PLoS ONE: Knockdown af lymfoid Enhancer faktor 1 Hæmmer Colon Cancer Progression In vitro og in Vivo

Abstrakt

Angivelse af lymfoide forstærker faktor 1 (LEF1) ofte ændres i forskellige menneskelige kræftformer. Denne undersøgelse havde til formål at vurdere LEF1 udtryk i tyktarmskræft væv og til at udforske ændrede fænotyper, gen udtryk og den mulige mekanisme efter slået ned LEF1 udtryk i tyktarmskræft cellelinjer. I alt 106 tyktarmskræft og matchede paratumorous normale væv blev anvendt til at vurdere LEF1 udtryk ved hjælp af immunhistokemi og QRT-PCR. LEF1 lentivirus blev anvendt til at Knockdown LEF1 udtryk for vurderingen af ​​cellelevedygtighed, cellecyklusfordeling, apoptose, og genekspressioner. Den nøgne mus xenograft assay blev udført for at påvise effekten af ​​LEF1 knockdown

in vivo

. Dataene viste, at niveauerne af LEF1 mRNA og protein blev signifikant forøget i humane coloncancer væv sammenlignet med den matchede paratumorous normale væv og blev associeret med infiltration dybde, lymfeknude og fjerne metastaser, avancerede TNM (tumor-knude-metastase) faser, og kortere samlet overlevelse. Endvidere LEF1 knockdown reduceret tumor cellelevedygtighed, invasion kapacitet, MMP2 og MMP-9-ekspression, men induceret apoptose. Nude mus xenograft assay viste, at LEF1 knockdown undertrykte tumor dannelse og vækst

in vivo

. Endvidere blev ekspressionen af ​​Notch pathway-relaterede proteiner RBP-JK og Hes1 reduceret i LEF1 knockdown-celler. Tilsammen blev LEF1 protein overudtrykt i tyktarmskræft væv og knockdown af LEF1 udtryk hæmmede væksten tyktarmskræft

in vitro

in vivo

. Disse data tyder på, at målretning af LEF1 udtryk bør yderligere evalueres for forebyggelse og terapi tyktarmskræft

Henvisning:. Wang W-J, Yao Y, Jiang L-L, Hu T-H, Ma J-Q, Liao Z-J, et al. (2013) Knockdown af lymfoide Enhancer faktor 1 Hæmmer Colon Cancer Progression

In Vitro

In Vivo

. PLoS ONE 8 (10): e76596. doi: 10,1371 /journal.pone.0076596

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: 31. maj 2013; Accepteret: 3. september 2013; Udgivet: 2 Oktober 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Natural Science Foundation of China (No.81001090) (https://www.nsfc.gov.cn/nsfc/cen/xxgk/slzz.html).The~~number=plural finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design , indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Ingen yderligere ekstern finansiering blev modtaget til denne undersøgelse

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige. kræft hos både mænd og kvinder i verden, der tegner sig for den anden årsag til kræft dødsfald i USA [1,2] og den fjerde i Kina [3]. Således tyktarmskræft stadig en stor global folkesundhedsproblem, selv om der er et betydeligt verdensomspændende fald i kræft dødelighed af tyktarmskræft i de sidste par årtier, som følge af den betydelige fremskridt med tidlig diagnosticering og effektive behandlinger. Til dato har patogenese og molekylære mekanisme er ansvarlig for udvikling tyktarmskræft blevet grundigt undersøgt, og en stor mængde viden er frembragt vedrørende molekylære ændringer forbundet med kolon carcinogenese, som involverer aktivering af onkogener og stilhed tumorsuppressorgener [4]. Men for at meget skal der gøres mere for præcis forståelse af kolon carcinogenese og udvikle nye strategier til effektivt at kontrollere denne sygdom.

Til dette formål vores forskning fokuserer på lymfoide forstærker-bindende faktor-1 (LEF1) , et medlem af høj mobilitet gruppe (HMG) proteinfamilie.

