PLoS ONE: human papillomavirus korrelerer med inflammatorisk Stat3 Signaling aktivitet og IL-17 niveau i patienter med kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal cancer (CRC) er en stor byrde for den offentlige sundhed og sundhedspleje i hele verden. Mikrobiota er blevet foreslået at fremme kronisk inflammation i tarmen, som igen fremmer tumorudvikling. Denne undersøgelse fokuserer på mulige korrelationer af human papillomavirus (HPV) infektion med proinflammatoriske STAT3 signalering aktiviteter og de resulterende niveauer af sin nedstrøms proinflammatorisk cytokin IL-17 i CRC patienter.

Metoder

HPV blev undersøgt hjælp HPV Genotypebestemmelse Chip teknologi og konstitutivt aktive Stat3 (p-Stat3) og IL-17-niveauer blev testet under anvendelse af immunhistokemi (IHC) i paraffinindlejrede cancerøse og tilstødende normalt væv (ANT) fra en kohorte af 95 CRC patienter. Korrelation analyser blev udført mellem HPV-infektion og klinisk-patologiske karakteristika, STAT3 aktiviteter og IL-17 niveauer blandt disse CRC patienter

Resultater

Der blev observeret Tre store resultater:. (1) eksisterede HPV-infektion i en høj CRC tilfælde (48,4%, 46/95), hvoraf 45 sager (45/46, 97,8%) var høj-risiko HPV 16-positive, og kun ét tilfælde var HPV53-positive. (2) HPV-infektion korreleret med fattigere kliniske stadier (III + IV) i CRC. (3) HPV-infektion stærkt korreleret med både konstitutivt højere STAT3 aktiviteter (P 0,01) og højere IL-17 niveauer (P 0,01). Kun i CRC væv, men ikke i ANT væv

Konklusioner

HPV-infektion er almindelig i CRC patienter tyder potentielt forebyggende virkning af HPV-vaccination blandt højrisiko unge individer. Vi har for første gang afslørede en tri-lateral forhold mellem HPV-infektion, konstitutiv Stat3 aktivitet og IL-17-niveau, hvis kollaborativ handling kan orkestrere et proinflammatorisk mikromiljø i colorectum, som igen kan fremme carcinogenese og muligvis lette progression af CRC .

Henvisning: Li YX, Zhang L, Simayi D, Zhang N, Tao L, Yang L, et al. (2015) human papillomavirus korrelerer med inflammatorisk Stat3 Signaling aktivitet og IL-17 niveau i patienter med kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (2): e0118391. doi: 10,1371 /journal.pone.0118391

Academic Redaktør: Zhi-Ming Zheng, National Institute of Health – National Cancer Institute, UNITED STATES

Modtaget: 22 oktober, 2014 Accepteret: 15 januar 2015; Publiceret: 23 feb 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Oasis Scholar Fund of Shihezi University (LZXZ201023), National Natural Science Foundation of China (NSFC nr 81.160.301 og 81.260.301. ). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform globalt efter lungekræft og brystkræft, med forekomst, dødelighed og prævalens 5-års tegner sig for 9,7%, 8,5% og 10,9%, henholdsvis blandt alle kræftformer efter til GLOBOCAN 2012 [1]. CRC dødeligheden er faldet på verdensplan i de seneste par år takket være screeningsprogrammer etableret i mange lande og påviselig effekt af risiko-reduktioner og forbedrede behandlinger [2,3].

Den nuværende paradigme er, at de fleste solide tumorer herunder CRC er knyttet til kronisk inflammation, direkte eller indirekte [4]. Blandt mange mikroorganismer studeret, er virusinfektioner foreslået i udvikling af kræft, især at skyldes human papillomavirus (HPV). Virale infektioner af HPV-undertyper højrisiko, såsom HPV16 og HPV18, er kausal til udvikling af livmoderhalskræft, anal og genitale cancerformer. For nylig er der blevet rapporteret HPV16 /18-infektioner at være forbundet med svælg cancer [5,6]. I de sidste par år har HPV-infektion vist sig at være forbundet med kolorektal cancer [7,8].

