PLoS ONE: zoledronsyre Bevarer knoglestruktur og Øger Survival, men begrænser ikke Tumor Forekomst i en prostatakræft knoglemetastaser Model

Abstrakt

Baggrund

bisphosphonat, zoledronsyre (ZOL), kan inhibere osteoklaster, der fører til nedsat osteoklastogenese og osteoklast aktivitet i knoglevæv. Her anvendte vi en blandet osteolytiske /osteoblastiske murin model af knogle-metastatisk prostatacancer, RM1 (BM), at bestemme, hvordan inhibering osteolyse med ZOL påvirker evnen af ​​disse celler til at etablere metastaser i knogler, integriteten af ​​de tumorbærende knogler og overlevelsen af ​​de tumor-bærende mus.

Metoder

modellen indebærer intrakardial injektion for arteriel formidling af RM1 (BM) celler i C57BL /6 mus. ZOL behandlingen blev givet via subkutane injektioner på dag 0, 4, 8 og 12, ved 20 og 100 ug /kg doser. Bone integritet blev vurderet ved mikro-computertomografi og histologi med sammenligning med ubehandlede mus. Osteoklast og osteoblast-aktivitet blev bestemt ved at måle serum tartratresistent syrephosphatase 5b (TRAP 5b) og osteocalcin, hhv. Musene blev aflivet efter forudbestemte kriterier og overlevelse blev vurderet ved hjælp af Kaplan Meier-kurver.

Resultater

Micro-CT og histologisk analyse viste, at behandling af mus med ZOL fra den dag, intrakardial injektion af RM1 (BM) celler hæmmede tumor-induceret knogle lyse, fastholdt knogle volumen og reducerede forkalkning af tumor-induceret endochondral osteoid materiale. ZOL behandling førte også til en nedsat serum osteocalcin og TRAP 5b niveauer. Derudover viste behandlede mus øget overlevelse sammenlignet med vehikelbehandlede kontroller. Desværre fik ZOL behandling ikke hæmmer celler evnen til at metastasere til knogle som antallet af knogle-metastaser var ens i begge behandlede og ubehandlede mus.

Konklusioner

ZOL behandling, betydelige fordele for at opretholde integriteten af ​​tumorbærende knogler og forøget overlevelse af tumorbærende mus, selv om det ikke forhindrede etablering af knogle-metastaser i denne model. Fra den mekanistiske opfattelse bekræfter disse observationer, at tumor-induceret knogle lyse er ikke et krav for etablering af disse knogletumorer

Henvisning:. Hung TT, Chan J, Russell PJ, Power CA (2011) zoledronsyre Bevarer knoglestruktur og Øger Survival men begrænser ikke Tumor Forekomst i en prostatakræft knoglemetastaser Model. PLoS ONE 6 (5): e19389. doi: 10,1371 /journal.pone.0019389

Redaktør: Wafik S. El-Deiry, University of Pennsylvania, USA

Modtaget: Februar 13, 2011; Accepteret: 28 marts 2011; Udgivet: May 16, 2011

Copyright: © 2011 Hung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne ønske at erklære, at dette arbejde blev finansieret delvist af en forskningsbevilling fra Novartis Australien. Novartis gav også den zoledronsyre til denne undersøgelse. TH blev delvist støttet af prostatakræft Foundation of Australia. CAP blev delvist finansieret af Sydney Foundation of Medical Research og er en fyr for National Imaging Facility, Australien. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Projektet blev delvist finansieret af en forskningsbevilling fra Novartis Australien. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Nogle primære kræftformer har en høj tilbøjelighed til at metastasere til knogle, men årsagerne til dette er fortsat uklare, selv om det er almindeligt accepteret, at væksten af ​​de fleste kræftformer i knogler er afhængig af faktorer i knoglen mikro-miljø. Tumorceller kan fremkalde proliferation og aktivering af knogleceller gennem frigivelse af vækstfaktorer og denne stigning i aktiviteten forårsager yderligere stimulering af kræftceller i hvad der er blevet kaldt en “ond cirkel” [1]. Bone engagement er almindelig i prostata og brystkræft og myelom, og mens brystkræft og myelom knogle-metastaser er overvejende osteolytiske, der involverer øget osteoklastaktiviteten fører til knogle erosion, prostatakræft knoglemetastaser sager er heterogene, der involverer både knogle lytiske og sklerotiske effekter [ ,,,0],2]. I osteolytiske læsioner, kan cancerceller producerer cytokiner, der fremmer osteoklastdifferentiering direkte [3], [4] og indirekte gennem stimulering af stromale knoglemarvsceller til at fremme osteoklastogenese [5]. Tilsvarende kan tumorceller producere cytokiner, der fremmer osteoblastaktiviteten og inducere knoglevækst [6] og osteoblaster kan fremkalde kræft udvikling og progression [7], [8], [9]. Samspillet mellem tumorceller og knogleceller diktere knoglen metastatisk fænotype.

