PLoS ONE: Tumorgenetisk WAP-T musebrystcarcinom Celler: En Model for en selvreproducerende homeostatiske Cancer Cell System

Abstrakt

Baggrund

Analogt til normal stamcelle differentiering, den nuværende cancer stamceller (CSC) model forudsætter en hierarkisk organisation og en irreversibel differentiering i tumorvæv. Derfor bør CSCS omfatte kun en lille delmængde af tumorcellerne, som føder tumorvækst. Men nogle seneste resultater rejst tvivl om den generelle anvendelighed af CSC-modellen og bad om sin raffinement.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse, vi analyserede CSC egenskaber brystcarcinomceller afledt fra transgene (WAP-T) mus. Vi har etableret et stærkt tumorigen WAP-T-cellelinie (G-2-celler), der viser stamceller-lignende træk. G-2-celler, såvel som deres klonale derivater, er tæt knyttet til primære tumorer om histologi og genekspressionsprofiler, og afspejler heterogenitet med hensyn til deres differentiering stater. G-2 kulturer omfatter cellepopulationer i distinkte differentieringsfaktorer stater identificeret ved co-ekspression af cytoskeletale proteiner (cytokeratiner og vimentin), en kombination af celleoverflademarkører og et sæt af transkriptionsfaktorer. Cellular delmængder sorteret efter udtryk for CD24a, CD49f, CD61, EpCAM, Sca1, og Thy1 celleoverfladeproteiner eller metaboliske markører (fx ALDH aktivitet) er kompetente til at rekonstruere det oprindelige cellulære sammensætning. Repopulation effektivitet varierer meget mellem de enkelte delmængder og er påvirket af interaktioner med det respektive komplementære G-2 cellulære delmængde. Balancen mellem differentiering stater reguleres delvist af transkriptionsfaktor Sox10, som udtømning af Sox10 førte til opregulering af Twist2 og øget andelen af ​​Thy1-udtrykkende celler repræsenterer celler i en selvstændig vedvarende, reversibel, kvasi-mesenkymal differentiering tilstand .

konklusioner /betydning

G-2 celler udgør en selvstændig gengivelse kræft celle-system, vedligeholdes af bi- og ensrettede konvertering af supplerende cellulære delmængder. Vores arbejde bidrager til den nuværende kontroversielle diskussion om eksistensen og arten af ​​CSC og giver et grundlag for inkorporering af alternative hypoteser i CSC-modellen

Henvisning:. Wegwitz F, Kluth MA, Manz C, Otto B, Gruner K, Heinlein C, et al. (2010) Tumorgenetisk WAP-T musebrystcarcinom Celler: En Model for en selvreproducerende homeostatiske Cancer Cell System. PLoS ONE 5 (8): e12103. doi: 10,1371 /journal.pone.0012103

Redaktør: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, USA

Modtaget: April 7, 2010; Accepteret: 14 juli 2010; Udgivet: 11 August, 2010

Copyright: © 2010 Wegwitz et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (de 212 /23-1-3 til WD og GT), Deutsche Krebshilfe (Forschungsverbund “Tumorstammzellen”) til WD og GT, den VFK Krebsforschung gGmbH til WD, og ​​Fonds der Chemischen Industrie . Den Heinrich-Pette-Instituttet er støttet af Freie und Hansestadt Hamburg og Bundesministerium für Gesundheit. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

