patienter med hoved- og halscancer behandlet med denne strategi stadig bukke under for denne sygdom. Hidtil ukendte strategier er således nødvendigt at forbedre resultaterne.

Midler, der er målrettet mod cancere, der er mangelfuld i homolog rekombination (HR) -medieret DNA dobbeltstrengsbrud (DSB) reparation, såsom poly (ADP-ribose) polymerase (PARP ) hæmmere (PARPi), har fået for nylig opmærksomhed på grund af deres meget selektive drab af BRCA-associeret, DNA reparation defekte tumorer samtidig opretholde minimal toksicitet i normale væv [8] – [10]. Derudover har PARPi blevet rapporteret at øge cytotoksicitet i sporadiske tumorer, når de kombineres med andre DNA-beskadigende midler, såsom med platin og cyclophosphamid i brystkræft og med temozolomid i glioblastom [11]. Således er der foretaget mange forsøg på at udvide anvendeligheden af ​​PARPi hinsides den BRCA-associerede tumorer ved kombination med midler, der ændrer DNA beskadigelse /reparationsveje.

Vi og andre har tidligere rapporteret, at målretning EGFR pathway inducerer en DSB-reparation mangel [4], [12] – [15]. Baseret på disse observationer, vi den hypotese, at cetuximab (C225), en potent inhibitor af EGFR, kunne øge tumor modtagelighed for PARPi. I denne undersøgelse, og i overensstemmelse med vores hypotese, vi viser, at C225 øger cytotoksicitet med PARPi ABT-888 i UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu hoved- og halscancer celler ved at øge den indre apoptotiske vej. Yderligere dissektion af mekanismen af ​​celledød afslører, at C225 reducerer ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) – og HR-medieret DNA DSB-reparation, hvilket resulterer i vedvarende DNA-skade følgende PARPi. Ved at generere et DSB-reparation mangel, kan C225 gøre hoved og hals tumorceller er modtagelige for PARP-inhibering. Således kan kombinationen af ​​C225 og PARPi ABT-888 være en innovativ behandlingsstrategi for potentielt forbedre resultaterne hos patienter med hoved- og halscancer. Desuden kan denne strategi også være muligt i andre EGFR-dysreguleret tumorer, såsom hjerne og lunge.

Resultater

Cetuximab øger cytotoksicitet med PARPi

Vi har tidligere vist, at C225, anti-EGFR monoklonalt antistof, effektivt inhiberer receptoraktivitet ved at blokere ligandbindingsstedet [16]. Virkningen af ​​C225 på cellelevedygtighed og vækst er også blevet godt undersøgt [17]. Undersøgelser har vist, at EGFR kan skænke øget modstand mod DNA-skader ved at øge cellulære DSB reparation kapacitet. Omvendt kan inhibering af EGFR inhibere DSB-reparation. Baseret på disse observationer, vi hypotese, at C225 kan forbedre cytotoksicitet med PARPi ABT-888 i UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu celler, der er velkarakteriserede, EGFR overekspression, repræsentativ pladecellecarcinom i hoved og hals [17 ] – [20]

for at teste denne hypotese, hoved- og halscancer cellelevedygtighed efter C225 og ABT-888 blev undersøgt ved hjælp af ATPLite analysen.. Doserne af C225 og ABT-888 udvalgte er tidligere blevet rapporteret at være inden fysiologiske område [2], [7], [9], [21]. Som vist i fig. 1A, blev differentieret modtagelighed for C225 og ABT-888 observeret i alle undersøgte (50 til 75% reduktion i cellelevedygtighed med kombinationsbehandling) cellelinier, hvilket antyder, at C225 faktisk øger celledød med ABT-888. Overraskende UM-SCC1 celler blev også modtagelige for PARPi alene (ca. 75% reduktion i cellelevedygtighed med 10 pM ABT-888).