Zoledronsyre (ZOL) og andre bisfosfonater (BP) hæmmer metastase og vækst af knogle-resident tumorer gennem hæmme osteoklastfunktion. Således ZOL inhiberer knogle-destruktive virkninger af tumoren, og den resulterende inhibering af knogleomsætning også forsinker den onde cirkel, hvilket resulterer i et fald i ikke-udbenet tumorstørrelse og, i nogle tilfælde, at antallet af knoglelæsioner i forskellige dyremodeller af osteolytiske knoglekræft [10]. Imidlertid har der været modstridende rapporter om virkningerne af ZOL på osteoblastiske knogle tumorer. Mens ZOL behandling ikke inhiberer intraossøse vækst af osteoblastiske cellelinie LAPC-9 [11], væksten af ​​intra-tibiale LuCaP 23.1 celler inhiberes af ZOL [12]. En efterfølgende undersøgelse antydede, at tumor-medieret osteolyse ikke er nødvendig for osteoblastiske metastaser [11].

Her bruger vi en blandet osteolytiske /osteoblastiske syngen musemodel for prostatakræft metastaser til knogler, den RM1 knogle metastatisk (BM) model [13] for at vurdere virkningen af ​​ZOL behandling på

etablering

af knoglemetastaser, integriteten af ​​tumor-bærende knogler og den samlede overlevelse af mus.

RM1 (BM) celler injiceres ind i venstre ventrikel af hjertet resultat i multiple knoglemetastaser med få bløde væv tumorer. Vi viser, at hæmning af osteolyse med ZOL behandling ikke påvirker forekomsten af ​​knoklet tumorer. Alligevel ZOL behandling gjorde øge overlevelsen af ​​mus på en måde, er dosisafhængig. Vigtigst ZOL behandling sænkede også lytiske virkninger af RM1 (BM) tumorer på knogler som bedømt ved histologi og mikro-computertomografi (mikro-CT) analyse, og synes at inhibere forkalkning af tumorinduceret endochondral knogle, men ikke osteoid dannelse. Vi har ikke afgøre, om ZOL påvirket størrelse eller vækst kinetik tumorer. Forsøgene præsenteret her beskæftiget inden for hjerte-injektion, som ikke forårsager knogle skader direkte og den deraf metastatiske foci i disse forsøg vil sandsynligvis involvere relativt få celler. Således etablering af metastaser fra enkelte celler eller små klynger af celler, en betingelse mere tilbøjelige til at afspejle naturlige metastatiske begivenheder, ikke nødvendigvis kræver indledende lytiske betingelser.

Resultater

I RM1 (BM ) knoglemetastaser model, ZOL behandling havde en signifikant virkning på overlevelsen af ​​mus sammenlignet med ubehandlede mus (Figur 1). Samlet var der en tendens til øget overlevelse med øget dosis (p = 0,012). Overlevelse af mus i 100 ug /kg dosis var signifikant forskellig fra den for køretøjet behandlede gruppe (p = 0,031), mens 20 ug /kg dosis ikke nåede en statistisk signifikant forskel fra kontrolgruppen med det antal stikprøver anvendes i disse eksperimenter (p = 0,108). Den mediane overlevelsestid for køretøj og, 20 ug /kg ZOL- og 100 ug /kg ZOL-behandlede mus var 14,5, 18,5 og 20 dage henholdsvis.

