PLoS ONE: overudtrykt DNA Polymerase Iota Reguleret af JNK /c-Jun Bidrager til Hypermutagenesis i blærekræft

Abstrakt

Menneskelig DNA-polymerase tøddel (pol ι) besidder høje fejlbehæftede DNA replikation funktioner og udfører translesion DNA-syntese. Det kan være specialiseret og strengt reguleret i normale pattedyrceller. Dysregulering af pol ι kan bidrage til erhvervelse af en mutator fænotype. Der er imidlertid nogle rapporter, der beskriver transkriptionen reguleringsmekanisme af pol ι, og der er uenighed om dets rolle i carcinogenese. I denne undersøgelse udførte vi deletionen og point-mutation eksperiment, EMSA, chip RNA-interferens og western blot-assay til at bevise, at c-Jun aktiveret ved c-Jun N-terminal kinase (JNK) regulerer transskriptionen af ​​pol ι i normal og cancerceller. Xeroderma pigmentosum gruppe C-protein (XPC) og ataksi-telangiectasia muteret beslægtet protein (ATR) fremme JNK-aktivering tidligt som respons på DNA-skade og dermed forbedre ekspressionen af ​​pol ι, hvilket indikerer, at den hidtil ukendte rolle JNK signalvej er involveret i DNA-skader respons. Endvidere forbundet med forhøjet c-Jun-aktivitet, overekspression af pol ι er positivt korreleret med den kliniske tumorklassificering i 97 blærekræft prøver og kan bidrage til hypermutagenesis. Den overudtrykte pol ι-involveret mutagenese er afhængig af JNK /c-Jun-vejen i blære cancerceller identificerer den særlige mutation spektre. Vores resultater støtter den konklusion, at dysregulering af pol ι af JNK /c-Jun er involveret i carcinogenese og tilbyde en ny forståelse af den rolle, pol ι eller c-Jun i mutagenese

Henvisning:. Yuan F, Xu Z, Yang M, Wei Q, Zhang Y, Yu J, et al. (2013) overudtrykt DNA Polymerase Iota Reguleret af JNK /c-Jun Bidrager til Hypermutagenesis i blærekræft. PLoS ONE 8 (7): e69317. doi: 10,1371 /journal.pone.0069317

Redaktør: Spencer B. Gibson, University of Manitoba, Canada

Modtaget: Marts 7, 2013; Accepteret: 12 jun 2013; Udgivet: 26 Jul 2013

Copyright: © 2013 Yuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Nature Science Foundation of China (30770460) og Army Nature Science Foundation of China (06H026). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Celler udnytte DNA reparation veje til effektivt afhjælpe de skadelige virkninger af DNA-skader. Men i nogle tilfælde, ikke alle skader kan repareres hurtigt og availably, som inducerer cellecyklusstop. For at overvinde denne blokade for at fortsætte syntese af den voksende DNA-kæde, celler anvender de molekylære mekanismer, som sætter translesion DNA-syntese (TLS) at forekomme [1], [2]. TLS er udført af specialiserede DNA-polymeraser, herunder Y-familie DNA-polymeraser (pol ι, pol κ, pol η og REV 1), der almindeligvis udviser høje fejlprocenter under DNA-syntese. Det er blevet påvist, at pol ι har den laveste troskab i TLS proces på tværs af mange typer af DNA-læsioner

in vitro

og pol ι kan også kopiere ubeskadiget DNA med lav fidelity [3].

Som vidt fejlbehæftede DNA replikation funktioner i pol ι kan dysregulering af pol ι bidrage til erhvervelse af mutator fænotype, der, sammen med defekt cellecykluskontrol eller andre genomstabilitet veje, kan lette at fremskynde tumor progression. Vi har tidligere først opdaget, at brystcancerceller overeksprimerer pol ι protein, hvilket fører til UV-induceret hypermutagenesis [4]. pol ι er også involveret i UV-induceret mutagenese i Burkitts lymfom og XPV cellelinier [5], [6]. Desuden pol ι var foreløbig fundet at være overudtrykt i en række af primære tumorvæv, herunder prostata, uterus, mave og rektale cancere, men der er en mangel på de værdifulde kliniske beviser [7]. Men er stadig uklar, og under debattere [8] rolle pol ι i carcinogenese og få rapporter er bekymrede over reguleringsmekanisme af pol ι eller den potentielle dysregulering mekanisme pol ι i kræft. Derfor er det vigtigt at gøre vores bestræbelser på at afklare den mekanisme af regulering og til at bestemme carcinogenese rolle pol ι

in vivo

.