(A) Kombination C225 og ABT-888 reducerer levedygtigheden af ​​UM-SCC1 , UM-SCC6, og FaDu hoved- og halscancer celler. Cellerne blev behandlet med enten vehikel eller 2,5 ug /mL C225 i 16 timer og efterfølgende eksponering for køretøjet eller 10 uM ABT-888. Fireogtyve timer efter ABT-888, blev cellelevedygtighed analyseres med ATPLite systemet (Perkin Elmer). Vist er repræsentative for mindst 3 uafhængige forsøg af cellelevedygtigheden efter forskellige behandlinger som målt ved relative ATP-niveauer (gennemsnit +/- SEM, * p 0,01, ** p 0,001 sammenlignet med vehikelkontrol). (B-D) Kombination C225 og ABT-888 reducerer kolonidannende evne (B) UM-SCC1, (C) UM-SCC6, og (D) FaDu hoved- og halscancer celler. Cellerne blev behandlet med enten vehikel eller 2,5 ug /mL C225 i 16 timer. Efter behandlingsperioden blev celler podet til kolonidannelse assays og udsat for forskellige doser af ABT-888. Vist er det betyde overlevelse fraktion (+/- SEM) fra mindst 3 uafhængige kolonidannelse assay forsøg efter behandling (** p 0,001).

For at bekræfte disse resultater, vi også udført kolonidannende assays i nærvær af C225 i kombination med forskellige doser (1-20 uM) af ABT-888. I overensstemmelse med cellelevedygtighed data, tilsætning af C225 til ABT-888 reducerede signifikant kolonidannende evne UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu celler på en dosisafhængig måde (fig. 1B-D). Interessant, UM-SCC1 celler blev igen særlig modtagelige for ABT-888 alene. Disse resultater indikerer, at inhibering af EGFR med C225 kan gøre celler mere modtagelige for PARPi ABT-888.

Forbedret cytotoksicitet med cetuximab og ABT-888 involverer aktivering af indre vej af apoptose

Sådan belyse den mekanisme, hvormed C225 og ABT-888 inducerer cellulær cytotoksicitet, vi først undersøgt aktivering af cellulær apoptose, idet PARPi cytotoksicitet har vist sig at involvere den apoptotiske [8] pathway. Vi vurderede cellulære annexin V positivitet, en tidlig indikator for apoptose induktion. Som vist i fig. 2A og 2B, aktivering af apoptose var signifikant større i både UM-SCC6 og FaDu celler med C225 og ABT-888 i forhold til enten agent alene. Aktivering af apoptotiske veje i sidste ende fører til kløvning af caspase 3, som igen initierer kaskaden af ​​proteolyse af integrale cellulære proteiner og resulterer i programmeret celledød. For at bekræfte, at C225 og ABT-888 inducerer apoptose i hoved- og halscancer celler vurderede vi niveauerne af total og spaltes caspase 3. Som vist i fig. 2C, øget kløvet caspase 3 med en samtidig reduktion af den samlede eller spaltet caspase 3 blev observeret i FaDu celler efter 2,5 ug /ml C225 og 10 pM ABT-888. I overensstemmelse med tidligere rapporter, C225 alene induceret apoptose i behandlede celler [17], [22]. En lignende stigning i caspase 3 spaltning blev observeret efter C225 og ABT-888 i UM-SCC6 (fig. 2D).

(A-B)% af apoptotiske celler efter kombination cetuximab (C225) og ABT-888 behandling i (A) FaDu og (B) UM-SCC6 celler. Cellerne blev behandlet med enten bærer eller 5 ug /mL C225 i 16 timer og efterfølgende eksponering for 10 uM ABT-888 i 24 timer. Efter behandling blev cellerne derefter farvet og behandlet til Annexin V som en markør for apoptose. Vist er% af Annexin V-positive celler (gennemsnit +/- SEM, * p 0,01, ** p 0,001 sammenlignet med vehikelkontrol). Notatet kombination af C225 + PARPi var statistisk forskellig fra enten alene middel (* p 0,01) (C-D) C225 og ABT-888 forøget apoptose i (C) FaDu og (D) UM-SCC6 celler som påvist ved spaltning af caspase 3. (E-F) C225 og ABT-888 aktiverede den iboende apoptosecyklus i (E) FaDu og (F) UM-SCC6 celler som påvist ved spaltning af caspase 9. celler blev underkastet enten vehikel eller 2,5 ug /ml C225 i 16 timer og derefter underkastet ABT-888. 6 og 24 timer efter behandlingsperioden, blev cellelysater høstet, og niveauer af total og spaltet caspase 3 (24 timer) og 9 (6 timer) blev påvist ved Western blot analyse. En dramatisk sideløbende reduktion i total caspase blev også observeret. Actin blev anvendt som en loading kontrol. Vist er et repræsentativt Western blot af mindst 3 uafhængige forsøg.

