PLoS ONE: Potente Anti-Cancer Effekt af 3′-Hydroxypterostilbene i Human Colon xenotransplantattumorer

Abstrakt

Her rapporterer vi, at 3′-hydroxypterostilbene (HPSB), en naturlig pterostilbene analog, var mere potent end pterostilbene mod væksten af ​​humane cancerceller (COLO 205, HCT-116, og HT 29) med målte IC

50 værdier på 9,0, 40,2 og 70,9 uM hhv. Vi fandt, at HPSB effektivt hæmmede væksten af ​​humane coloncancer-celler ved at inducere apoptose og autofagi. Autophagy opstod på et tidligt tidspunkt og blev observeret gennem dannelsen af ​​sure vesikulære organeller og mikrotubulus-associeret protein 1 lette kæde 3-II produktion. På molekylært niveau, resultaterne fra Western blot-analyse viste, at HPSB signifikant nedreguleret phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt og mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK’er) signalings herunder faldt phosphoryleringen af ​​mammalian target of rapamycin (mTOR). Væsentlige terapeutiske virkninger blev påvist

in vivo

ved at behandle nøgne mus med COLO 205 tumorxenoplantater med HPSB (10 mg /kg

i.p.

). Disse inhibitoriske virkninger blev ledsaget af mekanistisk nedregulering af proteinniveauer af cyclooxygenase-2 (COX-2), matrix metallopeptidase-9 (MMP-9), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), og cyclin D1, samt ved induktion af apoptose i tyktarmstumorer. Vores resultater tyder på, at HPSB kunne tjene som en ny lovende middel til tyktarmskræft behandling

Henvisning:. Cheng T-C, Lai C-S, Chung M-C, Kalyanam N, Majeed M, Ho C-T, et al. (2014) potent anti-cancer effekt af 3′-Hydroxypterostilbene i Human Colon xenotransplantattumorer. PLoS ONE 9 (11): e111814. doi: 10,1371 /journal.pone.0111814

Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, Taiwan

Modtaget: August 8, 2014 Accepteret: 8 okt 2014; Udgivet: November 12, 2014

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Data Tilgængelighed:. Forfatterne bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Science Råd NSC 101-2628-B-022-001-MY4, 102-2628-B-002-053-MY3, og NTU-103R7777 (for Dr. Pan) og af sundhed og velfærd tillæg på tobaksvarer MOHW103-TD-B-111-01 (for Dr. Ho). Sabinsa Corporation ydet støtte i form af lønninger til forfatterne NK MM, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling af data og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. NK og MM er medarbejdere i Sabinsa Corporation. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Epidemiologiske undersøgelser giver overbevisende dokumentation for, at kostfaktorer kan ændre de processer af carcinogenese, herunder initiering , fremme, og progression af flere typer af human cancer [1]. Kræft chemoprevention er brugen af ​​farmakologiske eller naturlige midler til at hæmme udviklingen af ​​invasiv kræft eller vende processen af ​​carcinogenese. Det kunne være den mest direkte proces for at reducere sygelighed og dødelighed fra kræft sygdom [2] – [4]. Et stort antal kemoforebyggende og kemoterapeutiske stoffer, fra naturlige produkter, har været anvendt som en lovende strategi til at bekæmpe kræft ved at inducere apoptose i maligne celler [5], [6].

Pterostilbene (

trans

-3,5-dimethoxy-4′-hydroxystilbene), en dimethylether analog af resveratrol, viser sig at være så effektiv som resveratrol til forebyggelse kræftfremkaldende-inducerede præneoplastiske læsioner i en musebryst dyrkningsmodel og inhiberer metastatisk vækst af melanomceller til leveren [7], [8]. Vi og andre har vist, at pterostilbene udviser pleiotropiske farmakologiske virkninger, herunder anti-inflammatorisk, antioxidant, anti-proliferative, anti-cancer, og smertestillende aktiviteter i cellekultur og dyreforsøg [9] – [14]. For nylig, 3′-hydroxypterostilbene (fig. 1), en ny naturlig pterostilbene analog er blevet isoleret fra

Sphaerophysa salsula

, er markant mere aktiv end pterostilbene i inducere apoptose i følsomme og resistente leukæmiceller [15], [ ,,,0],16]. Men den

in vivo

antitumorvirkningen af ​​HPSB fortsat uklart.