På grund af forskellige inflammatoriske celler og cytokiner til stede i tumor mikromiljø, tumorer er blevet omtalt som “sår, ikke heler “[9]. Signal transducer og aktivator af transkription 3 (Stat3) er en kritisk signaleringsvej, der er involveret i dannelsen af ​​tumormikromiljøet gennem regulering nedstrøms proinflammatoriske cytokiner og faktorer, som fremmer tumorvækst og progression [10]. Phosphoryleret Stat3 (p-Stat3) er den aktive form af Stat3, der kan detekteres i forskellige cancerformer, herunder colorectal cancer [11]. Blandt de nedstrøms molekyler induceret af STAT3-aktivering, IL-17 er et vigtigt proinflammatorisk cytokin secerneret af T-hjælper-IL-17-producerende (Th17) -celler, som er produceret af CD4

+ T-celler under induktion af TGF-β. Nylige undersøgelser har antydet, at IL-17 spiller en dobbelt rolle i at betjene enten som en promotor eller antitumor faktor afhængig kræftmodeller [12]. I CRC, en stor mængde undersøgelser viser, at IL-17 virker som en promotor i stedet for et antitumor faktor i tumor initiering og progression [4,13,14]. Konstitutivt aktiv p-Stat3 kan regulere differentieringen og modningen af ​​Th-celler til hemmelig IL-17, som igen, positivt feeds tilbage til Stat3 signalering, inducere mere IL-17, der skal udtrykkes. STAT3 signalering spiller en rolle i at fremme tumor via inducere dannelsen af ​​tumor blodkar, lette akkumulering af neutrofiler, øge tumorceller evne til at modstå apoptose, og løbende at udvide den lokale inflammatoriske reaktion [4]. På den anden side, IL-17 fremmer carcinogenese primært ved at vække aktiveringen af ​​Stat3 signalvejen til at inducere modstandsdygtighed over for apoptose og fremme angiogenese ved som letter tumorvækst og progression [15].

Bakterielle infektioner er blevet vist at samarbejde med Stat3 signalvej at fremkalde CRC [4]. Det vides ikke, imidlertid, om virusinfektioner også kan være i stand til at handle på samme måde som bakterier. Denne undersøgelse fokuserer på mulige korrelationer af HPV-infektion med proinflammatorisk Stat3 signalering, og dens nedstrøms IL-17 cytokin i CRC. Vi har undersøgt den hypotese, at i lighed med bakterielle infektioner, kan kronisk HPV-infektion også kunne samarbejde med Stat3 signalering, udløser en inflammatorisk reaktion, der letter dannelsen af ​​et mikromiljø gunstige for carcinogenese og /eller cancer progression af CRC. Ved at undersøge en kohorte af 95 CRC patienternes væv og deres tilstødende normale væv (ANT), har vi fået tre store fund: (1) HPV-infektion findes i næsten halvdelen af ​​CRC sager, hvoraf 97,8% er inficeret med høj risiko HPV16 typen; (2) HPV-infektion korrelerer med fattigere kliniske stadier af CRC; og (3) HPV-infektion stærkt korrelerer med konstitutive aktiviteter Stat3 og dens downstream IL-17 niveauer i CRC væv. Disse observationer har en potentiel konsekvenser bag en HPV-Stat3 mekanisme i patogenesen af ​​CRC og en mulig præventiv anvendelse af HPV-vaccination blandt højrisiko unge individer i det mindste i områder med udbredt HPV-associeret CRC.

Metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Ethics Review Board (IERB) på vores First Affiliated Sygehus af Shihezi University School of Medicine (IERB nr SHZ2010LL02). Den IERB frafaldes behovet for patienternes samtykke på grund af anonyme analyser af data og standard universitet hospital retningslinjer i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen, herunder fortrolighed og anonymitet blev fulgt i håndtering og offentliggørelse af patienternes væv.

Patienter

i alt 235 kirurgisk resektion og blev opnået paraffinindstøbte arkivering humane væv, herunder 95 CRC væv og 90 parrede ANT væv og 50 kolorektal adenom (CRA) væv fra Patologisk Institut, First Affiliated Hospital i Shihezi University School of Medicine dateret fra 2005 til 2007. Alle valgte væv blev baseret på histopatologiske diagnoser og bekræftet for diagnoser før eksperimenter. Disse patienter blev oprindeligt valgt på grund af både deres tilgængelige kliniske oplysninger og tilstrækkelig væv størrelse til forsøg analyser (herunder gentagelser). CRC patienter var i alderen fra 33 til 85 år (med en gennemsnitsalder på 66 år), herunder 43 tilfælde af tyktarmskræft (med 41 parrede myrer til rådighed) og 52 tilfælde af endetarmskræft (med 49 parrede myrer til rådighed). De 5 CRC patienter uden parrede myrer forblev i studiet for at få statistisk styrke i kliniske analyser med flere sub-grupperinger. Disse CRC patienter modtog ikke præoperativ kemoterapi eller kemo-strålebehandling og deres klinisk-patologiske karakteristika blev samlet.