LEF1

koder et 48-kD kerneprotein, der normalt udtrykkes i præ-B og T-celler [5,6] og spiller en vigtig rolle i embryogenese og cancerudvikling [7]. LEF1 er et multifunktionelt protein, der påvirker mange cellulære funktioner, såsom regulering af Wnt signalering for celleproliferation, apoptose, mobilitet og gentranskription [8,9]. Ændret ekspression af LEF1 proteinet er blevet rapporteret at være involveret i tumorigenese af forskellige humane cancere, herunder coloncancer [10]. Molekylært, kan LEF1 mediere ekspressionen af ​​Wnt signalering gener via rekruttering af β-catenin til promotoren af ​​målgenerne [11,12], men LEF1 selv mangler sin egen transkriptionel aktivering potentiale i celler. LEF1 protein indeholdende β-catenin bindingsdomæner kan regulere celleproliferation og invasion af tumorceller [13]. Flere faktorer kan påvirke LEF1 udtryk, såsom fibroblast vækstfaktor-2, PITX2, og hepatocytvækstfaktor [14-16].

Således i denne undersøgelse, først opdaget vi LEF1 udtryk i tyktarmskræft væv sammenlignet med de paratumorous kolon væv og derefter undersøgt virkningerne af LEF1 knockdown i reguleringen af ​​tyktarmskræft cellelevedygtighed, cellecyklus distribution, apoptose, og genekspression

in vitro

i nøgne mus implanteret. Vi udforskede også virkningerne af LEF1 knockdown om regulering af Notch vej.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af adfærd for Human Ethics Committee of Første Affiliated Sygehus, College of Medicine i Xi’an Jiaotong Universitet. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Dyret forsøgsprotokollen blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Medical School of Xi’an Jiaotong Universitet.

Patienter og prøver

i denne undersøgelse har vi efterfølgende rekrutteret 106 par kirurgisk resektion tyktarmskræft og paratumorous normale vævsprøver (5 cm fra tumor læsion) fra The First Affiliated Sygehus, College of Medicine i Xi’an Jiaotong Universitet fra januar 2006 til og marts 2007. Disse vævsprøver blev opnået fra 60 mandlige og 46 kvindelige patienter med en gennemsnitsalder på 55,5 år (range fra 30 til 81 år). Klinisk-patologiske træk ved disse patienter er vist i tabel 1. Patologisk diagnose af disse prøver blev uafhængigt igen bekræftet ved to patologer på en blændet måde. Alle patienter blev ikke behandlet med nogen kemoterapi eller strålebehandling før operationen. De sidste patient opfølgninger blev gennemført i slutningen af ​​maj 2012. De patienter, der blev tabt til opfølgning eller død fra andre end tyktarmskræft årsager blev betragtet som censurerede data under overlevelse analysen.

Klinisk-patologisk variabler

N

LEF1 udtryk score (gennemsnit ± SD)

P Drømmeholdet værdi

Alder (år) 60414,87 ± 2.330.502≥60655.21 ± 2.65Tumor differentiationWell504.84 ± 1.940.274Moderate394. 95 ± 2.87Poor175.59 ± 3.02Infiltration depthT

1 + T

2404,12 ± 1.980.002T

3 + T

4665,66 ± 2.56Lymph node metastase N

0.464,06 ± 2,12 0,001 N

1-3605,85 ± 2.74Distant metastasisM

0.864,69 ± 2.040.004M

1206,31 ± 2.77TNM stageI81.39 ± 3,23 0.001II334.14 ± 2.40III455.33 ± 2.25IV207.12 ± 2.69Table 1 . Foreningen af ​​LEF1 udtryk med klinisk-patologiske faktorer fra patienter.