Der er to store cellulære apoptotiske processer, der består af de interne og eksterne veje [23]. Den ydre vej aktiveres af proapoptotiske ligand-medieret stimulering af cellulære dødsreceptorer og til gengæld spaltning af caspase 8. I modsætning hertil er den indre vej udløst af stress signaler fra inden i cellen, hvilket i sidste ende resulterer i kløvning af caspase 9.

Vi hypotese, at PARPi apoptose skyldes intracellulære stress signaler fra DNA-skade, der fører til aktivering af den indre apoptotiske vej. I overensstemmelse med denne hypotese, C225 og ABT-888 udløste spaltning af caspase 9 i FaDu (fig. 2E) og UM-SCC6 (fig. 2F). Disse data understøtter aktivering af den indre apoptosecyklus efter C225 og ABT-888 behandling.

Cetuximab hæmmer homolog rekombination og non-homolog ende-sammenføjning reparation

Den førnævnte data understøtter, at C225 øger cytotoksicitet med ABT-888 og aktiverer indre vej af apoptose. Fordi letalitet med PARPi er blevet rapporteret at være afhængig af defekte DSB-reparation pathways [8], [10], og fordi EGFR tidligere har vist sig at ændre de DNA skade /respons-veje, vi næste hypotese, at den forøgede cytotoksicitet med C225 og ABT -888 skyldtes C225 ændring af DSB reparation [13].

Der er 2 store DSB reparation veje, HR- og NHEJ-medieret reparation [24]. HR er en high fidelity mekanisme for reparation og er den foretrukne vej, når en homolog er til stede i G2 og S-fase. Flere proteiner, herunder BRCA1, BRCA2, og RAD51, er involveret i denne indviklede proces. I modsætning hertil er NHEJ betragtes som en risiko for fejl system, fordi det skal være strukturelt forskelligartet til at rumme mange forskellige substrater. Den forekommer fortrinsvis når en homolog er fraværende, uden for G2 og S-fase. NHEJ er afhængig af DNA-afhængig protein kinase (DNA-Pk) katalytiske subunit, den Ku70 /80 heterodimeren, og XRCC4-ligase IV-komplekset.

For at teste, om forbedret cytotoksicitet ved C225 og PARPi involverer C225-medieret inhibering af DSB-reparation, vi evaluerede effekten af ​​C225 på HR- og NHEJ-medieret DSB-reparation induceret efter γ-bestråling (IR), en potent aktivator af DNA DSB-reparation. For at vurdere virkningerne af C225 på HR-medieret reparation, vi analyserede kinetikken af ​​IR-induceret RAD51 foci, veletablerede markører for HR reparation, på forskellige tidspunkter efter 4 Gy IR. Som vist i fig. 3, IR øgede procentdelen af ​​celler med RAD51 foci og toppede på 4-8 timer efter IR. I overensstemmelse med vores hypotese, C225 svækket HR med mere end 50% i bestrålede UM-SCC1 (fig. 3A), UM-SCC6 (fig. 3B), og FaDu (fig. 3C) med hoved- og halscancer celler. Disse resultater viste, at C225 inducerer en HR underskud, og den cellulære modtagelighed for PARPi følgende C225 var konsistent med PARP-inhibering målretning celler, som er defekte i HR-medieret reparation.

C225 dæmper IR-induceret RAD51 foci, velkarakteriserede markører for homolog rekombination (HR) -medieret DNA DSB-reparation i (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, og (C) FaDu celler. Celler blev behandlet med bærer, 2,5 ug /mL C225, eller 5,0 ug /ml C225 i 16 timer og efterfølgende udsat for spotte eller 4 Gy bestråling (IR). Ved de angivne tidspunkter efter IR blev cellerne behandlet til immunfluorescensfarvning for RAD51 foci. Vist er de repræsentative data fra 3 uafhængige forsøg på% af celler (gennemsnit +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 i forhold til køretøjet på hver respektive tidspunkt). Indsættelsen i (A) er et repræsentativt billede af UM-SCC1 celler, der udviser RAD51 foci efter IR.

PARP inhiberet celler er også blevet rapporteret at være modtagelige for inhibitorer af DNA-Pk, en kritisk spiller i NHEJ [25]. Dette antyder, at NHEJ kan være et alternativ DSB reparationsvej udover HR at bibringe resistens over for PARPi. Derudover EGFR er blevet rapporteret at interagere og translokere med DNA-Pk til kernen for at aktivere NHEJ reparationsprocesser [13], [26], [27]. Det er således muligt, at C225-medieret cellulær følsomhed over for PARPi skyldes også C225 ændring af NHEJ pathway.