(A) Kaplan-Meier overlevelse plot af mus givet en intra-arteriel injektion af RM1 (BM) celler efterfulgt af behandling med 100 ug /kg eller 20 ug /kg zoledronsyre doseringsregimer eller køretøjet som beskrevet i Materialer og Metoder. Den log rank test for tendens viser en tendens til forøget overlevelse med stigende dosis (p = 0,012), og en signifikant forskel i overlevelse mellem mus i 100 ug /kg dosisgruppen vs køretøj kontrolgrupperne (p = 0,031, efterfulgt Kaplan-Meier af Breslow parvis sammenligning i SPSS 17.0)

osteocalcinniveauer var generelt lavere i tumor-bærende mus, selvom forskellen var ikke statistisk signifikant og behandling af disse mus med 20 (p. 0,01) eller 100 ug /kg (p 0,01) af ZOL yderligere reduceret serum osteocalcin sammenlignet med normale kontroller (figur 2A). Serum TRAP 5b niveauer af tumor-bærende, ubehandlede mus lignede dem af kontrollerne. Men behandling med 20 eller 100 ug /kg ZOL sænkede serum TRAP 5b til mindre end 40% af kontrolmusene og dem givet RM1 (BM) celler kun (P 0,001, figur 2B).

(A) Niveauer af osteoblast markering, blev osteocalcin reduceret i serum af zoledronsyre behandlede mus. (B

)

tartrat-resistent syrephosphatase 5b, en indikator for osteoklast aktivitet, blev også reduceret med behandling. Punkter på grafen repræsenterer serumniveauer for individuelle mus mens Søjlerne viser positionen af ​​de midler inden for hver gruppe. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af envejs ANOVA til analyse efterfulgt af Tukey post test. *** P. 0,001

Tilstedeværelsen af ​​tumor læsioner i mus blev evalueret ved to midler, fluorescens billeddannelse til grønt fluorescerende protein (GFP) udtryk ved tumorceller efterfulgt af bekræftelse med histologi som beskrevet [ ,,,0],13]. Den RM1 (BM) cellelinie var følsom over for Zol behandling

in vitro

(data ikke vist), men behandlingen havde ringe effekt på forekomsten af ​​bløddelene eller knogletumorer i denne model. ZOL behandling reducerede ikke antallet af benede læsioner eller antallet af tumor-metastaser i blødt væv i RM1 (BM) injiceret mus (Figur 3A-C). Vi har ikke vurdere effekten af ​​ZOL behandling på væksten af ​​etablerede tumorer.

(A) Samlet antal metastaser, (B) knogle-metastaser, eller (C) blødt væv metastaser som vurderet af en- ANOVA. Hvert punkt repræsenterer antallet af metastaser i en individuel mus, streger indikerer medianen i gruppen.

Rekonstruerede tredimensionelle billeder af knogler fra mikro-CT og repræsentativ H og E farvede histologiske snit er vist i figur 4 og 5. Snittene blev også farvet med tetraCHROME plet [14] at skelne ny knogle udvikling fra etableret /forkalket knogle (figur 6). Mus med metastatiske knoglelæsioner i de lange knogler viste signifikant knogle lysis, især i nærheden af ​​epifyseskivernes, med en reduktion i trabekulær knogle (figur 4B) sammenlignet med de normale kontroller (figur 4A). Den lytiske effekt af tumoren reduceres i 20 ug /kg ZOL behandlingsgruppe (figur 4C) og måske mere i mus indgivet 100 ug /kg ZOL (figur 4D). De mikro-CT resultater bekræftes af de histologiske resultater (figur 5 og 6), der viser normale trabekulær knoglestruktur i de ubehandlede kontrol mus (figur 5A, 5B og 6A), men beviser af både lytiske og sklerotiske virkninger i den ubehandlede tumor-bærende knogler (figur 5C, 5D og 6b). ZOL behandling ved 20 ug /kg konserveret trabekulær struktur i tumorbærende ben (fig 5E, 5F og 6C) og 100 ug /kg dosis forøget trabekulær knogle (figur 5G, 5H og 6D). Stigningen i tumorinduceret endochondral trabekulære knogledannelse er særlig tydelig i zol-behandlede mus (figur 5E og 5G) grund af den samtidige inhibering af tumor-induceret lyse. Men ufuldstændig mineralisering af trabekulær knogle osteoid nær epifysale pladen er tydeligt i de Zol-behandlede tumor-bærende knogler (Figur 6C og 6D)