CSV Hent CSV

Histopatologi og immunhistokemi

Paraffin-indlejrede sektioner (5 um) blev afparaffiniseret og rehydreret gennem en række graduerede alkoholer. For immunhistokemi blev et primært antistof mod LEF1 (C12A5, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) anvendt i en fortynding på 1: 100, og inkuberet natten over ved 4 ° C. Snittene blev inkuberet med et isotype-matchet kontrol antistof som negativ kontrol. Derefter blev sektionerne farvet med et biotin-konjugeret sekundært antistof, og farven blev udviklet ved anvendelse af 0,05% 3 ‘, 3’-diaminobenzidintetrahydrochlorid efterfulgt af modfarvning med hematoxylin. Snittene blev til sidst revideret og afsluttet under et Olympus mikroskop (BX41, Tokyo, Japan), ifølge en tidligere undersøgelse under anvendelse multiplicere intensiteten score og omfanget af farvning score [17]. Den farvningsintensitet blev scoret som 0 (ingen farvning), 1 (svag farvning), 2 (middel farvning) eller 3 (stærk farvning). Omfanget af farvning blev evalueret ved at tildele prøver scores baseret på procentdelen af ​​positivt farvede celler som følger: 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) og 4 (76-100%). Antallet af positive celler blev vurderet ved at tælle 10 tilfældige felter på × 400 forstørrelse. Det endelige resultat blev varierede fra 0 til 12. En score på 0-2 blev defineret som negativ udtryk, scores 3-5 som “svage udtryk”, scores 6-9 som “moderat udtrykket” og scores 10-12 som “stærkt udtryk “. Med henblik på yderligere analyse prøverne med score 0-5 blev defineret som markant reduceret farvning eller tab af LEF1 udtryk, mens prøverne med scoringer 6-12 blev grupperet og defineret som positivt udtryk.

Real-tid revers transkription-polymerasekædereaktion

Totalt cellulært RNA blev isoleret fra væv og cellelinjer under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Disse RNA-prøver blev derefter omvendt transkriberet til cDNA under anvendelse af et RT-PCR kit (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR blev derefter udført i iQ5 Flerfarvet Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) under anvendelse af SYBR Premix Ex Taq TM II (Takara). Primersekvenserne at forstærke LEF1 var: 5′-AGCGAATGTCGTTGCTGAGTGTA-3 ‘og 5′-CTCTTGCAGACCAGCCTGGATAA-3’. En housekeeping-genet GAPDH blev anvendt som intern kontrol, og primersekvenserne var 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘og 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’. Dataene blev erhvervet som en tærskel cyklus (ΔC

t) værdi. De ΔC

t-værdier blev bestemt ved at trække den gennemsnitlige interne husholdning gen C

t-værdi fra gennemsnittet målgenet C

t-værdi. Da forstærkningen effektivitet target gener og intern kontrol gen var lig, blev den relative genekspression beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCt metode. Hver måling blev udført tre gange.

Konstruktion af lentivirus vektor bærer LEF1 shRNA

En LEF1 shRNA lentivirus vektor (U6-vshRNA-CMV-PUR-GFP-GV248-shLEF1) er designet, syntetiseret , og konstrueret af Genechem Co. (Shanghai, Kina). Følgende målsekvenser i det humane LEF1 gen blev selekteret, dvs. målrette 1, GCTGACATCAAGTCTTCCTTG; målrette 2, GTGAAGAGCAGGCTAAATATT; målrette 3, GCTGGTCTGCAAGAGACAATT; og målrette 4, GCTCA TTCCCAACGTGCAAAG. Mål 3 blev valgt til de efterfølgende eksperimenter. Den lentivirusvektor U6-vshRNA-shNC, som koder for en tilfældig RNAi sekvens, blev anvendt som en negativ kontrol.

cellelinjer, kultur, gen transfektion og behandlinger

menneskelige kolon kræft cellelinjer, Caco

2, Colo205 blev HCT116, HT29, og Lovo fås fra Cell Resource center, Shanghai Institutes for Biologisk Institut (Shanghai, Kina) og dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) (HyClone, Logan, UT, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen), penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (0,1 mg /ml) i 5% CO

2 ved 37 ° C. En human coloncancer cellelinie SW480 blev dyrket i RPMI1640-medium (HyClone, Logan, UT, USA) suppleret med 10% FBS, penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (0,1 mg /ml) i 5% CO

2 ved 37 ° C, mens en anden human coloncancer cellelinie SW620, blev dyrket i L-15 medium (Invitrogen) suppleret med 10% FBS, penicillin (100 IE /ml) og streptomycin (0,1 mg /ml) i 5 % CO

2 ved 37 ° C. SW480 og SW620-celler blev inficeret med lentivirus vektorer ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 10 og 100, henholdsvis, og derefter udvalgt i puromycin-holdige vækstmedium. Efter 7 dages dyrkning blev puromycin-resistente kolonier samles op, ekspanderet og analyseret separat