For at analysere virkningerne af C225 på NHEJ, vi vurderede kinetikken af ​​phospho-threonin 2609 (Thr2609) DNA-PK-foci, veletablerede markører for IR-induceret NHEJ-medieret reparation [28], [29], på forskellige tidspunkter efter 4 Gy IR. Som forventet, IR forøgede signifikant antallet af celler med phospho-Thr2609-DNA-PK-foci på både 30 minutter og 1 time efter IR i UM-SCC1 (fig. 4A), UM-SCC6 (fig. 4B), og FaDu (fig. 4C). Interessant tilsætning af C225 betydeligt svækket denne reaktion med mere end 30% i alle undersøgte cellelinjer.

C225 dæmper bestråling (IR) -induceret DNA-Pk Thr2609 foci, veletablerede markører for ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ) -medieret DNA DSB reparation i (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, og (C) FaDu hoved- og halscancer celler. Celler blev behandlet med bærer, 2,5 ug /mL C225, eller 5,0 ug /ml C225 i 16 timer og efterfølgende udsat for spotte eller 4 Gy IR. På det angivne tidspunkt efter IR blev celler behandlet til immunfluorescensfarvning for DNA-PK-Thr2609 foci. Vist er de repræsentative data fra 3 uafhængige forsøg på% af celler (gennemsnit +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med celler ikke er udsat for C225). (D) C225 reducerer phospho-Thr2609 DNA-Pk niveauer i UM-SCC6 hoved- og halscancer celler. Celler blev behandlet med vehikel eller 2,5 ug /mL C225 i 16 timer og efterfølgende udsat for spotte eller 4 Gy IR. En time efter IR blev celler behandlet til Western blot-analyse for phospho-Thr2609 DNA Pk niveauer. Totalt DNA Pk blev også analyseret og tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol.

EGFR har også vist sig at phosphorylere og aktivere DNA-Pk [13], [26], [27]. For at bestemme hvorvidt inhibering af NHEJ af C225 skyldes mindre phosphorylering af DNA-PK, vi næste undersøgt niveauer af phospho-DNA-Pk følgende C225. Som vist i fig. 4D, C225 reduceret DNA-Pk phosphorylering uden at ændre total DNA-Pk i UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu celler, hvilket er konsistent med C225-medieret inhibering af NHEJ-medieret reparation.

Tilsammen disse data viser, at C225 inducerer en DSB-reparation mangel af de 2 store DSB reparation veje, NHEJ og HR, og øget cytotoksicitet ved C225 med PARPi skyldes hæmning af både store DSB reparation veje.

EGFR hæmning øger DNA skader

C225 inducerer en DSB-reparation mangel i hoved- og halscancer celler (fig. 3 og 4). Vi antager, at C225-behandlede celler bør have forhøjet markører af DNA DSB’er. For at vurdere DNA DSB’er, undersøgte vi virkningen af ​​C225 på γ-H2AX foci, som er veldokumenterede markører for DNA DSB’er [30], i UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu cellelinier. Som vist i fig. 5A, alle cellelinjer udviser signifikant øget DNA beskadigelse efter C225 som påvist ved øget procentdel af celler med γ-H2AX foci på en dosis-afhængig måde. Dette blev bekræftet via Western blot-analyse, der afslørede forøget y-H2AX niveauer efter forskellige doser af C225 i UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu celler (Fig. 3B). Disse resultater viste, at inhibering af EGFR med C225 øger DNA DSB-skader i behandlede celler, hvilket er konsistent med C225-induceret hæmning af DSB-reparation.

(A) C225 øger antallet af celler med DSB’er som påvist ved γ -H2AX foci, et almindeligt anvendt markør for DSBs. Vist er de repræsentative data fra 3 uafhængige forsøg på% af celler (gennemsnit +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med kontrol køretøj). (B) C225 øger y-H2AX proteinniveauer i behandlede celler. UM-SCC1, UM-SCC6, og FaDu-celler blev behandlet med vehikel, 2,5 ug /mL C225, eller 5,0 ug /ml C225 i 16 timer. Efter behandlingsperioden blev celler behandlet til (A) immunfluorescensfarvning for γ-H2AX foci eller (B) Western blot-analyse for γ-H2AX niveauer. Vist er repræsentant Western blot af 3 uafhængige forsøg.