En fremtrædende signalvej aktiveres som reaktion på cellulært stress er den mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) pathway. Tre større MAPK tilgange er blevet beskrevet: det ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK), c-Jun N-terminal kinase (JNK) og p38 MAPK pathways. Mål for JNK-vejen indbefatter aktivatorproteinet 1 (AP-1) gruppe af transkriptionsfaktorer, såsom jun Fos og ATF familiemedlemmer [9]. Alligevel c-Jun specifikt phosphoryleret af JNK spiller en central rolle i forskellige funktioner AP-1-komplekset [10]. JNK kan aktiveres af cellulære stresssignaler skyldes inflammatoriske cytokiner og DNA damage midler, hvorimod AP-1 kan påvirke det cellulære DNA beskadigelse respons ved at regulere ekspressionen af ​​flere gener relevante for DNA beskadigelse reaktionsmekanismer [11], [12], [13]. Tidligere beviser har også vist, at c-Jun bidrager til transformation og tumor udvikling og er klassificeret som et proto-onkogen [14]. JNK-aktivering er blevet påvist som et krav for udvikling af forskellige kræftformer [15], [16], [17]. Men ingen undersøgelse er endnu ikke rapporteret, der belyser rolle JNK /c-Jun-vejen i TLS og DNA-beskadigelse-inducerede hypermutagenesis. Endvidere har de fleste rapporter, der beskriver signaleringen for JNK-aktivering efter DNA beskadigelse fokuseret på membranreceptor-relateret JNK-aktivering. Den måde, hvorpå DNA skade respons-relaterede mekanismer bidrager til JNK aktivering i kerne er endnu uklart.

Vores undersøgelser giver bevis for, at JNK /c-Jun-vejen spiller en afgørende transskription regulerende rolle pol ι. Dataene også fremlægge en ny indsigt, som JNK /c-Jun-vejen er involveret i TLS og hypermutagenesis. Vi bestemt, at JNK /c-Jun-vejen kan aktiveres ved DNA skade vigtige proteiner, XPC og ATR. Desuden blev fundet overekspression af pol ι at være relateret til omfanget af c-Jun-phosphorylering i blære cancervæv og være forbundet med cancer progression og hypermutagenesis identificeret af den særlige mutation spektre. Det foreslås, at dysreguleret pol ι af JNK /c-Jun kan fungere som et mutator. Derfor kan DNA-polymerase tøddel være en potentiel indikator og mål for kræftbehandling i ondartet svulst.

Materialer og metoder

Etik Statement

Undersøgelsen blev godkendt af etik bord af Southwest Hospital på den tredje Military Medical University (KY201016), og alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke.

Cell kultur og behandling

T24, RT4 blærecarcinomceller og HEK293 celler blev købt fra amerikansk Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA). Celler blev opretholdt i RPMI 1640, McCoys 5A eller DMEM-medium suppleret med 10% FBS og en blanding af antibiotika, henholdsvis. Inhibitorer af JNK (SP600125) blev p38 (SB203580) og ERK1 /2 (PD98059) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) anvendes til at behandle cellerne i 2 timer. Eksponering af celler og plasmider for UV-lys (254 nm) blev opnået med en CL-1000 ultraviolet tværbinder.