γ-sekretase hæmmer DAPT (100 uM; Sigma-Aldrich, USA). Blev anvendt til farmakologiske inhiberingsassays, der effektivt kan blok Notch intracellulært domæne (NiCd) kommer ind i cellekernen. Kort fortalt blev disse celler podet i seks-brønds plader og behandlet med 2 ml medium indeholdende 1% FBS og DAPT. Kontrolceller blev behandlet med lige store mængder af dimethylsulfoxid (DMSO). Efter 48 timer af inkubation blev celleekstrakterne forberedt til Western-blot som beskrevet nedenfor.

Protein ekstraktion og Western blot

Protein blev ekstraheret fra væv og celler, og disse proteinlysater var adskilt af 6% -12% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese; separerede proteiner blev derefter elektronisk blottet på polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Danvers, MA). Membranerne blev derefter blokeret og efterfølgende inkuberet med de følgende primære antistoffer: anti-LEF1 antistof (1: 800; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-MMP2 (1: 500; Cell Signalling Technology, Danvers, MA), anti -MMP7 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-MMP9 (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-NiCd (1: 800; Cell Signalling Technology), anti- RBP-JK (1: 100; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-Hes1 (1:50; Santa Cruz Biotechnology), eller anti-β-actin-antistof (1: 1000; Santa Cruz Biotechnology). Endelig blev blots visualiseret ved et ECL detektionssystem (Millipore) med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology). Western blots blev gentaget tre gange for hver proteinprøve.

Cellelevedygtighed MTT assay Salg

Celler (5 x 10

3 per brønd) blev podet med 200 pi vækstmedium i en 96 brønds plade og dyrket op til 7 dage. Ved afslutningen af ​​forsøgene, 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT, 0,5 mg /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) blev tilsat til hver brønd. Cellerne blev derefter dyrket ved 37 ° C i 4 timer, og 150 pi DMSO blev tilsat til hver brønd og blandet ved omrystning ved stuetemperatur i 10 min. Efter dette blev absorptionshastigheden målt ved en bølgelængde på 490 nm med et spektrofotometer. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer og gentages mindst tre gange.

Flowcytometri cellecyklus og apoptose analyser

For cellecyklus analyse, celler (5 x 10

5), blev dyrket og opsamlet, vasket to gange med phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret med iskold 70% ethanol i 24 timer ved 4 ° C. De fikserede celler blev farvet med 150 pi propidiumiodid og 150 pi RNase A (Sigma-Aldrich) sekventielt. Efter inkubation i 30 minutter ved 37 ° C blev prøverne undersøgt af et flowcytometer (FACS-kaliber, Franklin Lakes, NJ) og Cell Quest-software blev anvendt til analyse af dataene. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

I apoptose analyse, celler (5 x 10

5 pr brønd) blev dyrket i seks-brønds plader, der er opsamlet, og vasket to gange med iskold PBS. Dernæst 500 pi af bindingspuffer, 5 pi Annexin V-APC, og 5 pi 7-AAD (Keygen Biotech, Nanjing, Kina) blev successivt tilsat til prøverne. Efter blanding og inkubation i 15 minutter ved 37 ° C blev prøverne kørt på flowcytometri øjeblikkeligt. Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Tumorcelle Matrigel invasion assay

invasion kapacitet for tyktarmskræft celler blev vurderet ved anvendelse af en Millicell invasion kammer (Millipore, Billerica, MA, USA) . De 8 um pore inserter blev coatet med Matrigel (Becton Dickinson og Company, Franklin Lakes, NJ, USA). Celler (5 x 10

4) blev resuspenderet med 200 pi serum-frit medium med 5 pg /ml mitomycin C (Sigma-Aldrich) i det øverste kammer, og det nederste kammer blev fyldt med normal dyrkningsmedium. Efter inkubation i 24 timer blev ikke-invaderende celler på den øvre overflade fjernes med en vatpind og de invaderende celler på den nederste overflade af filteret blev fikseret i methanol, farvet med 0,1% krystalviolet og talt under et mikroskop hjælp 10 tilfældigt udvalgte felter i en forstørrelse på 200x