Kombination cetuximab og ABT-888 genererer vedvarende DNA-skader

PARPi hæmmer base excision reparation vej ansvarlig for løsningen af ​​DNA single strengbrud (SSB’er). SSB’er der fortsat findes i delende celler i sidste ende konverteres til DSBs og repareres af HR-medieret reparation. Eftersom C225 reducerer DSB-reparation kapacitet, og at C225 øger cytotoksicitet med ABT-888, vi hypotese, at kombinationen C225 og ABT-888 vil resultere i yderligere persistent DNA DSB-skader. At evaluere denne udførte vi et tidsforløb analyse af γ-H2AX foci med bærer, C225 alene, ABT-888 alene, eller kombinationen C225 og ABT-888. Som vist i fig. 6, sammenlignet med vehikelkontrol, C225 alene som forventet induceret 2-3 fold% af celler med forøget DNA beskadigelse i UM-SCC1 (fig. 6A), UM-SCC6 (fig. 6B), og FaDu (fig. 6C) hoved- og halscancer celler. Interessant kombinationen af ​​C225 og ABT-888 resulterede i en signifikant større antal celler med vedvarende DNA skader i alle undersøgte (fig. 6) cellelinier. Desuden UM-SCC1 celler (Fig. 6A), som udviste udsøgt følsomhed over for ABT-888 alene, havde også vedvarende DNA skader med ABT-888 alene. I modsætning hertil i UM-SCC6 (fig. 6B) og FaDu (fig. 6C) celler, ABT-888 alene resulterede ikke i signifikant stigning i celler med tydelig DNA DSB-skader. Disse resultater viser, at cytotoksicitet fra C225 og PARPi kan skyldes den manglende evne hos de behandlede celler til at løse DNA DSB’er, den mest kritiske læsion i celler. Salg

(A-C) DNA-skader 2, 24 og 48 timer følgende køretøj, blev C225, PARPi eller begge C225 + PARPi vurderet ved γ-H2AX foci i (A) UM-SCC1, (B) UM-SCC6, og (C) FaDu celler. Celler blev behandlet med vehikel eller forskellige doser af C225 i 16 timer og efterfølgende eksponering for bærestof eller forskellige doser af ABT-888. Ved de angivne tidspunkter efter PARP-inhibering, blev cellerne behandlet til immunfluorescensfarvning for γ-H2AX foci. Vist er de repræsentative data fra 3 uafhængige forsøg på% af celler (gennemsnit +/- SEM) med 10 foci (* p 0,05, ** p 0,01 sammenlignet med køretøj kontrol på hver respektive tidspunkt).

Virkninger af cetuximab og ABT-888 på DNA beskadigelse og reparation ikke skyldes cellecyklus omfordeling

DNA reparationsmekanismer, navnlig HR, kan være afhængig af cellecyklussen. Derudover er EGFR involveret i celleproliferation veje, og inhibering af EGFR er blevet vist at inducere cellecyklus omfordeling [4], [31], [32]. Det er muligt, at inhibering af HR af C225 kan være en indirekte virkning af forøget cellulær akkumulering i G1-fasen af ​​cellecyklussen. Vi undersøgte derfor cellecyklus fordelingen af ​​celler behandlet med køretøj eller C225 at udelukke cellecyklus virkninger som en potentiel confounder, som C225 ændrer DNA DSB reparation. Som vist i fig. 7, er der et fravær af enhver celle cyklus omfordeling efter behandling i UM-SCC1 (fig. 7A) eller UM-SCC6 (fig. 7B) for at tage højde for C225-medieret reduktion i DSB-reparation på tidspunkterne, hvor HR reparation var målt.

Cell cyklus fordeling af (A) UM-SCC1 eller (B) UM-SCC6 celler efter behandling med køretøj eller C225. (C) Cell cyklus fordeling af UM-SCC1 celler efter køretøj, C225, ABT-888, eller en kombination C225 og ABT-888. Celler blev behandlet med vehikel eller forskellige doser af C225 i 16 timer og efterfølgende eksponering for køretøjet eller 5 uM ABT-888. Otteogfyrre timer efter PARP-inhibering, blev cellerne behandlet til cellecyklus analyse ved flowcytometri. Vist er det repræsentative fordeling cellecyklus (gennemsnit +/- SEM) på mindst 2 uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer.