På grund af forbruget af væv i tidligere undersøgelser og krævede store størrelse af væv til dna-ekstraktion og efterfølgende HPV test, kun 50 parret ANT væv var til rådighed, at tilfredse udvælgelseskriteriet af 5 cm fra kanten af ​​kræft. For DNA-ekstraktion og HPV test, derfor var vi kun i stand til at teste disse tilgængelige 50 parrede ANT væv, som tilfældigt blev fordelt blandt parrede CRC væv. Derudover har vi også testet 50 ubeslægtede CRA væv, en fælles ikke-kræft sygdom i fordøjelsessystemet, for HPV-infektion for at undersøge, om der var nogen forskel mellem CRC og CRA, hvoraf CRA væv fungerede som en anden kontrolgruppe med hensyn til HPV-infektion.

Påvisning af HPV-infektion Brug af Gene Chip Technology

Genomisk DNA blev ekstraheret fra væv ved anvendelse af et DNA-ekstraktion kit ifølge producentens protokoller (QIAGEN, Tyskland). DNA-prøver blev derefter kodet uden identifikation af kræft eller ikke-kræft diagnoser og sendt til en specialitet DNA genotype laboratorium (Yaneng Bioscience Co., Ltd, Shenzhen, Kina, https://www.yanengbio.com/en/home2.asp) for HPV testning. Kvaliteten og integriteten af ​​ekstraheret DNA blev testet ved PCR under anvendelse β-actin-genet som en intern kontrol (fremadrettet primer: 5′-CTTAGTTGCGTTACACCCTT-3 ‘og revers primer: 5′- TGTCACCTTCACCGTTCC-3’). En 155 bp PCR-produkt af β-actin genet blev påvist ved elektroforese på 2% agarosegel

På anmodning af Yaneng Bioscience Co, blev taget følgende forholdsregler for at undgå mulig krydskontaminering under processen.: (1) Single-use engangsartikler blev ansat i DNA-ekstraktion og efterfølgende HPV test; (2) Fra det første parti af ekstraheret DNA og HPV testresultater, valgte vi en negativ HPV kontrol (en ANT prøve med store størrelse af væv) og en positiv HPV kontrol (en CRC prøve med store størrelse væv), der skal indgå i hver batch af DNA-ekstraktion (20 prøver pr batch); (3) I hvert parti DNA-ekstraktion, lige mange CRC væv (10 per batch) og ANT eller CRA væv (10 per portion) blev inkluderet til DNA-ekstraktion; og (4) Disse kontrol-DNA’er blev testet for HPV sammen med den samme batch af DNA ekstrakter. Gennem hele DNA-ekstraktion og HPV test, bemærkede vi to partier af DNA ekstrakter blandt hvilke den positive kontrol ikke viste positivitet for HPV og disse to partier af 40 væv blev derefter genekstraheres til DNA og re-testet for HPV indtil den positive HPV-kontrol var positiv for HPV-test. Men vi ikke observere den negative HPV kontrol viste for at være positiv gennem DNA-ekstraktion og HPV test.