Autophagy, også kendt som type II programmeret celledød, er karakteriseret ved dannelsen af ​​en dobbelt-membran eller isolation membran, som er afledt af en del af det endoplasmatiske reticulum (ER) [17] eller fra cytolplasmic lipid pool [18]. Den dobbelt-membran former autophagosome ved udskille dele af cytoplasmaet og intracellulære organeller [11], [12], [19], [20].

Autophagy er en reaktion af eukaryote celler til forskellige microenvironment belastninger, herunder sult, patogen angreb og kemoterapi. Desuden er der også adskillige rapporter har vist, at autophagy induktion synes at fremme vellykket terapi-induceret drab af tumorceller [21], og pro-autophagic lægemidler, såsom temozolomid er lovende kandidater til selektivt drab af apoptose-resistente glioblastomer [22].

det igangsættende signal for autophagy dannelse er dårligt forstået, mens det er blevet fastslået, at flere molekyler og signalveje er impliceret i reguleringen af ​​autophagy, såsom PI3K-AKT-mTOR (phosphatidylinositol 3-kinase /proteinkinase B /pattedyr mål for rapamycin), MAPK’er, Raf-1-MEK1 /2-ERK1 /2-og PTEN (fosfatase og tensin homolog) veje [10], [23]. PTEN og AKT er opstrøms regulatorer af mTOR pathway, der fungerer som en inducer eller hæmmer af autophage hhv. AKT hæmmer autophage ved at regulere nedstrøms molekylær 4E-BP1 (4 forlængelse-binder protein 1), p70S6K, der resulterer i at fremme mRNA translation.

I denne aktuelle undersøgelse, vi først undersøgt antiproliferative virkninger af pterostilbene og dens naturlige 3 ‘hydroxyderivat på menneskelige kolon kræftceller. Vores resultater viste klart, at HPSB var mere potent end pterostilbene i inducere apoptose på en dosis-afhængig måde i COLO 205 celler.

Vi evalueres yderligere de molekylære mekanismer i apoptotiske og autophagic virkninger induceret af HPSB. At belyse anticancer mekanisme HPSB undersøgte vi signalvejene relateret til HPSB-induceret autophagy i humane COLO 205 colon cancerceller.

In vivo

terapeutiske virkning blev undersøgt yderligere ved at behandle nøgne mus med COLO 205 tumorxenoplantater med 10 mg /kg

ip

HPSB. Denne undersøgelse giver nye beviser for, at hydroxyl derivat af pterostilbene kunne tjene som en ny og lovende middel mod human tyktarmskræft.

Materialer og metoder

2.1 Reagenser

propidiumiodid ( PI), acridinorange (AO) og chloroquin (CQ) blev indkøbt fra Sigma Chemical (St. Louis, MO, USA). 2 ‘, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) og 3,3’-dihexyloxacarbocyanine iodid (DiOC6) blev købt hos Molecular Probes (Eugene, OR, USA). PARP, DFF-45, LC-3 I /II, p-mTOR (Ser

2448), mTOR, p-p70S6k (Thr

398), p-p70S6k (Ser

371), s -Akt (Ser473), Akt, PI3K, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-JNK1 /2 (Thr183 /Tyr185), JNK1 /2, p-p38 (Thr180 /Tyr182), p38 og MMP-9 antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). P-PI3K p85α (Tyr508), ERK1 /2, blev VEGF og cyclin D1-antistoffer købt hos Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Caspase 3, 8 og 9 antistoffer blev anskaffet fra IMGENEX (San Diego, CA, USA). COX-2-antistof blev købt hos Transduktion Laboratories (BD Biosciences, Lexington, KY). Den β-actin-antistof blev købt hos Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Pterostilbene og HPSB blev opnået fra Sabinsa Corp. (East Windsor, NJ). Renheden af ​​pterostilbene og HPSB blev bestemt ved HPLC som højere end 99,2%.