definitionen af ​​Rollin Hotchkiss af levende materiale “som den gentagne produktion af bestilt heterogenitet” er gældende for normal samt tumorvæv [1]. Den cellulære heterogenitet observeret i mange faste tumorer på det funktionelle og strukturelle niveau minder til komplekset cellulære organisation af de respektive normale væv. Denne lighed tumor til normalt væv legitimerer den formelle anvendelse af principper og begreber i udviklingsmæssige biologi til kræftforskning. Modellen cancerstamceller (CSCS) [2], [3] beskriver en tumor som et hierarkisk organiseret system med stamceller-lignende celler og deres differentierede afkom. Som postuleret af CSC-modellen, en lille delmængde af celler driver tumorvækst og er ansvarlig for tumor tilbagefald efter en tilsyneladende vellykket terapi. Disse tumorceller, benævnt CSCS, tumor-initierende eller tumorigene celler, udmærker sig ved en kombination af operationelt definerede fælles eller unikke celleoverfladen associerede markører og evnen til at etablere sygdommen i passende modtagende mus [4]. I modsætning til den stokastiske model af klonal evolution, der tilskriver tumorcelle heterogenitet til genetiske forskelle i tumorcellen pool [5], CSC model postulerer, at epigenetiske snarere end genetiske forskelle skelne tumorigene fra ikke-tumorigene celler, hvorved der tilvejebringes en basis for de hierarkiske relationer i tumor celle populationen [6].

de seneste fund, at tumorigene celler kan omfatte en betydelig del af tumor masse [7] spørgsmålstegn ved strengt hierarkiske organisering af tumorvæv [8], og i stedet argumentere for “fænotypisk plasticitet” af tumorceller [9], som vedligeholdes af homeostatiske mekanismer [10]. Derfor behøver CSCS ikke eksistere som en unik population defineret af diskrete molekylære egenskaber, men snarere sammen med deres differentierede afkom udgør en selvstændig gengivelse “stamcelle-system”, hvor den cellulære sammensætning er reguleret af interomdannelse af forskellige differentieringsfaktorer stater [9]. Tumorer i epitelial oprindelse (karcinomer) viser som regel høj histologisk heterogenitet afspejler forskellige differentiering stater i de enkelte celler. Baseret på tre fænotypiske kriterier – celle polarisering, celle sammenhæng og udtryk mønster af cytoplasmatisk mellemliggende endeløse (CIF) proteiner – det er blevet foreslået at definere fire fænotyper, der spænder fra rent epitelial til helt mesenkymale [11]. Følgelig differentieringen tilstand af individuelle celler i carcinomer svarer til en epitel, et mesenkymale og et mellemliggende fænotype. Disse differentiering tilstande kan yderligere opdeles i stabile og forbigående undertyper, der tilsammen er samlet i en dynamisk “økosystem”. Processen kaldes epitel-mesenkymale overgang (EMT) og dens modstykke, betegnes mesenchymale-epitelial overgang (MET) [12], [13], beskriver omdannelsen af ​​modsatte differentiering stater. Disse overgange er for nylig blevet forbundet med celle stemness af den iagttagelse, at induktionen af ​​EMT i humane brystepithelceller cellekulturmodeller skaber en delmængde af celler stærkt beriget i CSCS [14], [15]. Modellen kommer ud fra disse undersøgelser foreslår, at i carcinomer EMT og MET hensyn til generering af en delmængde af celler, som er i balance med tumoren epithelial rum og er i stand til at regenerere hele tumorcellepopulation [9].

Transgene og knockout-mus giver syngene (eller kongene) modeller for CSC forskning, da de tillader at etablere kræftsygdomme i immun-kompetent dyr, der efterligner den tilsvarende menneskelige situation, og er en kilde til cellelinier muliggør studier af CSC egenskaber. Imidlertid er egnetheden af ​​musemodeller ofte begrænset af, at virkningerne af ekspression af et onkogen, eller tab af en tumor suppressor, udøves allerede på fosterstadiet og under vævsudvikling, mens der i langt de fleste humane cancere genetiske ændringer, der fører til cancer vil forekomme i celler af voksne væv. WAP-T transgene mus [16] – [19] har vist sig at være en nyttig model til analyse af onkogen-induceret brystkirtler carcinogenese hos voksne mus. I kvindelige WAP-T-mus aktivering af transgenet, abevirus 40 (SV40) tidlig genregion flankeret af en ~1.4 kb opstrøms region af genet, der koder for muse surt valleprotein (WAP) [20], startes under sent graviditet i brystkirtler epitelial (ME) celler samstemmende med den endogene