HPV-genotypebestemmelse blev udført ved hjælp af HPV Genotypning Kit, et klinisk diagnostisk produkt af Yaneng Bioscience Co. (kinesiske stat FDA godkendelse nr. 2008-340099) i specielle HPV Genotypning Laboratory inden Yaneng Bioscience Co., der var valgt af det Internationale Agentur for kræftforskning (IARC, WHO) til at udføre forekomsten Undersøgelser af HPV-infektion og cervikal neoplasi i Kina. PCR-reaktionsblanding (25 pi) indeholdt 5 pi genomisk DNA, 20 ul PCR reaktion buffer. Cykling var som følger: Indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter, derefter 40 cyklusser ved 94 ° C i 30 s, 42 ° C i 90 s, 72 ° C i 30 s, og en endelig forlængelse ved 72 ° C i 5 min. En positiv HPV kontrol-DNA blev anbragt på hver hybridisering blot (S1 Fig.). Det omvendte line blot-metode (RLB) blev anvendt på alle prøver med amplificerbart DNA og hybridiseringsbetingelserne var beskrevet tidligere [16,17]. PCR-produkter blev manuelt fyldt på proceduren chip blots og hybridisering blev udført ved automatisering. Pletterne blev oprindeligt læst automatisk og kontrolleres manuelt før rapportering (S1 Fig.). HPV Genotypning Kit var i stand til at opdage 23 HPV-undertyper, herunder 18 højrisiko HPV (HR-HPV) typer (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 83, og MM4) og 5 lav risiko HPV (LR HPV-) typer (HPV 6, 11, 42, 43, og 44) (S1 Fig..) Hver DNA prøve blev triplikerede i 3 gradient koncentrationer på genotypebestemmelse chip klatter og den positive sammentræf sats var 100%. Denne HPV genotypeundersøgelse har en følsomhed detektere 103 kopier af HPV-DNA /ml og en specificitet på 99% baseret på virksomhedens specifikationer. HPV testresultater blev returneret til os og dekodes til at matche patienternes identifikationer før analyse.

Påvisning af Active p-Stat3 og Udtrykt IL-17 Brug Immunhistokemi (IHC) Indhold

Paraffin-indlejrede væv blev snittet i 4-um skiver og blev udført ved hjælp af streptavidinperoxidase metode (SP kit, Zhongshan Golden Bridge Co, Beijing, Kina) IHC analyser. Kort fortalt blev væv slides afvokset og endogen peroxidase blev blokeret med 3% hydrogenperoxid. Efter blokering med normalt gedeserum, primære kanin-anti-humane polyklonale antistoffer mod IL-17 (IL-17A, 1: 200 fortynding, Santa Cruz, CA, USA) og p-Stat3 (1: 400 fortynding, Santa Cruz, CA, USA) blev påført på vævet slides ifølge fremgangsmåderne som tidligere beskrevet [18].

Positive IHC pletter blev defineret som gul-brun farve ifølge fabrikantens demonstrative objektglas (fig. 1). ICH farvede objektglas blev aflæst på et Olympus optisk mikroskop over gul-brun farve pletter i 12 på hinanden følgende felter og afsluttet efter to variable faktorer: (1) at tælle antallet af positivt farvede celler (0 = 5%; 1 = 6% -25%; 2 = 26% -50%; 3 = 51% -75% og 4 = 76% -100%); og (2) at udføre intensiteten af ​​farvning (0 = fraværende, 1 = svag, 2 = moderat, 3 = stærk). Det endelige resultat var et produkt af (1) at multiplicere (2) for individuelle lysbilleder (tabel 1). Dette pointsystem var ens i princippet til en offentliggjort litteratur [19]. Som tabuleret i tabel 1 udtrykte vi endelige farvende scores på følgende måder for enkelhed: negativ farvning som 0 for (-); inkremental positiv farvning som 1+ til (+); 2 + for (++); og 3+ for (+++), hhv.

Seks repræsentative IHC farvning paneler er vist. Antistof-farvning mod p-Stat3 er hovedsageligt lokaliseret i kernen (A, B og C, positiv farvning af gulbrun), mens antistof-farvning mod IL-17 er primært i cytoplasmaet (D, E og F, positiv farvning gulbrunt). A og B kom fra parrede væv fra den samme patient, men C var fra et ubeslægtet væv. D og E kom fra parrede væv fra den samme patient, men F var fra et ubeslægtet væv. Det kan ses, at p-Stat3 er stærkt farvet i CRC (2) (C, scoret som 3+) sammenlignet med et andet CRC (1) (B, scoret som 2+) eller ANT væv (A, scoret som negativ eller 0). Tilsvarende for IL-17, CRC (2) væv (, scoret som 3+ F) sammenlignet med en anden CRC (1) (E, scoret som 1+) men ANT udviser lille eller ingen farvning (D, scoret som negativ viser stærk farvning eller 0). Mikroskopisk forstørrelse er X200 med inserts på X400. ANT = tilstødende normale væv og CRC = kolorektal cancer, hhv.