Kliniske prøver og immunhistokemi

urotelial carcinom vævsprøver blev opnået fra 97 patienter, som transurethral blære tumor resektion og radikal cystektomi på Southwest Hospital. Alle prøverne blev indsamlet mellem 2008 og 2010. Disse væv blev tildelt patologiske kvaliteter af urothelial karcinom I, II eller III ifølge WHO klassifikationen (1973). De formalin-fikserede, paraffinindlejrede vævssnit blev afparaffineret, rehydreret i graduerede alkoholer serie, og behandles under anvendelse af streptavidin immunperoxidase-metoden. En anti-pol ι antistof (LS-B296, Levetid Biosciences, Seattle, WA, USA) og et anti-PC-Jun-antistof (sc-822; Santa Cruz Biotechnology, CA, USA) blev anvendt ved fortyndinger på 1:200 og 1:100 henholdsvis. Protein- ekspressionsniveauer blev kvantificeret og afsluttet ved at evaluere antistof signalstyrken og estimere procentdelen af ​​positivt farvede urothelial carcinomaceller [18]. Fem tilfældige synsfelter blev valgt, og 100 celler pr feltet blev analyseret. Scoring blev udført blind uden kliniske data. Den scoring blev katalogiseret som en score (procentdel af positivt farvede celler 25%), 2 point (25-50%), 3 score (50-75%) og 4 point ( 75%), hhv. I mellemtiden blev pletten signal, vurderet som svagt (1 score), moderat (2 score) og stærk (3 score) hhv. Den procentvise score multiplicere signalet score var endelige score. Det endelige resultat blev defineret lavt niveau ( 6 score) og intens niveau ( 8 score).

Western blot assay

lige dele af hver celler lysat blev analyseret ved SDS-PAGE [19]. Antistofferne blev indeholdt anti-pol ι (ab1324; ABCAM, Inc., Cambridge, UK), anti-XPC (ab6264; ABCAM), anti-ATR (sc-1887, Santa Cruz), anti-c-Jun (SC- 44X, Santa Cruz), anti-PC-Jun (sc-822; Santa Cruz), anti-p-MKK4 (BS4168, Bioworld, St. Louis Park, MN, USA), anti-p-MKK7 (4171; Cell Signaling teknologi, Boston, MA, USA), anti-p-JNK (sc-6254, Santa Cruz), anti-JNK (9252; Cell Signaling Technology), anti-MKP-1 (sc-1102, Santa Cruz), og anti -GAPDH (KC-5G4, Kangchen, Shanghai, Kina). Proteinekspression blev evalueret ved brug af SuperSignal West Pico kit (NCI4106; Pierce, Rockford, IL, USA). Eksperimentet blev gentaget mindst tre gange. Niveauet af protein-ekspression blev kvantificeret ved hjælp af Scion billede densitometri software (Scion Corporation, Frederick, MD).

Konstruktion af pGL3-

POLI

sletning og site-directed mutagenese

den -2751 /+ 63, -1832 /+ 63, -1299 /+ 63, -685 /+ 63, -275 /+ 63, -208 /+ 63, -160 /+ 63 og -126 /+ 63 af DNA fragmenter af humant

POLI

gen (i forhold til det transkriptionelle startsted) blev amplificeret fra HEK293 genomisk DNA via PCR. Mutagene primere blev udformet for c-Jun-bindingssted inden -275 /+ 63 med en 2 bp mismatch (fed skrift og understreget); fremad: 5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3 ‘og revers: 5′-CTGCAACCTCTGCCTCCCGGATTCAAGC-3’. De amplificerede PCR-produkter blev derefter indsat i

Kpnl

og

Hindlll Salg lokaliteter af pGL3-Basic Vector (Promega, Madison, WI, USA). Alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering (Invitrogen, Shanghai, Kina).

Forbigående transfektion og luciferaseassays

De celler (1 x 10

5) blev enten transficeret med forskellige subklonede luciferase reporter plasmider og pSV-β-galactosidase eller kollektivt transficeret med pcDNA3.1-c-Jun hjælp af Lipofectamine transfektionsreagens (Invitrogen). De pGL3-basiske og tomme pcDNA3.1 vektorer blev anvendt som kontroller. Ved 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet og analyseret ved anvendelse af Luciferase Assay System (E1500; Promega). Den pSV-β-gal (E2000; Promega) blev analyseret som kontrol. Assayet blev udført tredobbelt, og hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

elektroforetisk mobilitet ændring-assays

blev udført Eksperimenterne som beskrevet tidligere, men med nogle modifikationer [20]. Oligonucleotiderne blev mærket med et biotin 3 ‘End DNA Labeling Kit (89.818; Pierce). De biotin-mærkede 29 bp oligoer (5’-TGAGCCGGTATTGCGTCACTGTTGCCCAC-biotin-3 ‘; AP-1-lignende bindingssted angivet i understreget) og de mutante dobbeltstrengede 29 bp oligoer (5′-TGAGCCGGTATTGCCACACTGTTGCCCAC-3’; mutationssite fed skrift og understreget) blev anvendt til at teste for specifik binding. Ikke-mærkede oligoer blev anvendt til konkurrencen. Den LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (20148; Pierce) blev anvendt til at udføre reaktionerne. De mærkede oligoer (20 fmol) blev inkuberet med kerneekstrakter (4 ug) fra HEK293-celler. Efter elektroforese i ikke-denaturerende 6% polyacrylamidgel blev gelen tørret og underkastet kemiluminescens. Supershift assays blev udført under anvendelse af et anti-c-Jun-antistof (sc-44X, Santa Cruz) og en muse-IgG. (Sc-2025, Santa Cruz)