Wap

gen [21]. Ekspression af SV40 tidlige gener koder for store T-antigen (LT) og lille T-antigen (st) driver mammary carcinogenese ved at efterligne en række genetiske ændringer almindeligvis ses i humane brystcarcinomer, ligesom ophævelse af pRB-kontrollerede G1-kontrolpunkt [ ,,,0],22], og inaktivering af tumor suppressor p53 [23]. Som følge af SV40 tidlig genekspression, af tomme WAP-T mus udvikler multiple alveolære læsioner – multifokale intraepitelialneoplasi (min). Nogle af disse fokale læsioner komme videre til invasiv, men sjældent metastatiske brystcarcinomer [19]. Morfologisk, tumorer udvikler i WAP-T mus adenocarcinomer, der spænder fra en brønd til en dårligt differentieret fænotype [16]. Relevansen af ​​denne model understreges af den tætte lighed i histologi af musetumorer med tilsvarende humane tumorer [19].

I denne undersøgelse spurgte vi, om WAP-T tumorer er bedre beskrevet af den klassiske CSC model eller ved alternative hypoteser. Vi fandt, at tumorigene celler er relativt hyppige i WAP-T tumorer (op til 1/10) og er i stand til at rekapitulere fænotypen af ​​deres respektive primære tumorer efter ortotopisk transplantation i syngene mus. For at studere deres tumorigene egenskaber nærmere, vi etableret fra en WAP-T-tumor en cellelinie (G-2 celler). G-2 celler med høj effektivitet danner tumorer i syngene mus, der ved genekspression og fænotypiske analyser er tæt relateret til primære tumorer. G-2 cellekulturer er karakteriseret ved en basal /luminale genekspression underskrift, heterogenitet differentieringsfaktorer stater og tilstedeværelsen af ​​komplementære cellulære delmængder, der kan adskilles ifølge forskelle i ekspression af visse stemness-relateret celleoverflademarkører. Vi viser, at stringent FACS-separerede delmængder af G-2-celler er kompetente til at rekonstituere den oprindelige cellulære sammensætning af cellekulturen når individuelt dyrket. Vores data argumentere for en selvstændig gengivelse homøostatiske “kræft celle system”, hvor balancen er afhængig interkonvertering af de komplementære cellulære delmængder, deres samspil og transkriptionel kompetence. Til støtte for EMT-CSC model [9], identificerede vi i G-2 kultur en selvfornyende population af celler karakteriseret ved ekspression af Thy1 og vise spontan reversibilitet af en kvasi-mesenkymal differentiering tilstand.

Resultater

WAP-T tumorer indeholder en høj andel af tumorigene celler

et afgørende kriterium for CSCS er deres evne til at initiere tumorvækst efter transplantation i passende modtagende mus og at rekapitulere fænotype af den oprindelige svulst. Ortotopisk transplantation af serielt fortyndede WAP-T tumorceller viste, at så lav som 10

2 celler fra godt til moderat differentierede (lav kvalitet) tumorer, og så lavt som 10

1 celler fra dårligt differentierede (high-grade ) tumorer var i stand til at inducere brystcarcinomer i syngene mus (figur 1A). Transplanterede tumorer afspejles normalt fænotypen af ​​de parentale tumorer (figur 1b). Men transplantation af celler fra en lav kvalitet tumor undertiden gav også anledning til high-grade tumorer. Som pauci-klonalitet af WAP-T tumorer er lejlighedsvis observeret [17], at udvækst af celler fra en høj kvalitet tumor celle pulje kan ikke udelukkes.