MicroCT scanninger af mus lårben og skinneben.; normal kontrol (A), RM1 (BM) tumorbærende (B), RM1 (BM) tumorbærende behandlet med 20 ug /kg ZOL regime (C), RM1 (BM) tumorbærende behandlet med 100 ug /kg ZOL regimen (D)

H B) og RM1 (BM) tumorbærende ben (C-H); Typiske eksempler på knogler fra ubehandlede mus (A-D) og mus behandlet med 20 ug /kg ZOL (E F) eller 100 ug /kg ZOL (G H) er vist. T = tumor, Pil = trabekelknogle.

tetraCHROME pletten for differentiering af mineraliseret og unmineralised knogle ved 120x forstørrelse Normal (A), eller RM1 (BM) tumor bærende knogler (B-D). (A B) Ubehandlet, (C) 20 ug /kg ZOL (D) 100 ug /kg ZOL. T = tumor, Pil = trabekelknogle.

Kvantitativ analyse af mikro-CT-data tyder på, at der ikke var nogen signifikant ændring i overfladearealet af knoglerne i normal, tumor-bærende eller behandlede ben (figur 7A). Den primære effekt af tumoren er reduktionen i knoglevolumen (p 0,01, figur 7B) og deraf følgende stigning i knoglen-overfladeareal: forholdet knogle-mængden i tumorbærende ben (p 0,001, figur 7C), mens zol behandlinger resulterer i en stigning i knogle- volumen (p 0,001, figur 7B) og et fald i knogle-overfladeareal:. knogle-volumen-forholdet (p 0,001, figur 7C) af tumorbærende knogler

der var ingen signifikant ændring i knogle overfladeareal (a) induceret ved tilstedeværelsen af ​​en tumor eller behandling med zoledronsyre. Imidlertid blev knoglevolumen drastisk reduceret i RM1 (BM) indeholder ben og behandlingen med ZOL forhindret dette tab på en dosis-afhængig måde (B), hvilket resulterer i lavere overfladeareal /volumen-forhold (forøget knogletæthed) sammenlignet med normale eller tumor -fyldt knogler (C). Resultater er baseret på målinger opnået fra CT-scanninger, som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Statistisk analyse blev udført ved envejs ANOVA efterfulgt af Tukey post test, * p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001

Diskussion

Når. injiceret ved intrakardielle rute, RM1 (BM) cellelinje inducerer multiple knoglemetastaser med relativt få (og relativt små) tumorer i blødt væv [13]. At bemærke er den observation, at de resulterende knoglemetastaser ikke viser præference for bestemte steder i skelettet, hvor høj knogleomsætning opstår, hvilket indikerer, at høj knogleomsætning ikke er nødvendige for etablering af metastaser. Desuden de resulterende knoglemetastaser har blandede osteolytiske og osteoblastiske tegn med hverken fænotype dominerende [13]. Vi bestemt, at intra-hjerte-injektion af RM1 (BM) celler er en fremragende model til vurdering af, om ZOL kunne hæmme etableringen af ​​tumorer metastaser, som ikke var afhængig af lytisk vækst, der er, den onde cirkel. Vi vurderede også vanskeligt for ZOL behandling for at inhibere tumorinduceret osteolyse og endochondral knogledannelse og bestemmes indflydelsen af ​​behandlingen på den samlede overlevelse af mus.

Ligesom andre nitrogenholdige BP’er, ZOL inducerer apoptose i osteoklaster ved inhibering af enzymer i den mevalonat-vejen og forhindrer isoprenylering af små GTP-bindende proteiner, såsom Ras og Rho [15], [16].