chromatin immunpræcipitationsassay

Chippen blev udført som tidligere beskrevet [21]. Kort fortalt, efter tværbinding med 1% formaldehyd blev HEK293-celler lyseret og sonikeret. Før immunopræcipitation med muse-IgG eller c-Jun (sc-44X, Santa Cruz) antistoffer blev en lille portion af kromatin gemmes og bruges som input kontrol. Den specifikke målrettede DNA-fragment blev målt med specifikke primere (fremadrettede: 5′-GCCGGTATTGCGTCACTGTT-3 ‘; revers: 5′-CAGAGTGACACGCATGCCAAGGAATCG-3’) til at opformere -236 /-61 region

POLI

gen.

Bioinformatik analyse

Omkring 3000 bp af 5’flankerende region af

POLI

sekvens blev opnået ved hjælp af BLAST algoritmen af ​​National center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/og https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgc). Formodede transkriptionsfaktorbindingssites blev identificeret med TransFac professional 8.1 software (https://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html). En promotor forudsigelse analyse blev udført ved hjælp af en online database (https://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)

RNA-interferens eksperimenter

c-Jun siRNA (sc-29223.; Santa Cruz), som er en pulje på 4 mål-special 19-25 nt siRNAs, ATR siRNA (sc-29.763, Santa Cruz), som er en pulje af 3 target-special 19-25 nt siRNAs eller kontrol siRNA-a (sC- 37007; Santa Cruz) fortyndet i transfektion medium (sc-36.868, Santa Cruz) blev transficeret i celler ved transfektionsreagens (sc-29528; Santa Cruz). XPC-specifikke shRNA (5′-GGATGAAGCCCTCAGCGAT-3 ‘) [22] og ikke-specifik kontrol shRNA blev syntetiseret og indsat i et lentivirus vektor (Genechem, Shanghai, Kina), derefter inficerede celler. Forsøgene blev uafhængigt præfabrikerede mindst tre gange.

Påvisning af UVC-medierede mutationer i

supF

reportergen

Plasmidet pSupFG1 er blevet beskrevet tidligere [23], [ ,,,0],24]. Kort fortalt blev UV-beskadiget plasmid (10 ug) transficeret ind i celler forbehandlet med eller uden SP600125. Plasmid-DNA blev isoleret efter 48 timer og transformeret ind i en

E. coli

SY204 (lacZ rav) stammen via elektroporation ved 1800 V /20 mF. Mutationen frekvens i

supF Salg reportergenet blev bestemt som antallet af mutante kolonier (hvide) på agarplader dividere antallet af totale kolonier. Mutationen spektrum af

supF

gen i hvide kolonier blev påvist ved DNA-sekventering. Eksperimentet blev gentaget mindst fire gange.

Real-time PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol og revers-transkriberet til dannelse cDNA (Invitrogen). Amplifikationsprodukter kurver blev genereret ved at overvåge fluorescensen af ​​SYBR Green (Invitrogen). Primerne anvendt til amplifikation inkluderet følgende: MKP-1 fremad, 5′-GTACATCAAGTCCATCTGAC-3 ‘og revers, 5′-GGTTCTTCTAGGAGTAGACA-3′; GAPDH fremad, 5’-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3 ‘og revers, 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGG-3’. Assayet blev udført tredobbelt, og hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Statistisk analyse

Data blev opsamlet i mindst tre eksemplarer og udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse (SE). Forskelle mellem grupper til densitometri af molekylær udtryk blev analyseret af t-test. Den statistiske signifikans mellem pol ι ekspression og patologisk bedømmelse af blære tumorvæv blev estimeret ved anvendelse af en chi-square test. Korrelationen mellem pol ι og p-c-Jun-ekspression blev analyseret med et bivariate test. SPSS13.0 software blev brugt til at udføre den statistiske analyse (p 0,05 blev betragtet som signifikant). Dataene Immunoblot, EMSA og chip analyse var repræsentative for mindst tre til fem uafhængige undersøgelser med reproducerbare resultater.