(A) Celler fra high-grade WAP-T tumorer er mere tumorigen end celler fra lav kvalitet tumorer. Seriefortyndet (10

1, 10

2, 10

3, 10

4) frisk isolerede WAP-T-tumorceller blev injiceret i venstre abdominale brystkirtel som beskrevet i Materialer og Metoder. (B) H B og C: 200 um; D og E: 20 pm; F, G, H og J: 100 pm; K:. 50 pm

Da konstitutive

Wap

geners aktivitet har været forbundet med begået bipotente alveolære stamfædre og CD61

+ luminale-begrænset stamfædre, som er sandsynlige mål for onkogen aktivitet [24], udførte vi en cellelinie analyse ved immunfluorescens (IF) farvning for den luminale epitelceller markør keratin 18 (Krt18), de basale /myoepithelial cellemarkører keratin 5 (Krt5) og keratin 14 (Krt14). I tidlige passager størstedelen af ​​G-2-celler udtrykte både Krt14 (figur 2G) og Krt18 mellemliggende endeløse proteiner (Figur 2H); men den sædvanlige copolymerisation partner Krt14, den Krt5 proteinet, ikke var detekterbar ved et specifikt antistof (data ikke vist). I efterfølgende passager små variationer i de enkelte ekspressionsniveauer af Krt14 og Krt18 (data ikke vist) og en betydelig fluktuation i antallet af cytokeratin-udtrykkende celler mellem 40 til 70% blev observeret. Figur 2I viser som et eksempel FACS-baserede kvantificering af Krt18 udtryk i G-2-celler ved passage 20, hvilket indikerer overgangen til en mesenchymal differentiering tilstand. Derfor ekspression af mellemproduktet filamentprotein vimentin blev analyseret som et udbredt markør for mesenkymale celler og carcinomaceller undergår overgang mellem epitel- og mesenchymale differentieringsfaktorer stater [25], [26]. Uafhængigt af passage nummer næsten alle G-2 celler udtrykker vimentin, hvorved intensiteten af ​​vimentin udtryk spænder fra en diffus cytoplasmatisk fordeling og svage trådformede strukturer til en rigelig trådformede netværk (Figur 2J-K viser vimentin /SV40-LT og vimentin /Krt18 co -staining ved passage 10). Figur 2L viser som eksempel FACS-baserede kvantificering af vimentin ekspression i G-2-celler ved passage 20. SV40-LT-ekspression blev detekteret næsten altid også i celler kraftigt udtrykkende vimentin (Fig 2J). Men kun få celler, der mangler SV40-LT var altid til stede i G-2-kulturer (figur 2J, mærket med pile). Sammenfattende ved immunofarvning analyse observerede vi først at størstedelen af ​​G-2-celler er kendetegnet ved en differentiering tilstand karakteriseret ved co-ekspression af vimentin og cytokeratiner, dels at antallet af celler blottet for cytokeratiner svinger mellem passage, og for det tredje, at en mindre population af celler, der udtrykker cytokeratiner men helt mangler vimentin er altid til stede.

en sådan heterogenitet i differentieringsfaktorer stater kan afspejle en multiclonal oprindelse G-2 cellekultur, som denne kultur blev afledt af en hel tumor. For at løse denne mulighed, blev G-2-celler klonet i blød agar, og ti kolonier blev ekspanderet til stabile cellelinjer. Som visualiseret ved IF-farvning, blev G-2 celle mønster af cytokeratin ekspression gengivet i G-2 celleafledt kloner (figur S1A-B; vist som eksempel for kloner G-2C9 og G-2C11), selv om der ifølge qPCR analyse de relative niveauer af

Krt14

Krt18

genekspression varierede markant mellem kloner (figur S1c-D). Også i de sekundære kloner, der er afledt af agar kloning fra G-2C9 og G-2C11 kloner, en 2-3 fold variation i transskription af

Krt14

Krt18

gener kunne påvises ( Figur S1E-F). Svarende til den parentale dyrkning blev observeret heterogen ekspression af vimentin i G-2 cellekloner (Figur S1G). , Konkluderer derfor vi, at tilstedeværelsen af ​​cellepopulationer i epitel, mesenkymale og mellemliggende differentiering stater er en iboende egenskab af G-2 kulturer.

b)

In vivo

.