2.2 Cellekultur

Den humane coloncancer-cellelinjer Colo 205, HCT-116 og HT-29 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Cellelinier blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (GIBCO BRL, Grand Island, NY), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin), 2 mM L-glutamin (GIBCO BRL, Grand Island, NY), og blev holdt ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 incubator. Pterostilbene og HPSB blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO, som slutkoncentration på 0,05%). Celler blev behandlet med 0,05% DMSO som vehikelkontrol.

2.3 Cytotoksicitetsassay

Cellelevedygtighed blev analyseret ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT). Kort fortalt blev COLO 205, HCT-116 og HT-29-celler udpladet med en tæthed på 2 x 10

5 celler /ml i 96-brønds plader. Efter vækst natten over blev celler behandlet med en serie af koncentrationer af pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. De endelige koncentrationer af DMSO i dyrkningsmediet var 0,05%. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev 0,2% MTT tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved scanning med en ELISA-læser med en 570-nm-filter.

2.4 Flow cytometri analyse af sub-G1 cellepopulation, mitokondrielle membran potentiale og ROS produktion

For sub-G1 cellepopulation analyse, COLO 205-celler (2 x 10

5 celler /ml) blev dyrket i 12 brønd og behandling med forskellige koncentrationer af pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. Cellerne blev derefter høstet, vasket med PBS, resuspenderet i 200 pi PBS og fikseret i 800 pi iced 100% ethanol ved -20 ° C. Efter henstand natten over blev cellepellets opsamlet ved centrifugering, resuspenderet i 1 ml hypotonisk puffer (0,5% Triton X-100 i PBS og 0,5 ug /ml RNase) med PI (50 pg /ml) og inkuberet ved 37 ° C i mørke i 30 min. Fluorescens udsendt fra PI-DNA-komplekset blev kvantificeret efter excitation af det fluorescerende farvestof ved FACScan cytometri (Becton Dickinson, San Jose, CA). I autophagy inhibitor undersøgelsen blev celler forbehandlet 25 uM CQ i 1 time efterfulgt af inkubering med pterostilbene eller HPSB.

I mitokondrielle membranpotentiale og ROS produktion, celle blev behandlet som beskrevet ovenfor i 15 minutter, og derefter DiOC6 (40 nM) eller DCFH-dA (20 uM) blev tilsat til mediet i yderligere 30 minutter ved 37 ° C. Efter vask med PBS blev fluorescensintensiteten bestemmes ved FACScan cytometri.

2.5 Påvisning af autophagy

Autophagy induktion blev påvist ved AO-farvning. Efter 24 timer behandling blev Colo205-celler vasket med PBS, suspenderet i PBS og farvet med 1 pg /ml AO på 20 minutter. Fotografier blev opnået med et fluorescensmikroskop (Axioscop, Carl Zeiss, Thomwood, NY) udstyret med en kviksølv 100-W lampe, 490 nm band-pass blå excitationsfiltre, en 500 nm dikroisk spejl og et 515-nm lang-pass barriere filter. Til kvantificering af AVOS ved flowcytometri blev celler behandlet som beskrevet og farvet med AO i 15 minutter og blev analyseret ved FACScan laser flowcytometer og CellQuest software.

2.6 Western Blotting

De samlede proteiner af COLO 205-celler blev ekstraheret ved tilsætning af guld lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4; 1 mM NaF, 150 mM NaCI; 1 mM EGTA; 1 mM phenylmethansulfonylfluorid; 1% NP-40, og 10 ug /ml leupeptin) til cellepellets på is i 30 minutter, efterfulgt af centrifugering ved 10.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. De totale proteiner blev målt ved Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Munchen, Tyskland). Prøverne (50 ug protein) blev blandet med 5 × prøvebuffer indeholdende 0,3 M Tris-HCl (pH 6,8), 25% 2-mercaptoethanol, 12% natriumdodecylsulfat (SDS), 25 mM EDTA, 20% glycerol, og 0,1% bromphenol blå. Blandingerne blev kogt ved 100 ° C i 5 minutter og blev udsat for 10% SDS-polyacrylamid minigeler ved en konstant strøm på 20 mA. Elektroforese blev derefter udført på SDS-polyacrylamidgeler. Proteiner på gelen blev elektrooverført på en ubevægelig membran (PVDF, Millipore Corp., Bedford, MA) med overførsel puffer sammensat af 25 mM Tris-HCI (pH8.9), 192 mM glycin og 20% ​​methanol. Membranerne blev blokeret med blokerende opløsning indeholdende 20 mM Tris-HCI, og derefter immunblottet med forskellige primære antistoffer og β-actin. Blottene blev skyllet tre gange med PBST-buffer (0,2% Tween 20 i 1 × PBS-buffer) i 10 minutter hver. Derefter blots blev inkuberet med 1:5000 fortynding af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) og derefter vasket igen tre gange med PBST-buffer. De overførte proteiner blev visualiseret med en forbedret kemiluminescensdetektion kit (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK). De tætheder af båndene blev kvantificeret med en computer densitometer (AlphaImagerTM 2200 System Alpha densitometer. Innotech Corporation, San Leandro, CA).