Nude mus tumorceller xenograft assay

Male BALB /c nøgne mus (alder mellem 4 og 6 uger,. Shanghai Experimental Animal center, Shanghai, Kina) blev subkutant podet med 1 × 10

7 celler og har til huse i et patogen-fri facilitet i Animal center i Xi’an Jiaotong Universitet. Tumorvolumenet blev bestemt ved længden (L) og bredde (W), målt med en glidende kaliberen og beregnet som L × W

2 × 0,5. Musene blev aflivet 45 dage efter subkutan injektion af tumorceller. Tumorbærende nøgne mus blev observeret af IVIS afbildningssystem (IVIS spektrum, Xenogen, CA, USA), inden de aflives.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 17.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL). Beskrivende data blev analyseret med Pearsons chi-square test (to-sidet). Måledata blev analyseret med Students

t

-test eller variansanalyse (ANOVA). En

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

LEF1 udtryk i humane coloncancer væv og cellelinjer

I denne undersøgelse , vi først bestemt udtryk for LEF1 protein i humane coloncancer væv og cellelinier hjælp immunhistokemi. Resultaterne viste, at 71 ud af 106 colonvæv og 23 af 106 paratumours normale colonvæv udtrykte LEF1 protein, hvilket indikerer, at tyktarmskræft væv udtrykte højere niveauer af LEF1 end dem i de paratumours normale colon væv (

P

0,05, figur 1A). Naturligvis blev LEF1 ekspression observeret i kerner i tyktarmskræft væv og paratumours normale colonvæv (figur 1A). Desuden blev ekspressionen af ​​LEF1 protein associeret med infiltration dybde, lymfeknude og fjernmetastaser, og avancerede TNM (tumor-node-metastaser) stadier af tyktarmskræft (

P

0,01; tabel 1). Overlevelsen analyse (5-års opfølgning af 106 patienter tyktarmskræft) viste, at den mediane overlevelse på patienter med LEF1 udtrykte tumor var 48,5 måneder, hvilket var markant dårligere end dem med LEF1-negative tumorer (mere end 60 måneder) (

P

0,05, figur 1B)

(A) Immunhistokemi farvning af LEF1 på paratumorous kolon væv (a) og tyktarmskræft væv (bd) (skala bar, 25 um):. ( a) negativ ekspression, (b) svag ekspression, (c) moderat ekspression, (d) kraftig ekspression. (B) Kaplan-Meier kurve for sammenslutning af LEF1 proteinekspression med gennemsnitlig overlevelse af patienter. (C) QRT-PCR blev anvendt til at påvise de relative ekspressionsniveauer af LEF1 mRNA (CC væv: coloncancer væv Normalt væv: paratumorous colon væv). Kolonner, betyde (n = 106); barer, SD; ***

P

0,001 sammenlignet med paratumorous kolon væv.

P Drømmeholdet værdi blev bestemt ved Students

t

-test. (D) Western blot analyse af LEF1 udtryk i syv kolorektale cancerceller (Caco

2, Colo205, HCT116, HT29, Lovo, SW480, og SW620). β-actin blev anvendt som intern kontrol.

Ligeledes viste real-time PCR-analyse, at niveauer af LEF1 mRNA blev øget væsentligt i disse 106 par af tyktarmskræft væv sammenlignet med paratumours normale colonvæv (

P

0,05, figur 1C). Endvidere blev LEF1 ekspression højt udtrykt i colon cancer cellelinier SW480 og SW620 (figur 1D). Således valgte vi disse to cellelinjer til knockdown LEF1 udtryk for yderligere undersøgelse.

Stabil knockdown af LEF1 udtryk i kolon kræftceller

For at udforske den rolle, LEF1 på tyktarmskræft celler, vi udnyttet et lentivirus transporterer LEF1 shRNA at inficere SW480 og SW620 til knockdown af LEF1 ekspression. Mål 3 blev anvendt til fastsættelse af stabile LEF1 knockdown cellelinier. Vi har med held fået stabil LEF1 Knockdown celler betegnes shLEF1 og shNC (med negativ kontrol vektor). Real-time PCR-analyse viste, at ekspressionen af ​​LEF1 mRNA blev inhiberet op til 70% i shLEF1 celler sammenlignet med shNC celler (

P

0,05; Figur 2A). Ligeledes blev niveauerne af LEF1 protein også slået ned betydeligt i shLEF1 celler end i shNC celler (figur 2B).