ABT-888 er også blevet rapporteret at forårsage ældning, når de kombineres med stråling i brystkræft celler [33]. Derudover kan andre PARPi inducere G2 /M akkumulering af celler [34]. Således at vurdere cellecyklus ændringer som en anden potentiel forstærket cytotoksicitet, cellecyklusfordeling følgende kombination C225 og ABT-888 blev udført i UM-SCC1 celler. Som vist i fig. 7C, ingen celle cyklus omfordeling blev observeret. Disse resultater viste, at C225-induceret dæmpning af DSB reparation veje og den efterfølgende forbedret cytotoksicitet med ABT-888 ikke var på grund af cellecyklus effekter.

Diskussion

I denne undersøgelse viser vi, at C225 , en inhibitor af EGFR, øger cellulær følsomhed over for PARPi ABT-888 i hoved- og halscancer celler. Mekanismen af ​​et forstærket cytotoksicitet involveret C225-medieret dæmpning af de to store DNA DSB reparation veje, NHEJ og HR, som fører til den vedvarende DNA-skader efter PARPi og den efterfølgende aktivering af indre vej af apoptose. Således kan kombinationen af ​​C225 og PARPi ABT-888 være en innovativ behandlingsstrategi for potentielt forbedre resultaterne hos patienter med hoved- og halscancer. Denne kombination af C225 og ABT-888 kan være særlig spændende for et regime, som indbefatter andre DNA-beskadigende midler såsom stråling.

EGFR har været impliceret i en række cellulære processer, herunder celleproliferation og overlevelse, angiogenese, og DNA-skade respons og reparation. Specifikt med hensyn til DNA-skade respons, EGFR er blevet vist at translokere til kernen og interagere med DNA-Pk at aktivere NHEJ [13], [26], [27]. Aktiveret EGFR kan også øge RAD51 foci og ekspressionsniveauer at regulere HR [35]. Disse aktioner EGFR er blevet tilskrevet modstand af EGFR forstærket /muterede tumorer til DNA skadende stoffer og give begrundelse for målrettet hæmning af EGFR.

Til støtte for en rolle EGFR i DNA skader og reparation veje, C225 , som hæmmer EGFR, dæmper de to store DNA DSB reparation veje, HR og NHEJ, ved at ændre RAD51 og DNA-Pk foci niveauer, hhv. C225 inhiberede også DNA-Pk phosphorylering. Som PARPi har vist sig at målrette HR-mangelfulde celler, handlinger C225 på HR-medieret reparation giver begrundelse for, hvorfor den ny kombination af C225 og PARPi øger cytotoksicitet i hoved og hals kræft celler [8], [9]. Derudover har PARP hæmmede celler vist sig at blive sensibiliseret over for inhibitorer af NHEJ pathway, hvilket antyder, at NHEJ også kan være en backup pathway uløste SSB’er [25]. Dette kan også forklare den dramatiske cytotoksicitet observeret i C225 og PARPi behandlede celler. Som C225 inducerer både en NHEJ og HR reparation mangel, at kombinationen af ​​C225 med PARPi fører til en høj andel af behandlede celler med persistente DSB’er. Givet disse observationer, bør celler udsat for C225 og PARPi være udsøgt modtagelige for andre DNA-beskadigende midler, såsom stråling. Dette er et område med aktiv efterforskning i vores laboratorium.

C225 og PARPi også forbedret apoptose, hvilket er i overensstemmelse med tidligere rapporter om PARPi cytotoksicitet [8]. Vi fandt, at denne apoptose var et resultat af aktivering af indre vej. Det er værd at bemærke, at omfanget af regulering af apoptose ikke når niveauet af cytotoksicitet målt ved kolonidannelse assays. andre end apoptose flere veje vil kunne påvirke de kolonidannende evner celler, såsom inhibering af celleproliferation, cellecyklusstop, mitotisk katastrofe, og autofagi. Denne uoverensstemmelse kan også forklares med den tanke, at i modsætning til analyse af foci eller immunblotting, der viser virkningen på en snap shot i tide, kolonidannelse assayet afspejler flere mekanismer for celledød i løbet af en periode på 3 uger. Som multiple signalveje er involveret i regulering og bestemmelse af skæbnen for celledød eller overlevelse, vores data antyder, at inhibering af EGFR kan være en del af den komplicerede cellesignalering /DNA beskadigelse reparation netværk, og kan bidrage kun delvis til den samlede påvirkning celle modtagelighed for DNA-skader. Det er således sandsynligt, at PARPi og EGFR inhibering kan regulere flere cytotoksiske veje. For eksempel, ABT-888 i kombination med strålebehandling har også vist sig at inducere autophagic celledød i lungecancerceller [36]. Derfor kan andre mekanismer af celledød, herunder autofagi, kan ikke udelukkes.