2.7 Aktivitet af caspaser

caspase 3, 8 og 9 aktivitet i protein-ekstraktioner af COLO 205-celler blev bestemt ved et fluorogent assay (Promega s CaspACE assay System, Madison, WI). Kort fortalt 50 ug totalt protein, som bestemt ved Bio-Rad protein assay kit (Bio-Rad Laboratories), blev inkuberet med 50 pM substrat Ac-Asp-Glu-Val-Asp-methylcoumaryl-7-amin (caspase-3 specifikt substrat), Ac-Ile-Glu-Thr-Asp-AMC (Ac-IETD-AMC) (caspase-8 specifikt substrat), eller Ac-Leu-Glu-His-Asp-AMC (Ac-LEHD-AMC) ( caspase-9 specifikt substrat) ved 30 ° C i 1 time. Frigivelsen af ​​methylcoumaryl-7-amin blev målt ved excitation ved 360 nm og emission ved 460 nm ved anvendelse af et fluorescens-spektrofotometer (ECLIPSE, Varian, Palo Alto, CA).

2.8 COLO 205 xenograftmodel

Male Balb /c nøgne mus ved 3-4 uger gamle (vejer 16-18 g) blev opnået fra BioLASCO Experimental Animal center (BioLASCO, Taipei, Taiwan). Alle dyr blev holdt i patogenfrie sterile isolatorer og i en kontrolleret atmosfære (25 ± 1 ° C ved 50% relativ fugtighed) og med en 12 timers lys-12 h mørke cyklus efter fastlagte retningslinier. Dyrene blev fodret med standard AIN-76 kost og alle fødevarer, vand, anbringelse i bur, og strøelse blev steriliseret før brug. Dyr havde fri adgang til foder og vand på alle tidspunkter. Mad kopper blev genopfyldes med frisk kost hver dag. Alle dyr forsøgsprotokol anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for National Kaohsiung Marine University (IACUC, NKMU, # 099-AAA9-02, gyldighedsdatoer: 08/01 /2009-07 /31/2012) . Efter 1 uges akklimatisering, coloncancer COLO 205 celler (5 x 10

6) i 0,2 ml PBS blev injiceret subkutant mellem skulderbladene på hver nøgen mus. Efter transplantation blev tumorstørrelsen målt ved anvendelse skydelære, og tumorvolumen blev estimeret ifølge den følgende formel: tumorvolumen (mm

3) = L × W2 /2, hvor L er længden, og W er bredden. Når tumorerne nåede en middelstørrelse på 100-200 mm

3 blev musene tilfældigt inddelt i tre grupper (6 dyr /gruppe). Mus blev

i.p

. injektion med pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene (10 mg /kg /d, henholdsvis) i 15 dage, mens kontroldyr modtog injektion af majsolie. Kosten indtag og kropsvægt hvert dyr blev overvåget hver dag. Tumorvolumenet blev vurderet og registreret hvert 5 dage ved hjælp tykkelsesmålinger. Efter 15 dage blev musene aflivet ved CO

2-kvælning og lever, nyrer, milt og faste tumorer blev udskåret øjeblikkeligt og vejet. Gennemsnitlige tumorvolumen og tumorvægt i hver gruppe var repræsenterer middelværdien ± standardafvigelse (SD). Tumorvævene blev skåret i flere del til western bolt analyse eller opbevaret ved -80 ° C.