Vi testede tumorfremkaldende potentiale af G-2-celler ved ortotopisk transplantation ind i venstre abdominale mælkekirtler barnløse WAP-T recipientmus. 10

6 G-2 celler hurtigt dannet palpable tumorer (high-grade adenocarcinomer) i alle modtagende mus (tabel 1). Jo færre celler vi transplanteret, jo længere var lag-periode, og desto højere er dens variation (tabel 1). Selv fra 10 injiceret G-2-celler i 10 ud af 12 recipientmus tumorudvækst blev påvist (tabel 1), hvilket indikerer en høj frekvens af tumorigene celler i G-2 kultur. Immunfarvning analyse af vimentin og Krt8 /18 ekspression i G-2 celle-afledte tumorer (figur 3A) viser deres tætte lighed med dårligt differentieret (grad G3) WAP-T tumorer (figur 3B). Mens i lav kvalitet WAP-T tumorer vimentin farvning blev det meste begrænset til septa og det stromale rum (figur 3C), variabel ekspression af vimentin var også detekterbar i epitel kammer (ved Krt8 /18) i høj kvalitet WAP-T tumorer (figur 3B), hvilket indikerer et mellemliggende differentiering tilstand af tumorceller i G-2 afledt og ædelstål WAP-T tumorer og en epitheldifferentiering tilstand af tumorceller i lav kvalitet WAP-T tumorer. Co-farvning for vimentin og SV40-LT (ekspression af SV40-LT er begrænset til tumorceller) gør det muligt at skelne mellem stromale mesenchymal-celler rekrutteret ind i tumorer og tumorceller, der udtrykker en mesenchymal eller et mellemprodukt fænotype. I transplanterede G-2 tumorer (figur 4A) og high-grade WAP-T tumorer (figur 4B) observerede vi ud over den forventede ekspression af vimentin i det stromale rum også co-ekspression af vimentin og SV40-LT i individuel tumor celler. I modsætning hertil lav kvalitet WAP-T tumorer (figur 4C) vimentin og SV40-LT-ekspression er begrænset til stromale og tumor epitel rum hhv. Tumorer vokset fra transplanterede G-2-celler (figur 5A) opsummerede de særlige kendetegn ved høj kvalitet WAP-T tumorer (Figur 5B), nemlig en mindre andel af celler co-udtrykkende Krt14 og Krt8 /18. I modsætning hertil Krt8 /Krt18 og Krt14 i lav kvalitet WAP-T tumorer er ofte co-udtrykkes (figur 5C).

(A-C) Repræsentative konfokale billeder af tumor-snit af frosset en G-2 celle -afledt tumor (a), og en høj kvalitet (B) og en lav kvalitet (C) endogen WAP-T tumor farvet med anti-vimentin (grøn) og anti-keratin 8/18 (røde) antistoffer. Kernerne blev farvet med DRAQ5 (blå). De elektriske mellemværker bruges til at vise co-ekspression af vimentin og keratin 8/18 i G-2 og high-grade WAP-T tumorer. De hvide stiplede linjer markerer stromale strukturer. De konfokale 3D-stakke blev deconvoluted hjælp Huygens Essential software og rekonstrueret med Imaris software. Målestok: hovedbilledet: 30 pm; forstørrelse: 3 um

(A-C) Repræsentative konfokale billeder af tumor-snit af frosset en G-2 celle-afledt tumor (A), en høj kvalitet (B) og en lav-. bedømmelse (C) endogen WAP-T tumor farvet med anti-vimentin (grøn) og anti-SV40-LT (røde) antistoffer. Kernerne blev farvet med DRAQ5 (blå). De elektriske mellemværker bruges til at vise co-ekspression af vimentin og SV40-LT i G-2 og high-grade WAP-T tumorer. De hvide stiplede linjer markerer stromale strukturer. De konfokale 3D-stakke blev deconvoluted hjælp Huygens Essential software og rekonstrueret med Imaris software. Målestok: hovedbilledet: 50 pm; forstørrelse: 6 um