Resultater

c-Jun er en kritisk transkriptionel faktor for

POLI

gen

i betragtning af de eksperimentelle spor viste, at ændret udtryk for pol ι kan være forbundet til hypermutagenesis og carcinogenese, vi først afklare sin transkriptionel regulering mekanisme. At kortlægge den minimale promotor-aktivitet og de regulerende sekvenser, vi analyseret menneskelig

POLI

gen ved bioinformatik og identificeret den grundlæggende promotor af

POLI

gen med et formodet AP-1

cis

-element. En række deletioner ved den 5′-flankerende region af

POLI

genet blev subklonet i pGL3-Basic Vector (a luciferase reporter vektor). De primere blev anført i tabel 1. Aktiviteterne i disse konstruktioner blev vurderet på grundlag af luciferaseaktiviteten efter transient transfektion i HEK293 celler, et almindeligt anvendte celler linje som værktøj celler. Vores resultater viste, at den minimale

POLI

promotoren er placeret på -275 /+ 63-region (fig. 1A). Yderligere analyser viste, at regionen (-275 /-208) indeholder en formodet AP-1-lignende binding

cis

-element (TGCGTCA) på -228 site, som er den samme med den stærkt evolutionært bevaret AP 1-binding sekvens af TGAGTCA (fig. 1B).

(A) Luciferase aktivitet af deletioner af 5′-flankerende region af

POLI

genet blev normaliseret ved β-

gal

aktivitet. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SD for mindst tre uafhængige forsøg. (B) Skematisk repræsentationer af den distale

POLI

promoter region. (C) Transkriptionelle aktiviteter sletning eller mutant af

POLI

promotor. * Statistisk signifikant forskel i forhold til den pGL3-275 /+ 63 og pGL3-275 /+ 63MU konstruktion (p 0,01; t-test). (D) EMSA analysen. (E) chips assay. Muse-IgG som en negativ kontrol. Input DNA eller intet DNA tilsat blev hver anvendt som positiv og blank kontrol hhv.

Desuden at afklare de lovgivningsmæssige transkriptionelle rolle denne binding

cis

-element udførte vi en mutagenese analyse af -275 /+ 63-regionen i

POLI

gen. En vektor betegnet pGL3-275 /+ 63MU (et muteret AP-1-lignende bindende motiv) blev konstrueret med to punktmutationer (TGCcaCA). Interessant nok blev luciferaseaktivitet alvorligt svækket i pGL3-275 /+ 63MU (fig. 1C, venstre spalte). c-Jun spiller en central rolle i forskellige funktioner i AP-1-komplekset, derfor, vi transient co-transficeret HEK293 celler med konstruktionerne og pcDNA3.1-c-Jun til at bestemme, om c-Jun kunne aktivere

POLI

promotor. Resultatet af co-transfektion afslørede, at luciferase blev den mest markant aktiveret i pGL3-275 /+ 63, selv om pGL3-275 /+ 63MU og blev pGL3-208 /+ 63 observeret at være også forøget (fig. 1C, højre spalte) . Det er muligt, at sekvensen kan indeholde yderligere regulatoriske elementer indirekte kontrolleres af den overudtrykte c-Jun, som ikke blev identificeret ved vores undersøgelse. Ikke desto mindre er vores data stadig tyder på, at c-Jun effektivt kan aktivere transkription af

POLI

gen

via

AP-1

cis

-element på -228 stedet.

for at kontrollere, at c-Jun direkte binder til motivet i

POLI

promotor, vi udførte EMSA hjælp kerneekstrakter fra HEK293 celler. En forskudt bånd blev specielt fremstillet og supershift-analyse med et anti-c-Jun-antistof viste, at båndet faktisk indeholdt c-Jun-proteinet (fig. 1D). For at indhente bevis for c-Jun direkte binding til regionen

in vivo

, chip blev også udført med en anti-c-Jun-antistof til udfældning af kromatin fra HEK293-celler (Fig. 1E). I kombination med ovenstående resultater c-Jun tilsyneladende direkte binde til

POLI

promotor og konstitutivt aktivere ekspression af pol ι i HEK293 celler.