2.9 Statistisk analyse

Data blev præsenteret som middelværdi ± SE for det angivne antal uafhængigt udførte eksperimenter . Sammenligninger af statistisk signifikans mellem grupperne blev foretaget af en måde t-test eller envejs variansanalyse (ANOVA). En

P

-værdi. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

3.1 Hæmning af celledelingen i HPSB-behandlede humane kolon kræftceller

vi først sammenlignede virkningen af ​​pterostilbene og HPSB (figur 1) på væksten af ​​humane coloncancer-celler ved hjælp af trypanblåt-udelukkelse assay som tidligere beskrevet. Som vist i figur 2, HPSB faldt cellevækst i dyrkede humane colon cancerceller (COLO 205, HCT-116 og HT-29) i en dosis-afhængig måde, med IC

50 værdier på 9,0, 40,2 og 70,9 uM (tabel 1). Cellen-vækstinhiberende virkning på COLO 205 og HCT-116-celler (p53 vildtype) var følsom over for HPSB sammenlignet med HT-29 (p53 mutant). Disse resultater antyder, at p53 kunne være et centralt regulator i COLO 205 celler. Sammenlignet med pterostilbene, HPSB var en stærkere inhibitor af COLO 205 cellevækst. Som et resultat, vi undersøgte yderligere de cytotoksiske virkninger af HPSB i COLO 205 celler.

Celler blev behandlet med forskellige koncentrationer (5, 10, 25 og 50 uM) af pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. (A) Bestemmelse af sub-G1 celler i COLO 205-celler ved flowcytometri efter PI farvning som beskrevet i Materialer og Metoder. (B, C) Efter behandling blev totale cellelysater fremstillet fra COLO 205-celler og spaltningen af ​​PARP, DFF-45, pro-caspase 8 og pro-caspase 9 blev analyseret ved Western blotting. (D) Kinetik af caspaseaktivering i COLO 205 celler. Celler blev behandlet med 25 og 50 uM af pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. Caspase aktiviteter blev analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. (E) Celler blev behandlet med 50 uM pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 15 min. Mitochondriemembranpotential og ROS produktion blev farvet med DiOC6 (40 nM) og DCFH-DA (20 uM) og målt ved flowcytometri. Værdierne er udtrykt som middelværdier ± SE af tredobbelte prøver. *

P

. 0,05 indikerer statistisk signifikant forskel fra pterostilbene-behandlede gruppe

3.2 HPSB induceret apoptose i humane kolorektale carcinomceller

Flow cytometri blev anvendt til at undersøge induktionen af ​​en sub-G1 cellepopulation, et kendetegn for apoptose. For at undersøge om de cytotoksiske virkninger af HPSB observeret i COLO 205-celler skyldtes apoptotisk celledød, celler blev behandlet med pterostilbene og HPSB (5-100 uM) i 24 timer og DNA-indholdet i COLO 205-celler blev udført ved hjælp af flowcytometri (fig 2A). Som vist i figur 2A, de procentsatser af apoptotiske COLO 205 celler var 6,2, 8,4, 10,2, 14,8 og 7,2 og 9,3, 20,1 og 36,3% efter inkubation med 5, 10, 25, og 50 uM pterostilbene og HPSB hhv. Figur 2B sammenlignet med pterostilbene, HPSB markant forårsage nedbrydningen af ​​116 kDa PARP i 85 kDa fragmenter og inducere DFF-45 proteinnedbrydning. Disse protein spaltninger blev associeret med aktiveringen af ​​caspase-3. Som vist i figur 2C, HPSB inducerede en dramatisk stigning i caspase-9 spaltning end pterostilbene. Imidlertid kun mindre effekt på caspase-8-aktivitet i HPSB behandlede celler. At overvåge den enzymatiske aktivitet af caspase-3, -8 og -9, blev caspase aktivitet målt efter behandling af COLO 205-celler med 10 og 50 uM HPSB. Som vist i figur 2D, HPSB inducerede en dramatisk stigning i caspase-3 aktivitet på ca. 2,4 gange efter 24 timers behandling. Det er for nylig blevet klart, at apoptose involverer en afbrydelse af mitokondrie membran integritet, som er afgørende for celle- død proces. Vi har derfor vurderet virkningerne af HPSB på mitokondrie trans-membran potentiale (ΔΨ