In vivo

, BPs binder med høj affinitet til knogle hydroxy-appatite og dermed er afsondret af aktive osteoklaster i høje koncentrationer, hvilket fører til osteoklast apoptose. Selv om en række andre mekanismer, herunder direkte drab af kræftceller, hæmning af angiogenese og aktivering af γδT celler [17], [18], er blevet påvist for ZOL, dens virkning på osteoklaster er fortsat det vigtigste mekanisme, hvormed ZOL hæmmer knoglekræft i henhold til gældende behandlingsregimer. Fordelen for patienten er potentielt dobbelt: ZOL inhiberer osteoklastisk medieret lyse induceret af tumoren og så afbryder den onde cirkel og efterfølgende fremme af tumorvækst. Dette er sikkert rigtigt af osteolytiske tumorer, men effekten af ​​ZOL behandling på tumorer, der ikke er afhængige af knogle lysis er dårligt forstået.

Behandling af tumor-bærende mus med ZOL forlængede overlevelsen af ​​mus i vores undersøgelse ( Figur 1). Ved en dosis på 100 ug /kg, er der en statistisk signifikant stigning i overlevelsestiden sammenlignet med bærerbehandlede mus og en tendens til øget overlevelse i de 20 ug /kg behandlede mus. Lignende resultater er blevet rapporteret for andre syngene kræftmodeller [7], [8], [9]. Men i osteolytiske modeller af myelomatose [10] og brystkræft [8], signifikant reduktion i etablering af knogle- metastatiske læsioner blev observeret, men dette er ikke tilfældet for vores system (figur 3). Vi har vist tidligere [13], at RM1 (BM) -celler metastasere til de fleste steder i skelettet og således metastase af disse celler til benede steder synes at være uafhængig af knogle omsætningshastigheder. Således er vi ikke overraskede over, at hæmning af knogle lyse ved ZOL behandling ikke har nogen påviselig effekt på etablering af tumorer i knogler. Disse resultater tyder på, at forkærlighed for RM1 (BM) celler for knogle er afhængig af andre faktorer, potentielt et øget homing til benede sites eller afhængighed af faktorer uafhængige af knogle lysis. Selv om dette er en blandet osteolytiske /osteoblastiske model, resultaterne er i modsætning til de af Corey [12], men ligner opnåede resultater af osteoblastiske celler linje, LAPC-9 [11].

Vi har vurderet koncentrationerne af to knogleomsætningsmarkørerne, osteocalcin (udskilles af osteoblaster) og TRAP 5b (produceret af osteoklaster) i serum af eksperimentelle mus. ZOL behandling nedsætter serumniveauerne af begge disse markører (figur 2), hvilket indikerer, at ZOL har hæmmede både osteoklast og osteoblastaktiviteten på det systemiske niveau. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere rapporter om nedsat osteocalcin i brystkræftpatienter [19] og en TRAP 5b fald i mus [20] efter behandling med ZOL. Det fund, at både osteoblast og osteoklast aktivitet forringes tyder på, at den observerede stigning i knoglevolumen og overfladeareal med ZOL behandling (figur 7) er et resultat af reduceret osteoklastaktivitet, snarere end øget osteoblastaktiviteten. Vi vurderer dog, det særligt interessant, at de osteocalcin-niveauer i serum er nedsat hos ZOL behandlede tumorbærende mus ledsager med iagttagelsen af ​​øget endochondral osteoid dannelse i disse mus (figur 5 F og H). Vigtigt er det, den nye osteoid materiale observeret i zol behandlede mus forekommer stort set un-forkalket (figur 6C og 6D), især ved den høje dosis (figur 6D), på det tidspunkt, når musene blev dræbt hvilket tyder på en afkobling af osteoid udvikling og forkalkning trin knogledannelse. Af relevans er den iagttagelse, at osteocalcin-deficiente mus har forøget knogledannelse [21]. Faldet i trabekulær knogle forkalkning med øget i ZOL dosis er en roman fund og synes at modsige den omfattende eksisterende litteratur om virkningerne af bisfosfonater på knogler. Men vi viser også, at ZOL behandling af tumorbærende mus øger knoglevolumen af ​​muse ben knogler (figur 7B), hvilket understøtter tidligere resultater. I lignende prækliniske undersøgelser vha c4-2 [21] og LuCaP 23.1 [22] xenograftmodeller blev ZOL behandling også vist sig at øge den samlede knoglevolumen. Således faldt mineralisering af nydannet trabekulær knogle observeret her er konsistent med en samlet bevarelse af eksisterende mineraliseret knogle i tumorbærende mus. Disse virkninger af ZOL at opretholde knogle integritet er forbundet med øget overlevelse i ZOL behandlede mus.