Overekspression af pol ι er afhængig af aktiveret JNK /c-Jun

Det er veldokumenteret, at translesion DNA-polymeraser, herunder pol ι, kan spille en vigtig rolle i DNA-skade responset. Op til dato, de visse typer DNA-skader, som er i stand til at blive omgået af pol ι er stadig uklare og kontroversielle. Vi undersøgte DNA beskadigelse-induceret ekspression af pol ι, som ikke blev observeret at blive induceret af visse typer af DNA-skader, herunder cisplatin, bleomycin og etoposid (upublicerede data). Men mange beviser støtter den antagelse, at en af ​​de fremherskende karakteristika pol ι er tilbøjeligheden til at ukorrekt optage nukleotider modsat nogle typer af DNA-læsioner, som omfatter cyclobutan pyrimidin dimerer og 6-4 pyrimidin pyrimidon tilgængeligt addukt forvrængning følgende UV-skader [8 ], [25]. Endnu vigtigere er, vi bevist, at pol ι kan betydeligt fremkaldt ved UV-skader i tidligere undersøgelse [4].

For at definere den rolle, JNK /c-Jun i pol ι-medieret TLS, valgte vi UV-bestråling (UVC 254 nm) som studiet tilstand af DNA-skade. For at bestemme om UV-induceret pol ι ekspression styres af JNK /c-Jun-aktivitet, vi bekræftet, at ekspressionen af ​​pol ι hurtigt blev induceret ved eksponering af HEK293-celler til UVC lys 30 J /m

2 (a midterste passende dosis [26]) og forblev forhøjet i 2-8 timer, hvilket var samtidig med aktiveringen af ​​c-Jun og JNK efter UV-bestråling (fig. 2A). Promotoraktiviteten af ​​pGL3-275 /+ 63-konstruktionen blev også forøget ca. 3 gange efter 2 timers UV-skader på samme dosis (fig. 2B).

(A) kinetik pol ι, s -JNK og pc-Jun ekspression under UV-skader i HEK293-celler. (B) Effekten af ​​UV-skader på aktiviteten af ​​den

POLI

promoter region. * Statistisk signifikant forskel i forhold til den pGL3-275 /+ 63 og pGL3-275 /+ 63MU konstruktion (p 0,01; t-test). ** Statistisk signifikant forskel i forhold til de celler behandlet med eller uden UV (p 0,01). (C) Ekspressionen af ​​pol ι, c-Jun og p-c-Jun i RT4 og T24-blære cancerceller. Ekspressionen af ​​pol ι blev observeret i (D) HEK293, T24 og RT4 celler behandlet med forskellige koncentrationer af SP600125 dyrket i yderligere forskellig varighed; (E) HEK293-celler behandlet med PD98059 eller SB203580; (F) HEK293-celler behandlet med eller uden SP600125 og UV; (G) HEK293-celler transficeret med siRNA-c-Jun i 48 timer. Den ikke-specifikke siRNA blev anvendt til kontrol. Densitometriske værdier blev angivet nedenfor hvert panel.

På baggrund af resultaterne, vi søgte at bekræfte, om JNK /c-Jun er nøglen regulering faktor pol ι udtryk i generelle mekanisme. Vi sammenlignede forskellige ekspression af pol ι, c-Jun og p-c-Jun i RT4 (en veldifferentieret cellelinie fra lav-grade tumor) og T24 (en cellelinie repræsenterede en high-grade invasive tumor) blære cancerceller. Som vist i fig. 2C, ekspressionen af ​​pol ι i T24-celler var bemærkelsesværdig højere end i RT4, hvorimod ekspressionen af ​​c-Jun og aktiviteten af ​​p-c-Jun blev forbedret samt. Tids- eller dosisafhængige hæmninger pol ι blev observeret i HEK293, T24 og RT4 blære cancerceller forbehandlet i 2 timer med en JNK-specifik inhibitor (SP600125) (fig. 2D), selv om ekspressionen af ​​pol ι i HEK293-celler syntes at stige efter 48 timer. Det kan være inhibering af SP600125 til JNK aktivitet kun varede i 48 timer, som forårsager ekspressionen af ​​pol ι udvundet ved 48 time efter SP600125 behandling. Som en kontrol blev den basale pol ι ekspression ikke observeret ændring i HEK293-celler forbehandlet med PD98059 og SB203580 (specifik inhibitor af ERK og p38 henholdsvis) (fig. 2E). Resultaterne viser, at aktivering af JNK /c-Jun-vejen er ikke kun ansvarlige for pol ι ekspression i normale celler, men bidrager også til den potentielle dysregulering af pol ι i blæren cancerceller. Vi demonstrerede endvidere, at JNK /c-Jun også direkte regulere den basale og UV-inducerede udtryk for pol ι. Når HEK293-celler blev forbehandlet med SP600125 (20 uM) blev ekspressionen af ​​pol ι reduceret efter 4 timer efter UV-eksponering på 30 J /m