m). Resultater af måling af fluorescens-intensiteten i COLO 205 celler udsat for pterostilbene og HPSB sammenlignet med ubehandlede kontrolceller er opsummeret i fig. 2E. Den DiOC6 (3) fluorescensintensitet flyttet til venstre 224-117 og 75 i pterostilbene og HPSB-induceret apoptotiske COLO 205cells hhv. Disse resultater bekræftede, at HPSB forårsagede et fald i den mitokondriske transmembrane potentiale i COLO 205 celler. Rollen af ​​ROS i induktionen af ​​apoptose er velkendt. Interessant, HPSB markant nedsat den gennemsnitlige DCFH-DA fluorescensintensitet 114-38, mens pterostilbene øget DCFH-DA fluorescensintensitet 114-141 på 15 min. Ubalancen af ​​ROS-koncentrationer kunne spiller en vigtig rolle som en tidlig mediator i HPSB-induceret apoptose.

3.3 HPSB viste stærkere inducerende effekter på autophagy end pterostilbene i COLO 205 celler

Akkumulerende beviser klart viser at pterostilbene har anti-tumorigenese evne gennem induktion af apoptose og autofagi. Vi næste vurderet, om pterostilbene og HPSB også induceret autophagy i COLO 205 celler. Som vist i figur 3A, HPSB behandling resulterede i markant udseende AVO end pterostilbene når celler blev farvet med acridinorange efter 24 timers behandling. For at kvantificere forekomsten af ​​HPSB-induceret autofagi, viste celler med AVOS forbedret rød fluorescens analyseret ved flow, der steg betydeligt efter behandling med HPSB på en dosis-afhængig måde (figur 3B og 3C). For at bekræfte forekomsten af ​​autofagi induceret af pterostilbene og HPSB undersøgte vi processen med LC3I /II, kendetegnende for autophagy, ved hjælp immunblot for at detektere celle-ekstraheret lysater fra COLO 205-celler. Som vist i figur 3D, HPSB mere stærkere øget mængden af ​​LC3B I /II proteiner end pterostilbene.

Celler blev behandlet med 50 pM pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer og farvet med acridinorange. (A) Grøn og rød fluorescens i acridinorange-farvede celler blev observeret under fluorescensmikroskop. (B, C) Påvisning og kvantificering af autophagy i COLO 205 celler. Celler blev behandlet med 25 og 50 uM af pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer og farvet med acridinorange. Målingen af ​​grøn og rød fluorescens i acridinorange-farvede celler blev udført under anvendelse af flowcytometri. (D) Cellelysater fremstilledes efter 24 timers behandling og proteinet ekspression af LC3 I /II blev analyseret ved Western blotting. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD af tredobbelte eksperimenter. *

P

0,05 indikerer statistisk signifikant forskel fra pterostilbene-behandlede gruppe

3.4 HPSB hæmmede mTOR /p70S6K, PI3K /Akt og MAPK’er signalveje i COLO 205 celler.

for yderligere at forstå de molekylære mekanismer i HPSB induceret autophagy i COLO 205 celler, undersøgte vi phosphorylering af mTOR /p70S6K, PI3K /Akt, og MPAKs i HPSB behandlede celler. Resultaterne viste, at phosphorylering af mTOR og p70S6K (Thr389) blev markant reduceret i celler behandlet med HPSB (figur 4A). Akkumulerende beviser understøtter, at PI3K /Akt og MAPK’er veje er involveret i reguleringen af ​​autophagy imidlertid JNK1 /2 i denne vej er endnu ikke afklaret. Derfor undersøgte vi, hvordan disse signalveje fungerede inducere autofagi af HPSB i COLO 205 celler. Som vist i figur 4B og 4C, phosphoryleringen af ​​PI3K, Akt, og p38 MAPK faldt i celler behandlet med HPSB på en tidsafhængig måde. Tværtimod behandling med HPSB øgede phosphorylerede ERK1 /2 og JNK1 /2 effektivt i 1 time og derefter gradvist faldt phosphoryleringen af ​​ERK1 /2 og JNK1 /2 fra 3 timer til 9 timer sammenlignet med total ERK1 /2 og JNK1 /2 protein i COLO 205 celler. Taget sammen indikerer disse resultater, at HPSB inhiberer PI3K /Akt /mTOR /p70S6K, og p38MAPK pathways og aktiverer ERK1 /2, JNK1 /2 MAPK pathways og foreslår, at disse ændringer medierer HPSB-induceret autophagy i COLO 205 celler.