(A) QRT-PCR-analyse af LEF1 ekspression efter infektion af forskellige LEF1 shRNA ekspression lentivirus-vektorer, *

P

0,05 sammenlignet med forælder cellen. (B) Western blot-analyse af LEF1 proteinekspression. β-actin blev anvendt som intern kontrol. 1-4 (forskellige målpositionen vektorer) og shNC (negativ kontrol). Mål 3 blev anvendt til at fastsætte de stabile LEF1 knockdown cellelinjer.

Knockdown af LEF1 udtryk hæmmede levedygtighed kolon kræftceller

in vitro

og tumor dannelse og vækst

in vivo

Stabile LEF1 shRNA transfektanter blev podet og dyrket i puromycin-holdige vækstmedium til vurdering af cellelevedygtighed. Vores data viser, at SW480-shLEF1 celler og SW620-shLEF1 celler voksede meget langsommere end SW480-shNC celler og SW620-shNC celler, henholdsvis (

P

0,01, figur 3A). Cellecyklusfordeling detekteres af en flowcytometer viste en forlænget og fremtrædende forsinkelse på G0 /G1-fasen progression til S-fasen i shLEF1 celler sammenlignet med shNC celler (

P

0,01, figur 3B og 3C). Desuden har vi yderligere analyseret, om den nedsatte tumorcelle levedygtighed skyldes induktion af apoptose og fandt, at SW480 og SW620 celler med stabil LEF1 shRNA transfektion havde signifikant mere apoptose sammenlignet med kontrolcellerne (figur 3D og 3E).

(A) MTT assay. **

P

0,01 sammenlignet med de tilsvarende shNC celler. (B og C) Flowcytometrisk cellecyklusfordeling. Kolonner, mean (n = 3); barer, SD; **

P

0,01 sammenlignet med de tilsvarende shNC celler. (D og E) Flowcytometrisk apoptose assay. Celle spontan apoptose blev vurderet med flowcytometri. Kolonner, mean (n = 3); barer, SD; ***

P

0,001 sammenlignet med kontrol shNC celler

Derudover har vi udført en nøgen mus xenograft assay til at vurdere hvilken rolle LEF1 knockdown

in vivo.

. Fyrre fem dage efter tumor celle injektion viste LEF1 knockdown-tumorxenoplantater en reduktion af tumorvækst i forhold til kontrol-shNC tumorxenoplantater. Derudover

in vivo

billeddannelse viste, at begge typer mus ikke havde observerbare tumormetastaser til fjerntliggende organer (figur 4A). De gennemsnitlige mængder af tumormassen afledt af SW480-shLEF1 celler og SW620-shLEF1 celler var meget mindre end dem af tumorxenotransplantater afledt af SW480-shNC celler og SW620-shNC celler henholdsvis (

P

0,001 , figur 4B). Tumorvægten viste også, at knockdown af LEF1 ekspression hæmmede væksten af ​​colon cancerceller i nøgne mus (figur 4C), fordi vægten af ​​tumorer masse i SW480 og SW620 celler, der udtrykker shLEF1 var betydeligt lettere end i kontrolmusene. Disse fund foreslog, at LEF1 knockdown hæmmet dannelse og vækst af tumorxenoplantater in vivo.

(A)

I

vivo

imaging analyse. Væksten af ​​tumorer dannet af shLEF1 celler og kontrol shNC celler i nøgne mus blev afbildet af IVIS. (B) Tumorvolumen blev målt hver 3. dag fra dag 9 efter inokuleringen ved at måle tumor længde og bredde. Kolonner, mean (n = 6); barer, SD; ***

P

0,001 sammenlignet med kontrol shNC celler. (C) Tumorvægt blev sammenlignet på dag 45 efter inokulation af tumorceller. Kolonner, mean (n = 6); barer, SD; ***

P

. 0,001 sammenlignet med kontrollen shNC

Knockdown af LEF1 udtryk faldt invasion af kolon kræftceller og ekspressionen af ​​MMP-2 og MMP-9