2 (fig. 2F). Og c-Jun knockdown markant reduceret den basale og UV-induceret ekspression af pol ι (Fig. 2G). Kollektivt antyder disse data, at overekspression af pol ι vid udstrækning er afhængig af den aktiverede JNK /c-Jun-vejen.

ATR og XPC fremme p-JNK at regulere pol ι ekspression som respons på UV-skader

Vores konklusion ovenfor fik os til at undersøge opstrøms MAPK signalering. En rolle af DNA-skade respons signalering dukket op, som kan, udover kendte indirekte membran eller cytoplasmatisk signalering, aktivere MAPK-vejen gennem nuklear signalering [27]. Derfor har vi udviklet den hypotese, at JNK /c-Jun vej ansvarlig for UV-induceret pol ι udtryk også kan reguleres af DNA skade responset. Vi evaluerede effekten af ​​DNA-skader respons proteiner XPC og ATR af omfanget af JNK phosphorylering og pol ι udtryk med UV-skader. Med siRNA-ATR eller shRNA-XPC, den tavshed HEK293 og T24 celler begge udtrykte lavere niveauer af pol ι efter UV-skader, og p-JNK blev tilsvarende reduceret. Tværtimod i fravær af UV-skader, ekspressionen af ​​pol ι eller p-JNK blev ikke signifikant ændret ved ATR og XPC inhibering, selv om der blev observeret p-JNK at blive forbedret en smule shRNA lentivirus (Fig. 3A, 3B, 3C og 3D). Dette resultat kan forklares ved den potentielle særlige cellulære stressreaktion af lentivirus system. Således ATR og XPC er involveret i UV-induceret JNK signalering, som regulerer ekspressionen af ​​pol ι i normale celler og blære cancerceller.

Proteinekspression blev undersøgt i forskellige celler med forskellig behandling. (A) HEK293-celler transficeret med siRNA-ATR. (B) HEK293-celler inficeret med shRNA-XPC. (C) T24-celler transficeret med siRNA-ATR. (D) T24 celler inficeret med shRNA-XPC. (E) Real-time PCR-analyse af ekspressionen af ​​MKP-1 i ubehandlede eller behandlet HEK293-celler med siRNA-c-Jun, siRNA-ATR eller shRNA-XPC; GAPDH mRNA niveauer blev bestemt som en intern kontrol. * Statistisk signifikant forskel i forhold til HEK293-celler med eller uden behandling (p 0,01; t-test). (F) MKP-1-protein-ekspression i HEK293-celler behandlet med siRNA-ATR eller shRNA-XPC. Den ikke-specifikke siRNA eller uspecifikt shRNA-lentivirus blev anvendt til kontrol. Densitometriske værdier blev angivet nedenfor hvert panel.

I MAPK regulatoriske netværk, JNK phosphoryleres og aktiveres af dual-specificitet MAPKKs, herunder MKK4 /SEK1 og MKK7. Vedvarende JNK aktivitet er blevet tilskrevet den nedsat dephosphorylering af JNK ved MAP-kinase phosphatase-1 (MKP-1) [28]. For at vurdere, hvordan ATR og XPC aktiverer JNK, vi undersøgt, om MAPKK signalering reguleret af ATR og XPC som reaktion på UV-skader. Vi først bestemmes omfanget af UV-induceret fosforylering af MKK4 og MKK7. I forhold til vildtypeceller blev ingen klar ændring observeret omkring ekspressionen af ​​p-MKK4 eller p-MKK7 i ATR- og XPC-lyddæmpet HEK293 og T24-celler; det kan reducere mulig inddragelse af ATR og XPC i direkte aktivering MAPKK signalering (fig. 3A, 3B, 3C og 3D), mens ekspressionen af ​​MKP-1 blev forøget betydeligt i ATR- og XPC-lyddæmpet HEK293 celler efter UV-skader (fig. 3E og 3F). Samlet andres resultater, vores resultater indebærer, at DNA-skade responset protein ATR og XPC indflydelse JNK og regulere transkription af pol ι ved at reducere den hæmmende signal MKP-1 i stedet for aktivering MKK4 og MKK7.