COLO 205-celler blev behandlet med 50 pM 3′-hydroxypterostilbene på forskellige tidspunkter. Cell lyates blev fremstillet og proteinet niveauer af (A) p-mTOR, p-p70S6k, (B) p-PI3K, p-Akt og (C) p-ERK1 /2, p-JNK1 /2, p-p38 var analyseret ved Western blotting-analyse. Alle analyser var repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. Værdierne under hver bane angiver relativ massefylde af bandet normaliseret til p-actin ved hjælp af en densitometer.

Desuden brugte vi chloroquin (CQ), en inhibitor af autophagy, at afgøre, om hæmning af autofagi undertrykt HPSB-induceret cytotoksicitet. Som vist i figur 5, at resultaterne indikerede, at behandling med CK viste betydelig stigning cytotoksicitet (fig. 5A) ved forøget HPSB-udløst apoptose (fig. 5B og 5C). Disse resultater underbygger med den observation, at HPSB behandling inducerer autophagic celledød i COLO 205 celler. Salg

Celler blev forbehandlet med 25 pM CQ i 1 time før behandling med 50 uM pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 24 timer. (A) Cellelevedygtighed blev bestemt ved MTT-assayet. (B, C) Sub-G1 cellepopulation (%) blev analyseret og kvantificering efter PI-farvning efterfulgt af flowcytometri. Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD af tredobbelte eksperimenter.

*

P

0,05 og

**

P

. 0,01 indikerer statistisk signifikant forskel fra pterostilbene-behandlede gruppe

3.5 HPSB stærkt hæmmet vækst tumor

in vivo

Vi undersøgte yderligere den terapeutiske effekt af HPSB

in vivo

ved at behandle nøgne mus der bærer human colorectal karcinom COLO 205 tumorxenoplantater, hjælp pterostilbene og HPSB i en koncentration på 10 mg /kg. Under forsøget blev alle mus overvåget for at undersøge, om pterostilbene og HPSB behandling forårsagede nogen bivirkninger. Som vist i tabel 2, har kroppen og organers vægt i hver gruppe ikke udviser usunde symptomer under forløbet af studiet. Disse resultater tydede på, at ingen nævneværdige bivirkninger eller toksicitet var forårsaget af

i.p.

Injektion af pterostilbene og HPSB. Endvidere i mus, der modtog disse behandlingsplaner, ingen makroskopiske tegn på toksicitet blev observeret under synlige inspektioner af helhedsindtrykket og mikroskopi af individuelle organer (data ikke vist). After15 dage blev tumorvolumen i HPSB inhiberede signifikant i sammenligning med de pterostilbene-behandlede mus (fig. 6A og 6B). Tumorvægten blev stærkt inhiberet i HPSB-behandlede mus (fig. 6C). Som vist i figur 6D, blev protein-niveauer af COX-2, MMP-9, VEGF, cyclin D1, og pro-caspase-3 markant nedsat i COLO 205 xenotransplantattumorer fra 10 mg /kg HPSB-behandlede gruppe sammenlignet med den pterostilbene gruppe. Vores resultater antyder, at HPSB kunne tjene som en ny lovende middel til cancer kemoterapeutiske formål.

Eksperimentel behandling protokol som beskrevet i Materialer og Metoder. Mus med COLO 205 xenografter var

i.p.

Injektion med pterostilbene eller 3′-hydroxypterostilbene i 15 dage, hvor kontrolgruppe blev modtaget majsolie. (A) fotografi af xenotransplantattumorer udviklet i hver gruppe, er vist i slutningen af ​​day15. (B) Gennemsnitlige tumorvolumener blev registreret i løbet af behandlingen og (C) gennemsnitlig tumor vægt blev målt i slutningen af ​​eksperimentet. Seks prøver blev analyseret i hver gruppe, og værdierne repræsenterer middelværdien ± SD.