Statistiske Analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS statistisk programpakke (version 17.0). χ

2 test og t-test blev vedtaget for variansanalyse og korrelation blev analyseret ved hjælp af Spearman rank korrelation metode. Forskelle med

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

HR-HPV infektion er en fælles begivenhed i kinesisk CRC Patienter

I hele hele DNA-ekstraktion og HPV test, bemærkede vi to partier af DNA ekstrakter blandt hvilke den positive kontrol ikke viste positivitet for HPV og disse to partier af 40 væv blev derefter genekstraheres til DNA og re-testet for HPV indtil den positive HPV kontrol var positive for HPV-test. Men vi ikke observere den negative HPV kontrol viste for at være positiv gennem DNA-ekstraktion og HPV test, hvilket tyder på en hensigtsmæssig forvaltning af krydskontaminering under HPV test. HPV-infektion blev påvist i 46/95 af CRC tilfælde (48,4%, 95% CI 38% -58%), hvilket var meget højere end ANT (15/50 eller 30,0%, 95% CI 17% -42%) og colorektale adenomer (CRA, 14/50 eller 28,0%, 95% CI 16% -40%) (tabel 2). Blandt 46 HR-HPV positive CRC tilfælde, 45 (97,8%) blev smittet med HPV 16, mens kun én sag blev smittet med HR-HPV-undertype, HPV53.

Desuden analyserer de 50 CRC væv med parret ANT væv (tabel 2) viste, at hyppigheden af ​​HPV-infektion var også højere i CRC væv (54%, 27/50) end i ANT væv (30%, 15/50, χ

2 = 5,9,

P

= 0,015). Blandt disse 50 parrede sager, 6 sager blev HPV16-positive i både CRC og ANT væv (6 tilfælde, CRC-positive /ANT-positive); 14 tilfælde var HPV-negative i både CRC og ANT væv (14 sager, CRC-negative /ANT-negativ); 21 tilfælde var HPV-positive i CRC, men HPV-negativ i ANT væv (21 tilfælde, CRC-positive /ANT-negativ, 20 HPV16-positive og 1 af HPV53-positive); og de resterende 9 sager var HPV16-positive i ANT væv men HPV16-negativ i CRC væv (9 sager, ANT-positive /CRC-negativ). I form af HPV-infektion, blev ingen sammenhæng fundet mellem de 50 CRC væv og deres parrede ANT væv (r = -0,18,

P

= 0,201). Ovenstående observationer indikerede en kendsgerning, at HPV-infektion var en fælles begivenhed i kinesiske CRC patienter (48,4%), og CRC væv havde en højere frekvens af HPV-infektion end både deres parrede ANT væv (χ

2 = 5,9,

P

= 0,015) samt uparrede ANT væv (χ

2 = 4,6,

P

= 0,033, tabel 2). Hastigheden af ​​HPV-infektion, havde imidlertid ingen forskel mellem 50 ANT væv og 50 CRA væv (χ

2 = 0,05,

P

= 0,826, tabel 2).

To ekstra observationer var interessante: (1) ingen lav risiko blev påvist HPV-undertyper i alle vores testede væv; (2) blandt alle væv stammer fra ANT og CRA, kun fundet vi en enkelt HR-HPV 16 undertype (tabel 2). Desuden er alle HPV-inficerede væv var positive for enlige HPV-undertyper og ingen væv blev fundet positive for dobbelte eller flere infektioner af HPV-undertyper. Blandt 50 tilfælde af kolorektale adenomer (CRA), blev der ingen forskelle i hyppigheden af ​​HPV 16 infektion bemærket mellem 3 CRA undertyper af rørformede, villøs-rørformet, og villøse adenomer (χ

2 = 1,2,

P

= 0,543, tabel 2).

HPV infektion korrelerer med sent Kliniske Stadier af CRC

for at forstå, om HPV-infektion ville påvirke patienternes klinisk-patologiske karakteristika, vi undersøgte mulige konsekvenser af HPV-infektion på en række af klinisk-patologiske karakteristika, herunder alder, køn, tumorplacering, histologisk klassificering, lymfe metastase, klinisk stadieinddeling [20] blandt andre. Analyserne viste sig at vise, at HPV-infektion korreleret med sent eller dårligere klinisk iscenesættelse af III + IV (tabel 3). Desuden mere detaljerede analyser af HPV-infektion mod kliniske faser i størrelsesordenen I + II vs III eller IV eller III + IV viste trinvise forskelle som defineret af