(A-C) Repræsentative konfokale billeder af tumor-snit af frosset en G-2 celle-afledt tumor (A), en høj kvalitet (B) og en lav-. bedømmelse (C) endogen WAP-T tumor farvet med anti-keratin 8/18 (grøn) og anti-keratin 14 (røde) antistoffer. Kernerne blev farvet med DRAQ5 (blå). De elektriske mellemværker bruges til at vise co-ekspression af keratin 8/18 og keratin 14 i G-2, høj kvalitet og lav kvalitet WAP-T tumorer. De konfokale 3D-stakke blev deconvoluted hjælp Huygens Essential software og rekonstrueret med Imaris software. Målestok: hovedbilledet: 50 pm; forstørrelse:. 6 um

I et yderligere forsøg blev 10

6 G-2 celler transplanteret ind fad puder af to ikke-transgene BALB /c mus. I begge mus store, faste tumorer voksede efter 4-6 uger. Interessant tumorcellerne var stort set blottet for epiteliale markører, EpCAM (fig S2A) og cytokeratiner (fig S2B, D), men udtrykkes kraftigt vimentin (Fig S2B, C), hvilket indikerer, at i ikke-transgene mus overgang til mesenkymale tilstand er begunstiget, muligvis som følge af en interaktion med værtens immunsystem. Som tumorcellerne ved med at udtrykke WAP-promotor drevne SV40-LT (fig S2C), er det sandsynligt, at mesenkymale differentiering i disse celler var ufuldstændig.

c) genekspressionsprofilering.

histomorfologisk lighed mellem G-2 celle transplanteret og WAP-T tumorer viser, at disse tumorer også kan være tæt forbundet på det molekylære niveau. Baseret på den sammenlignelige udtryk for CIF proteiner, forventede vi også en tæt sammenhæng mellem G-2 celler i kultur og i G-2 tumorer. For at teste disse antagelser, vi udførte microarray udtryk profilering. Total RNA fra G-2, G-2C9 og G-2C11 celler, fra to G-2 transplanterede tumorer samt fra fire WAP-T-NP8 tumorer repræsenterer fire histologiske kvaliteter (G1-G4) blev analyseret på en Affymetrix microarray platform (MOE430 2.0). Anvendelse som signifikans kriterier Corr. P-værdi (Benjamini-Hochberg) = 0,05, og en fold change-cutoff 3, vi identificeret 250 gener, der blev differentielt udtrykt mellem cellekultur og tumorprøver (tabel S1). Stramning af statistiske kriterier til en corr. P-værdi = 0,01, kun 24 gener opfyldte disse strenge kriterier. De 250 differentielt udtrykte gener blev yderligere analyseret af EXPANDER program for at identificere overrepræsenterede GO (gen ontologi) kategorier og TF (transskription faktor) bindingssteder i deres

cis

reguleringsmyndigheder regioner [27]. GO-berigelse analyse blev kombineret med hierarkisk klyngedannelse, og resultaterne er præsenteret i varmen kortet vist i figur 6A. Et betydeligt antal differentielt udtrykte gener falder ind under kategorien af ​​immunforsvar gener, hvilket afspejler, at tumorer indeholde en vis betinget af immunceller, som mangler i cellekultur. Berigelse af gener relateret til immunprocesser korrelerer godt med overrepræsentation af bindingssteder for Elf1, en transkriptionsfaktor højt udtrykt i lymfoide celler [28], i promotorregionerne af de differentielt udtrykte gener (P-værdi 0,001) . På den anden side er de cellekultur prøver kendetegnet ved en højere ekspression af gener forbundet med transkriptionel regulering, f.eks

Foxa2

,

Foxm1

,

Gata6

,

Hoxb2

,

Jmjd2c

,

Ppargc1a

, og

Tle1

og udviklingsprocesser, fx

BMP4

som er involveret i differentieringen af ​​mesenkymale celler. Denne observation kan forklares ved tilpasning af den transkriptionelle netværk og signalveje til celle dyrkningsbetingelser. Tilsammen genekspression analyse viste, at G-2 celler og tumorer vise flere ligheder end forskelle i deres genekspression program; forskellene er primært relateret til deres forskellige biologiske kontekst.