Virkningerne af ZOL på knoglestrukturen måske eller måske ikke direkte påvirke progression af kræft, men forebyggelse af unormal knogle modellering i en tumor-redet knogle kan være nøglen til at Zol reducere risikoen for skelet relaterede komplikationer og forlænge den tid, at skeletrelaterede hændelse hos patienter med knogle-metastatisk prostatacancer [23], [24]. Desuden ZOL behandling har stor betydning for håndtering af smerte reduktion i klinikken. BPs forbedre knoglestrukturen hos patienter, med en større reduktion i relaterede smerter [25], [26], [27], som er blevet tilskrevet re-forkalkning af knoglen, der har ført til et fald i smertestillende forbrug. Af relevans er observationen i myelomatose (en osteolytisk sygdom) patienter, nedsat osteocalcinniveauer, som rapporteret her, var relateret til reduktion i skeletrelaterede hændelser [28]. Behandling med zoledronsyre er en effektiv terapi til blandet osteoblastiske /lytiske tumorer da det øger overlevelsen af ​​behandlede mus. Behandlingen inhiberer knogle lysis og reduceret osteoklastaktivitet som forventet. ZOL behandling reducerede også serumniveauer af osteocalcin, men hæmmede ikke tumorinduceret endochondral osteoid formation selvom det delvist hæmmede efterfølgende forkalkning af denne osteoid materiale på en dosis-afhængig måde. ZOL ikke reducere hyppigheden af ​​metastaser der indikerer, at selv om RM1 (BM) tumorer fremkalde knogle lyse, etablering af tumorer er ikke afhængig af lytisk vækst.

Materialer og metoder

Etik erklæring

The University of New South Wales Animal Care og etiske komité godkendt dyr anbringelse, pasning og alle eksperimentelle procedurer udført på dyr forud for eksperimenter (Project ansøgning godkendelsesnummer: 05 /120B). Musene blev overvåget nøje (dagligt) og aflivet i henhold til foruddefinerede kriterier (tab på 20% af kropsvægten, betydeligt tab af tilstand, eller delvis lammelse), som er godkendt af dyreetik.

Cell kultur

RM1 celler blev opnået fra Dr. T Thompson, Baylor College, og RM1 (BM) blev udviklet af seriepassage af RM1

in vivo

[13]. Begge cellelinier blev dyrket under standardbetingelser (37 ° C i en CO 5%

2 inkubator) i DMEM (Invitrogen, Melbourne, Australien) med 10% FBS (Invitrogen) og L-glutamin (Invitrogen).

surrogatmarkører for knoglemetastaser i Serum

Sera fra tumor-celle injicerede mus og normale kontrol mus indsamlet ved obduktion ved hjertepunktur blev vurderet for tilstedeværelsen af ​​surrogatmarkører for knoglemetabolisme. Utilstrækkelig serum var tilgængelig fra nogle mus til vurdering surrogatmarkører. Osteocalcin-indholdet blev vurderet ved anvendelse af et osteocalcin enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA) (Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA) ifølge producentens instruktioner. Tartrat-resistent syrephosphatase (TRAP) 5b koncentration blev bestemt ved Mousetrap assay (Suomen Bioanalytikka Oy, Turku, Finland) som forbudte i kittet. Serum protein niveauer blev bestemt ved sammenligning med en standardkurve fremstillet af standarder, der er fastsat med analyserne.