P

værdier (I + II vs III,

P

= 0,058; I + II vs IV,

P

= 0,034; I + II vs III + IV,

P

= 0,028, henholdsvis). Fordi kliniske stadier III + IV blev defineret som havende positiv metastase enten lymfeknude eller til andre fjerntliggende organer, foreslog de ovennævnte korrelationer en mulig rolle af HPV-infektion i progressionen og metastase af CRC. Blandt de 50 parrede ANT væv, vi ikke overholdt eventuelle sammenhænge mellem HPV-infektion og klinisk-patologiske egenskaber som vist i tabel 3 herunder celledifferentiering, metastase, klinisk iscenesættelse blandt andre analyserede (data ikke vist).

konstitutivt Overaktiv p-Stat3 og Overekspression af IL-17 cytokin i CRC

Som vist i fig. 1, blev p-Stat3 antistof lidt farvet i ANT væv (A, scoret som 0), imidlertid kraftigt farvet i CRC væv (C, scoret som 3+). Tilsvarende IL-17 antistof havde ingen farvning i ANT væv (D, scoret som 0), men viste stærk farvning i CRC væv (F, scoret som 3+). Overaktiv p-Stat3 og overudtrykt IL-17 i CRC var tydelige sammenlignet med ANT i hele kohorten. Som tabuleret i tabel 4, sammenlignede vi tre kategorier af positiv farvning kombinationer (1+, 2 + /3 +, og 1 + /2 + /3 +, henholdsvis) med negativ farvning (0) for p-Stat3 og IL-17 , henholdsvis. Generelt markant flere CRC væv viste aktiv p-Stat3 end ANT væv (1 + /2 + /3 + vs 0: 95,8% vs. 76,7%,

P

0,001). Forskellene var særligt indlysende for en stærk aktiv p-Stat3 (2 + /3 + vs 0: 50,5% vs. 18,9%,

P

0,001). For IL-17, på den anden side, dette fænomen (se tabel 4) blev slående lighed med p-Stat3 ved, at mange flere CRC væv udviste kraftig ekspression af IL-17 end ANT væv (2 + /3 + vs 0: 45.3 % vs 22,2%,

P

. 0,001)

for at undersøge generelle forskelle mellem CRC og ANT for deres STAT3 aktiviteter og IL-17 niveauer, sammenlignede vi puljede IHC scoringer fra alle personer testet for p-Stat3 og IL-17 under anvendelse af t-test. Som vist i fig. 2, panel A, konstitutiv p-Stat3 var signifikant højere i CRC væv end i ANT væv (M ± SD, 4,5 ± 3,0 vs 3,1 ± 2,5,

P

= 0,001). Meget på samme måde, IL-17 niveauer var også højere i CRC væv end i ANT væv (M ± SD, 5,0 ± 2,7 vs 3,3 ± 2,4,

P

0,001). Disse observationer, fra en anden vinkel, støttede observationerne som vist i tabel 4, indikerer en betændt mikromiljø i tumorvæv. På den anden side, panel B i fig. 2 viste et fænomen, CRC faktisk havde mere individuelle væv med stærk farvning (2 + /3 + positiver) for både p-Stat3 (

P

0,001) og IL-17 (

P

0,001), igen i overensstemmelse med observationerne som vist i tabel 4 (2 + /3 + positiver). Den procent af personer med svag farvning (1+ positiver) var imidlertid ikke forskellig mellem CRC og ANT væv til enten p-Stat3 (

P

= 0,07) eller IL-17 (

P

= 0,25).

(A) på grundlag af scoring kriterier (tabel 1), er pooled scorer for p-Stat3 eller IL-17 sammenlignet mellem CRC og ANT individer bruge t-test og data udtrykkes som middelværdi ± standardafvigelse (M ± SD). Som det ses, konstitutiv p-Stat3 er højere i CRC end i ANT (M ± SD, 4.5 ± 3.0 vs 3,1 ± 2,5,

P

= 0,001). Ligeledes udtrykte IL-17 er også højere i CRC end i ANT (M ± SD, 5,0 ± 2,7 vs 3,3 ± 2,4,

P

0,001). (B) Sammenligning mellem CRC og ANT for antallet af individer (%) med varierende farvning intensiteter hjælp χ