Efter at vi bestemt effekten af ​​LEF1 knockdown om regulering af tyktarmskræft celleinvasion ved hjælp af Matrigel invasion analysen. Vi behandlede cellerne med Mitomycin C for at eliminere indflydelsen af ​​forøget proliferation. Resultaterne viste, at antallet af invaderende SW480-shLEF1 celler og SW620-shLEF1 celler var meget lavere end for SW480-shNC celler og SW620-shNC celler (

P

0,01, figur 5A og 5B). Desuden kunne knockdown af LEF1 ekspression signifikant nedsætter niveauerne af MMP-2 og MMP-9-protein, men ikke MMP-7-protein i shLEF1 celler sammenlignet med den af ​​shNC tyktarmskræft celler (figur 5C).

( A og B) Tumorcelleinvasion assay. Repræsentative farvning billeder, × 200. Kvantitativ analyse af invaderet tumorceller mellem LEF1 knockdown og kontrolceller. Kolonner, mean (n = 3); barer, SD; **

P

0,01 sammenlignet med kontrol shNC celler. (C) Western blot-analyse til MMP2, MMP-7 og MMP-9-protein. β-actin blev anvendt som intern kontrol.

Knockdown af LEF1 udtryk hæmmede RBP-JK aktivitet

Til dato har flere undersøgelser rapporteret, at Wnt og Notch vej kooperativt kontrollere celledeling og tumorigenese i tarmene [18]. For at afsløre eventuelle konvergerende point og til at afklare potentielle mekanisme, hvormed LEF1 regulerer spredning og tumorigenese, opdaget vi udtryk for Notch intracellulære domæne (NiCd) /RBP-JK /Hes1 pathway gener i disse tyktarmskræft celler. Vi fandt ingen signifikant forskel i niveauet af NiCd udtryk i kolon kræftceller med forskellige behandlinger; dog blev niveauerne af RBP-JK og Hes1 proteiner reduceret i SW480-shLEF1 celler og SW620-shLEF1 celler sammenlignet med kontrol-celler (figur 6A).

(A) Western blot analyse af NiCd, RBP-JK og Hes1 udtryk. (B) Western blot-analyse af LEF1 ekspression efter behandling med Notch pathway inhibitor DAPT (100 uM). β-actin blev anvendt som intern kontrol.

Vores upublicerede data viste en forøget aktivitet af fuld længde LEF1 promotor ved cotransfektion af NiCd-cDNA i SW480, HepG2, HEK293, A549, og HeLa-celler ; Således har vi udnyttet DAPT, en inhibitor af Notch pathway, at blokere NiCd ekspression i SW480 og SW620 celler. Vores data viser, at NICD nedregulering påvirkede udtryk for Hes1 og LEF1 proteiner (figur 6B), hvilket tyder på en gensidig regulering mellem LEF1 og Notch vej.

Diskussion

I den aktuelle undersøgelse, vi først analyseret udtryk for LEF1 mRNA og protein i tyktarmskræft vævsprøver og derefter undersøgt virkningerne af LEF1 knockdown om regulering af ændret tumor celle levedygtighed, cellecyklus distribution, apoptose, og gen-udtryk

in vitro

på nøgne mus implanteret . Vi fandt, at niveauet af LEF1 mRNA og protein blev forøget betydeligt i tyktarmskræft væv og associeret med infiltration dybde, lymfeknude og fjernmetastaser og kortere samlet overlevelse. LEF1 knockdown reduceret tumor cellelevedygtighed, invasion kapacitet, og ekspression af MMP2 og MMP-9, men induceret apoptose i colon cancerceller. LEF1 knockdown undertrykte tumordannelse og vækst i nøgne mus. Desuden blev ekspressionen af ​​RBP-JK og Hes1 reduceret i LEF1 Knockdown celler. Disse data tyder på, at LEF1 kunne yderligere evalueret som et mål for forebyggelse og behandling tyktarmskræft.