Dyr

5-6 uger gamle C57BL /6 mus blev opnået fra Animal Resource Centre (Adelaide , Australien). De blev opstaldet og vedligeholdes på Center Biologiske Ressourcer, Little Bay, NSW. På dag 0 for eksperimentet, blev musene injiceret med enten på 3 × 10

4 RM1 (BM) celler i saltvand eller saltvand alene (100 pi) i den venstre ventrikel i hjertet. Mus blev behandlet på dag 0, 4, 8 og 12 via subkutan injektion af enten 20 ug /kg eller 100 ug /kg af zoledronsyre (Novartis Pharmaceuticals, Australien) eller saltvand (vehikel). Den kumulative dosis, 20 ug /kg svarer til en omtrentlig enkelt dosis på 4 mg i patienter. Musene blev overvåget nøje og aflivet i henhold til foruddefinerede kriterier (tab på 20% af kropsvægten, betydeligt tab af tilstand, eller delvis lammelse), som er godkendt af dyreetik. Antallet af tumorer i hver mus blev bedømt ved GFP-fluorescens (som tidligere beskrevet [13]) ved obduktion efterfulgt af histologi. Tilstedeværelsen af ​​kun et thorax tumor er en indikation af, at IC injektionen ikke var vellykket, og derfor sådanne mus blev udelukket i disse vurderinger.

Histologi

De mus døde blev fikseret i 10% formalin i phosphatbufret saltvand (PBS) i 48 timer og derefter afkalket i 10% EDTA i 10-14 dage. Afkalket for- og bagben blev indlejret i paraffin efter vævsbehandling (dehydrering, clearance og imprægnering). Sektioner (5 um) blev skåret fra hver blok og farves med Harris ‘hematoxylin og eosin (H & E). Til analyse af mineralisering af knoglen blev snit (8 um) skåret og farvet med tetraCHROME plet ifølge tidligere offentliggjorte metoder [14] med små ændringer: den Ponceau røde opløsning blev erstattet med Briebrich Scarlet /sur fuchsin-opløsning. Sektioner blev undersøgt med Aperio Scanscope XT (CA, USA) og billeder med Imagescope Viewer (Aperio, CA, USA).

Micro-CT scanning og analyse

Efter formalin fiksering, den bagben blev udvalgt til mikro-CT-scanning før behandling til histologi. Tumor-bærende lemmer blev identificeret forud ved ekspression af GFP

in vivo

. For tumorbærende mus, der modtog den 20 ug /kg dosis regime, blev både højre og venstre bagben fem mus scannes. For andre behandlingsgrupper, blev kun et enkelt ben scannes fra hver mus. Alle analyserede knogler var fra dyr, der blev aflivet mellem dag 15 og 21 efter injektion af cellerne. Scanning og genopbygning blev udført ved hjælp af en SKYSCAN 1072 mikro-CT-system og tilhørende software (SKYSCAN, Antwerpen, Belgien). Under opretholdelse modellen i synsfeltet under billedet købet blev prøven roteret 180 ° omkring den lodrette akse. Billeder blev udsat for 5,9 sek og fremskrivninger indspillet i hvert roterende trin, hver 0,9 °, ved 80 keV og 100 mA. Tværsnitsarealet billeder (DICOM format) blev genereret fra de projicerede CT billeder ved hjælp Nrecon (SKYSCAN, Belgien). Bone overfladeareal og volumen blev beregnet ud fra DICOM-billeder med den af ​​fabrikanten software (CT-Analyzer, SKYSCAN, Belgien). Regionen af ​​benet omkring knæleddet fra spidsen af ​​den tredje trochanter af lårbenet til tvedeling af skinneben og lægben blev valgt til denne analyse for at sikre ensartethed. Rekonstruktion af 3D-modellen og image visualisering blev udført ved hjælp af ANT software (SKYSCAN, Belgien).

Statistisk analyse

En-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey indlæg blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 4.00 for MacIntosh, GraphPad Software (San Diego, USA). Overlevelse blev vurderet ved Kaplan-Meier efterfulgt af Breslow parvis sammenligning i SPSS 17.0.