2 test. Som vist for p-Stat3, CRC kategori har mindre individer scoret som 0 end ANT kategori (4,2% vs. 23,3%,

P

0,001). Tværtimod CRC har mange flere individer scoret som stærkt positive (2 + /3 +) end ANT (50,5% vs. 18,9%,

P

0,001). Et slående lighed er sandt for IL-17, hvoraf CRC kategori har mindre individer scoret som 0 end ANT kategori (2,1% vs. 16,7%,

P

0,001), men igen, CRC har mange flere individer scoret som stærkere positiver 2 + /3 + end ANT (45,3% vs 22,2%,

P

0,001). For både p-Stat3 og IL-17, farvning intensitet svag positivitet (1+) er ikke signifikant forskellig mellem CRC og ANT kategorier (

P

= 0,07 og

P

= 0,25, henholdsvis ). ANT indikerer tilstødende normale væv og CRC skildrer kolorektal cancer, hhv.

Det var en gådefuldt fænomen, som vi ikke har overholdt eventuelle sammenhænge af enten p-Stat3 aktiviteter eller IL-17 niveauer med klinisk-patologiske karakteristika blandt disse CRC patienter, herunder celledifferentiering, metastase, klinisk stadieinddeling bl.a. analyseret (tabel 5). Desuden er vi også tilsidesat eventuelle korrelationer af p-Stat3 aktiviteter eller IL-17 niveauer med klinisk-patologiske karakteristika blandt de 50 parrede ANT væv henholdsvis (data ikke vist). Disse resultater kan muligvis foreslå en tidlig inddragelse af Stat3 signalvejen i patogenesen af ​​CRC.

HPV Infektion korrelerer med p-STAT3 Aktiviteter og IL-17 Niveauer

For at undersøge om HPV infektion ville spille en rolle i at orkestrere en tumor miljø med øget aktiv Stat3 og IL-17 niveauer, vi gennemførte bivariate correlational analyser. I CRC, som vist i tabel 6 blev stærke positive korrelationer afslørede mellem HPV-infektion og aktiveret Stat3 niveauer (r = 0,38,

P

0,01); mellem HPV-infektion og IL-17 niveauer (r = 0,33,

P

0,01); og mellem p-Stat3 og IL-17 niveauer (r = 0,44,

P

0,01). Imidlertid blev disse sammenhænge blandt HPV-infektion, p-STAT3 niveauer, og IL-17-niveauer ikke eksisterende i ANT væv (r = 0,05, 0,06, og -0,07, henholdsvis med

P

0,05).

diskussion og konklusioner

den nuværende paradigme er, at immunsystemet og mikrobiota gensidigt interagerer at opretholde homøostase i den menneskelige tarm. komponenter af mikrobiota kan dog ændre denne ligevægt og fremme kronisk inflammation, yderligere næring tumorudvikling [4]. Blandt dem, for det meste rapporteret er John Cunningham virus (JC-virus), BK-virus, human cytomegalovirus (CMV), human papillomavirus (HPV, især type 16 og 18) [21].

High-risk HPV (HR -HPV) infektion er den væsentligste årsag til livmoderhalskræft og HPV-vaccination effektive i forebyggelsen livmoderhalskræft [22]. Interessant nok har HPV-infektion også blevet fundet i mange ikke-livmoderhalskræft. For eksempel har flere meta-analyser i kolorektale adenomer og adenocarcinomer har rapporteret, at blandt 2.630 adenocarcinomer niveauer af geografiske regioner, er HPV-infektioner viser sig at være den højeste i patienter fra Sydamerika (45,1%), Asien (39,2%), og den Mellemøsten (32,2%) [23,24]. Andre metaanalyser har også rapporteret HPV-infektioner i kræft i æggestokkene [25], blære [26], lunge [27] og bryst [28]. Disse resultater indikerer en kendsgerning, at HPV-infektion er en almindelig begivenhed i mange typer af cancere, hvilket antyder inddragelsen af ​​HPV i patogenesen af ​​ikke-livmoderhalskræft herunder colorectal cancer. I vores patientgruppe, har vi observeret en høj forekomst af HR-HPV-infektioner i CRC patienter (46/95 eller 48,4%), blandt hvilke 45 CRC tilfælde er positive for HPV 16 (45/46 eller 97,8%), og kun en enkelt sag er inficeret med HR-HPV53.