Forhøjet udtryk for pol ι er forbundet med aktiviteten af ​​c-Jun og malignitet i human blærekræft

urotelial celler kontinuerligt udsættes for mange typer af DNA-skader reagenser, som er til stede i urin fra industrielle aromatiske aminer, cigaretrøg og optagelsen af ​​kemiske narkotika [29]. Dysfunktion af DNA-skade respons har været impliceret som en afgørende faktor bag fremkomsten af ​​genetisk ustabilitet i urotelial carcinogenese. Endvidere pol ι som er den tilbøjelighed til fejlagtigt optage nukleotider modsatte af DNA-læsioner er unormal ekspression i mange cancere, skønt de mekanismer fortsat uklare. Derfor vi gjort en indsats for at afgøre, om pol ι spiller den potentielle mutagene rolle i blærekræft som er høj heterogenitet og tilbagefald [29]. Vi undersøgte pol ι ekspression i 97 blære tumorvæv ved immunohistokemisk analyse. pol ι protein blev primært lokaliseret i kerner, og en lille mængde blev observeret i cytoplasmaet. Dette resultat afslørede, at pol ι ekspression var betydeligt højere i high-grade blæretumorer end i ringere kvalitet tumorer (fig. 4A). Statistisk analyse viste, at en stærk sammenhæng eksisterede mellem pol ι udtryk og den patologiske kvalitet af blære tumorvæv (tabel 2; p 0,01). pol ι ekspression blev også observeret at være forhøjet i blæren cancervæv sammenlignet med carcinoma sider væv ved western blotting (fig. 4B). Disse resultater antyder, at ekspression af pol ι kan tjene som en indikator for malignitet og progression af urothelial carcinomer.

(A) pol ι protein udtrykkes afvigende i forskellige tumorklassificering ifølge WHO klassificering. A1 er I-grade tumor; A2 er II-grade tumor; A3 er III-grade tumor (× 400 forstørrelse). (B) Ekspression af pol ι i 5 par blærecarcinom sider og cancervæv. “N” var repræsenteret carcinoma sider væv, “C” var repræsenteret kræftvæv. Densitometriske værdier blev angivet nedenfor hvert panel. (C) Repræsentative tilfælde af overensstemmelse mellem pol ι og p-c-Jun-ekspression i blærekræft. C1 og C2 blev hhv viste høj ekspression af pol ι og p-c-Jun i et par enkle. C3 og C4 var den lave udtryk i en anden par (× 100 og × 400 forstørrelse).

For at bestemme, om overekspression af pol ι resultater fra dysregulering af JNK /c-Jun-aktivering

in vivo

, vi analyserede konkordansen af ​​forhøjet pol ι og unormal c-Jun aktivitet i blærekræft væv. Vi valgte tilfældigt 41 paraffinindstøbte blære tumorvæv fra i alt 97 patientprøver. Niveauet af p-c-Jun var for det meste i enighed om pol ι udtryk (fig. 4C). Ekspressionen af ​​p-c-Jun var positivt associeret med forhøjet pol ι ekspression i blære kræft (tabel 3; r = 0,662, p 0,01). Resultatet styrker den konklusion, at c-Jun positivt regulerer pol ι udtryk og foreslår, at unormal pc-Jun bidrager til dysreguleret pol ι udtryk involveret i udviklingen af ​​blærekræft.

Overekspression af pol ι aktiveret af JNK /c-Jun fremmer UV-induceret hypermutagenesis i T24 celler

for at vurdere betydningen af ​​overekspression af pol ι og pc-Jun

in vivo

undersøgte vi potentialet hypermutagenic rolle i blære cancerceller.