*

P

0,05 og

**

P

0,01, sammenlignet med kontrolgruppen.

#

P

0,05 sammenlignet med pterostilbene-behandlede gruppe. (D) Total proteiner af xenotransplantattumorer i hver gruppe blev ekstraheret i Western blot-analyse. COX-2, MMP-9, VEGF, PCNA, cyclin D1 proteinekspression og spaltet caspase-3 blev detekteret ved anvendelse af specifikke antistoffer. Lignende resultater blev opnået i tre uafhængige forsøg.

Diskussion

I denne undersøgelse, for første gang, vi sammenligner med kræft cellevækst hæmmende effekt af pterostilbene og HPSB (figur 1) i humane coloncancer-celler. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at HPSB mere potent induceret apoptose og autofagi end pterostilbene i COLO 205 celler. Denne undersøgelse indikerer, at forskellen i bioaktivitet HPSB sammenligne med pterostilbene er relateret til tilstedeværelsen og placeringen af ​​hydroxylgrupper på den grundlæggende pterostilbene kemiske struktur. Humane colorektale COLO 205 cancerceller undergik apoptose efter behandling med HPSB, hvilket antyder, at apoptose er den største årsag til væksthæmmende effekt af HPSB. Disse data bør give medicinske kemikere med nye oplysninger for design af anti-tumor agenter, og også oplysninger til støtte yderligere biologiske undersøgelser af disse modificerede og ikke-modificerede funktionelle grupper i fremtiden. Som vist i figur 2, HPSB er en stærk hæmmer af cellelevedygtighed og forårsager potent og hurtig induktion af apoptose i COLO 205 celler. Faktisk behandling med HPSB forårsager reduktion af mitokondriel membranpotentiale og induktion af caspase-3 og caspage-9, som er forbundet med nedbrydningen af ​​DFF-45 og PARP, forud for indtræden af ​​apoptose. Rollen af ​​ROS i induktionen af ​​apoptose er velkendt. Interessant nok er en stigning i intracellulære hydrogenperoxid niveauer i pterostilbene, hvorimod markant reducere hydrogenperoxid niveauer i HPSB-behandlede COLO 205 celler (fig. 2E). Vi spekulerede at pterostilbene trænger cellemembranen i cytosol og påvirker mitokondrier cykling dioxygen gennem elektrontransportkæden forsamling. Imidlertid kunne HPSB direkte skyllepumpetab ROS i celler og yderligere forstyrre intracellulær redox balance.

Kræft udvikling, en dynamisk og langsigtet proces, involverer mange komplekse faktorer med trinvis progression i sidste ende fører til en ukontrolleret spredning og vækst af kræft celler i hele kroppen, der kaldes metastase. Epidemiologiske undersøgelser har givet overbevisende dokumentation for, at kostfaktorer kan ændre denne proces [1]. Forholdet mellem apoptose og autofagi er kompleks og varierer mellem celletyper og forskellige belastninger. Autophagy er også genetisk programmeret, initiativtagere til autophagy har potentiale til klinisk fordel i fastsættelsen af ​​forebyggelse af kræft [24]. Som autophagy er nødvendig for en effektiv styring af metabolisk stress, fremme autophagy gennem mTOR pathway hæmning kan forventes at begrænse tumorprogression [25]. Kosten naturlige forbindelser frembyder et stort potentiale i kampen mod kræft hos mennesker ved at hæmme carcinogenese processen gennem celle defensiv og apoptotiske machineries [10]. Akkumulerende beviser viser tydeligt, at induktion af apoptose og autophagy som en mekanisme til forebyggelse af kræft ved kosten naturlige forbindelser [24]. Vi demonstrerede, at anti-cancer effekter af HPSB reguleres af apoptose og autofagi, og signalvejene medierer HPSB-induceret autofagi blev identificeret. Vores resultater viste, at efter inkubation med HPSB blev de LC3I /II udtryk bemærkelsesværdigt steget i COLO 205 celler (fig. 3D). Den PI3K /Akt og mTOR /p70S6k veje er vigtigste signalveje, der negativt regulerer autofagi [26].