Derudover har vi også testet HPV-infektioner i andre kræftformer og fandt ganske forskellige frekvenser af HPV-infektion. For eksempel, 10,5% af HPV-infektion var i brystkræftpatienter (manuskript indsendt); 48,4% i CRC patienter (denne undersøgelse); og 90,4% i livmoderhalskræft kræftpatienter (manuskript under udarbejdelse). Vores observerede frekvenser af HPV-infektion i disse kræftformer er generelt i overensstemmelse med de fleste offentliggjorte rapporter, hvilket tyder kvaliteten og pålideligheden af ​​HPV genotype anvendte metode her.

Så vidt vi ved, er dette den højeste forekomst af HPV-infektion observeret i kinesisk CRC, der tyder på potentiel forebyggende HPV-vaccination [22] blandt højrisiko-individer i Xinjiang-provinsen, hvor disse CRC patienter blev diagnosticeret. En praktisk tilgang til at bevise denne hypotese er at følge op på de unge piger og drenge, der er vaccineret med HPV-vacciner for at se, om de har en reduceret forekomst af CRC i et prospektivt langsigtet epidemiologisk observation.

Der er flere forslag som hvordan HPV inficerer rektum og kolon. Nogle visningen som HPV kan muligvis rejse opad fra forplantningskanal til endetarmen og nederste halvdel af faldende kolon [29]. Andre, derimod, har rapporteret om sammenslutninger af HPV-DNA med tumor steder, herunder stigende, tværgående, faldende eller sigmoid colon og rektum [7,30]. Et flertal af rapporter foreslå, at HPV kan rejse gennem blodcirkulationen at inficere tyktarm og endetarm [6,31,32,33,34]. I vores CRC patienter har vi kun observeret en korrelation af HPV-infektion med sen klinisk udvikling CRC (I + II vs III + IV, 44,2% vs. 88,8%,

P

= 0,028), men ikke med nogen anden klinisk-patologiske funktioner, herunder tumor sites (colon vs endetarmen) (tabel 3). Alligevel rute for HPV-infektion i colorectum er uklart, hvilket kræver yderligere undersøgelse. På den anden side, vor iagttagelse på HPV-infektion antyder en mulighed, at, under cancer progression, kan immunologisk og metabolisk kompromitterede patienter med mere fremskredet CRC inducere opportunistisk virusreplikation blast i ellers latent HPV-infektion, som kan føre til øget kopital af HPV detekteres i tumorstedet. Denne opportunistisk HPV-infektion kan yderligere udløse aktivering af Stat3 signaleringen og efterfølgende ekspression af proinflammatoriske cytokiner såsom IL-17 i tumormikromiljøet.

Faktisk konstitutivt aktiveret Stat3 (p-Stat3) øges betydeligt i CRC væv end i det tilstødende normale væv eller ANT (fig. 1), især de stærke positive af p-Stat3 farvning (50,5% i CRC vs. 18,9% i ANT, fig. 2 og tabel 4). Tilfældigvis, det udtrykte IL-17 følger trinnene p-Stat3 at vise et meget højere niveau i CRC end den, ANT (45,3% i CRC vs. 22,2% i ANT, fig. 2 og tabel 4). De stærke p-Stat3 aktiviteter og høje IL-17 niveauer i CRC end i ANT bekræftes af to sammenligning strategier: Den ene er forskellene i puljede IHC score (figur 2A.), Og den anden, forskellene i procentdele af de enkelte væv ( fig. 2B). Til støtte for vores ovenstående observationer er studier i andre kræftformer såsom æggestokkene, bryst, spiserøret, gastrisk kræft og kutant T-celle lymfom [35,36,37,38,39]. En forvirrende observation har været, at i modsætning til HPV-infektion (tabel 3), enten p-Stat3 aktiviteter eller IL-17-niveauer har undladt at korrelere med eventuelle klinisk-patologiske træk ved CRC (tabel 5). Der er to muligheder. Den ene er, at HPV-medieret Stat3 aktivering kun kan være involveret i den indledende orkestrering af tarmbetændelse og carcinogenese og derefter passerer relæet til andre inflammatoriske signalveje såsom NF-KB [4], der kan være involveret i den videre udvikling af CRC. Den anden kan skyldes vores prøve størrelse, der ikke er stor nok til at opfange eventuelle forskelle, blandt disse kliniske træk.