Da PARP er et SSB DNA-reparation enzym, er behandling med PARPi ABT-888 forventes at inhibere SSB reparation og dermed øge basale niveauer af SSB’er. Tilsætning af C225 resulterer i yderligere DNA-skade. Den øgede DNA-skader observeret ved længere tidspunkter kan skyldes vedholdende DSBs eller resultatet af yderligere DNA-nedskæringer som følge af konvertering af SSB’er til DSBs under forsøg DNA-reparation eller sammenstyrtede replikationsgafler. Dette understøttes af den øgede% af celler med γ-H2AX foci på senere tidspunkter. Alternativt kunne aktivering af celledødsprocesser såsom apoptose også fremkalde markører for DNA-skader.

Interessant nok UM-SCC1 hoved- og halscancer celler udviser modtagelighed for PARPi alene. Disse celler er ikke gennemgående DSB-reparation mangelfuld som vurderet af IR-induceret RAD51 og DNA-PK-foci. Imidlertid PARPi alene inducerer vedvarende γ-H2AX foci, der tyder på tilstedeværelsen af ​​persistente DSB’er. Det er interessant at postulere, at andre molekylære determinanter for PARPi modtagelighed uafhængig af iboende DNA reparation defekter skal eksistere. En af flere muligheder er for nylig rapporteret øget belægning af undertrykkende E2F4 /p130 komplekser af BRCA1 og RAD51 initiativtagere i overværelse af PARPi, dermed øge cellulære følsomhed over for oxidativ skade ved at undertrykke de backup DSB reparation veje [37].

i de sidste mange år, sammenhængen mellem human papillomavirus (HPV) og hoved- og halskræft er størknet [38], [39]. Interessant, HPV associeret hoved og hals kræft udviser en bedre prognose og synes at reagere bedre på chemoradiation [40]. Det postuleres, at dette skyldes HPV oncoproteiner og prisændringer DNA beskadigelse /respons-pathways [41], [42]. Interessant nok har E7-ekspression blevet vist at forstyrre E2F4 og p130 undertrykkende aktivitet og forhindrede PARPi-medieret nedregulering af BRCA1 og RAD51 [37]. interaktion mellem alle de HPV-onkogener og den DNA beskadigelse respons kan imidlertid resultere i forskellig modtagelighed på DNA-skade. Således ville det være interessant at vurdere følsomheden af ​​HPV-associerede tumorer til PARPi.

Vores undersøgelse viser, at hæmning af EGFR med C225 øger cytotoksicitet med PARPi ABT-888 i hoved- og halscancer celler via C225- medieret forstyrrelse af HR- og NHEJ-medierede DSB reparation veje. Disse resultater berettiger fremtidige undersøgelser for at sammenligne effekten versus traditionel kemoterapi. Endnu vigtigere er, at opretholde livskvalitet er blevet et område med vægt i onkologi kan anvendelsen af ​​målrettede midler, såsom C225 og ABT-888 yderligere at forbedre det terapeutiske forhold. Endelig kan denne strategi også være muligt i andre tumorer med afvigende EGFR-signalering, såsom hjerne og lungekræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige hoved og hals pladecarcinom cellelinjer UM-SCC1 og UM-SCC6 blev opnået tilladelse af Dr. Thomas E Carey (University of Michigan, Ann Arbor, MI). De blev holdt i DMEM (GIBCO, Invitrogen) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Atlanta Biologicals) og 1% penicillin /streptomycin (Invitrogen). Det menneskelige hoved og hals pladecarcinom cellelinie FaDu (HTB-43) blev opnået fra ATCC (Manassas, VA) og blev opretholdt i RPMI-1640 (GIBCO, Invitrogen) suppleret med 10% FBS. Den PARP inhibitor ABT-888 (Enzo Life Sciences) og cetuximab (C225, Bristol Myers Squibb), blev anvendt i vores undersøgelse.

Cell Levedygtighed

Cell levedygtighed blev målt ved hjælp af ATP-lite 1 trin luminescens-assay (Perkin Elmer) ifølge producentens anvisninger.