Tidligere undersøgelser viste, at udtrykket og aktivering af LEF1 protein bidraget til udviklingen af ​​kræft [10,13,19]. Faktisk vores aktuelle undersøgelse analyserede ekspressionen af ​​LEF1 mRNA og protein i coloncancer og paratumorous colonvæv og fandt, at LEF1 blev overudtrykt i colon cancer væv. Niveauerne af LEF1 ekspression var forbundet med infiltration dybde, lymfeknude, og fjerne metastaser, og avancerede TNM stadier af tyktarmskræft samt dårlig samlede overlevelsesraten hos patienter med coloncancer. Sidstnævnte data var forskellige fra de indberettede data fra Kriegl, L et al [20], men lignede en anden tidligere undersøgelse [21]. Disse data tyder på, at LEF1 kan være en nyttig markør til forudsigelse af tyktarmskræft progression.

For yderligere at forstå den rolle LEF-1 i tyktarmskræft, vi bankede ned LEF1 udtryk i to Tyktarmskræft cellelinjer, SW480 og SW620. Vi udforskes yderligere rolle LEF1 i væksten af ​​tyktarmskræft. Celle cyklus desorganisering blev defineret som en inducer, der føre til ukontrolleret celleproliferation og cancer progression efterfulgt af tumorigenese, fx Shtutman et al identificeret, cyclin D1 var en af ​​de β-catenin /LEF1 komplekse målgener [22], som udpegede for tumorcelleproliferation og tumorprogression. I overensstemmelse med denne undersøgelse, viste vores nuværende data, nedregulering af LEF1 signifikant hæmmede tyktarmskræft celledeling

in vitro

ved at øge sub-G1 apoptotisk befolkning, forlænge G0 /G1 fasen, og reducere G2 /S fase LEF1-slået ned SW480 og SW620 celler

in vitro

i nøgen mus-xenotransplantater, som bekræftede to andre tidligere undersøgelser i human endometrie og tyktarmskræft [9,23].

Desuden er vores nuværende undersøgelsen viste, at LEF1 overekspression i de primære CRC væv var forbundet med fjernmetastaser af CRC patienter, som er i overensstemmelse med adskillige tidligere undersøgelser dokumenterer, at LEF1 blev karakteriseret som en biomarkør for tyktarmskræft til metastaserer til leveren [21]. Faktisk vores nuværende

in vitro Salg data bekræftede, at knockdown af LEF1 ekspression inhiberes invasion evne SW480 og SW620 celler sammenlignet med kontrollen shRNA-transficerede celler. På molekylært niveau er MMP2, MMP7 og MMP9 forbundet med cellemigrering proces, påvirker cancerudvikling og progression [24,25]. Vi fandt, at knockdown af LEF1 ekspression undertrykkes MMP2 og MMP-9-ekspression, men ikke MMP-7, hvilket indikerer, at den selektive modulering af MMP’er ved LEF1 kunne have den biologiske signifikans i tyktarmskræft progression. I modsætning hertil LEF1 kunne regulere MMP-7-ekspression og aktivitet i brystcancerceller [26], mens en anden tidligere undersøgelse viste, at cirkulerende MMP-2 og MMP-9 kan anvendes til potentielt at klassificere patienter i lav risiko, høj risiko, godartet sygdom og brystcancer [24]. Men vores nøgne mus xenograft assay ikke nogen tumor metastase i både LEF-1 knockdown og kontrol tumorxenoplantater; således, er klart behov for yderligere undersøgelser.

Desuden er det Notch pathway ofte aktiveres i forskellige humane cancere, såsom cancere i hjernen, brystkirtler, cervix, lunge, hoved og hals, colon, nyre, bugspytkirtel og akut myeloid [27,28]. Inhibering af Notch pathway inducerede tumorceller for apoptose og nedsat tumorcelleproliferation i colorektal cancer [29]. En nylig publikation viste, at Wnt-vejen kunne regulere Notch pathway [30]. Den krydstale mellem Notch og Wnt veje kan være delvist medieret af den specifikke regulering af GSK-3β-afhængige Notch phosphorylering. Phosphorylering af Notch proteiner er blevet indirekte korreleret med Notch aktivering og nuklear translokation samt cellulære transformation. Desuden Jagged1, en af ​​Notch-ligander, kan aktiveres ved p-catenin under ektopisk hårsækken dannelse hos voksne epidermis [31].