(A) 250 gener udtrykkes forskelligt i dyrkede G-2 celler og endogene WAP-T eller G-2 celle afledte tumorer (tabel S1) blev anvendt til at generere et zonekort. Beriget GO kategorier vises som bar diagrammer svarende til højere eller lavere udtrykte gen klynger i de respektive prøve gruppen. Farvekodning og højden af ​​en søjle repræsenterer den statistiske signifikans (-log

10 (p-værdi)) af den observerede berigelse af de respektive GO kategorier. (B) Gener karakteristiske for luminale-ER

+, luminale-ER

– og basal /myoepitelcellerne blev brugt til at generere varme maps. Genekspression data opnået for cellekultur (G-2, G-2C9 og G-2C11-celler) og tumorprøver (to G-2 transplanterede tumorer og fire WAP-T-NP8 tumorer repræsenterer fire histologiske kvaliteter) blev anvendt til denne analyse. Genekspression intensiteter af en brystkirtel hos et af tomme BALB /c-mus (50 dage efter fravænning) blev anvendt som reference. Fremtrædende gen klynger (

Krt14

,

Vim

,

Krt5

,

Krt18

, og

ESR1

) er fremhævet med gule kasser . Udtrykket værdier er farvekodet: rød – høj ekspression, blå – lav udtryk

Vi regnede med, at genekspression analyse skal hjælpe til at lokalisere G-2 celler i mamma epitelcelle hierarki.. Ved hjælp af en liste af gener karakteristisk for luminale-ER

+, luminale-ER

– og basale /myoepitelcellerne [29] (tabel S1), og genekspression profil mælkekirtler en af ​​tomme BALB /c-mus (50 dage efter afvænning) som reference, hierarkisk klyngeanalyse igen afslørede lighed mellem cellekultur og tumorprøver (figur 6B). Desuden er en kompleks transkriptionel der omfatter mange gener fra alle tre afstamninger blev klart. Især

ESR1

(koder for østrogen receptor alpha) er inde i en klynge af nedreguleret “luminale-ER

+” gener,

Vim

(koder for vimentin) i klyngen af ikke-regulerede gener,

Krt14

er placeret i klyngen af ​​opreguleret “basale” gener, mens

Krt5

sammen med en række andre gener danner en klynge af nedreguleret ” basale “gener, i overensstemmelse med fraværet af Krt5 udtryk i G-2 cellekulturer og den sjældne forekomst af Krt5-postive celler i WAP-T tumorer (data ikke vist). Baseret på denne analyse, konkluderer vi, at G-2 celle transkriptom sandsynligvis er relateret til celler forpligtet til luminale-ER

– differentiering. Disse celler kan være stamfædre af luminale-ER

– celler, som under engagement mistet udtryk for prominente markører, ligesom

ESR1

Krt5

– gener funktionelt knyttet til luminale-ER

+ og basal cellelinier, og blev udødeliggjort med SV40 proteiner. Men endelig afklaring af deres identitet kræver yderligere undersøgelser.

Stemness af G-2-celler og deres klonale derivater

Den høje tumorigent potentiale G-2-celler fik os til at studere deres CSC ejendomme i flere detaljer. Vi udførte en række standard assays til måling af ekspression af et sæt af celleoverflademarkører, selvfornyelse, og generering af fænotypisk forskellige afkom (kollektivt betegnet repopulation aktivitet), aktivitet af aldehyddehydrogenaser, og kolonidannende potentiale.

a) celleoverflademarkører.

Ekspression af visse celleoverflade associerede proteiner, såsom integriner og GPI-forankrede proteiner, er diagnostisk for normale bryst-stamceller og brystcancer stamceller. Ved FACS observerede vi, at næsten alle G-2-celler udtrykker stemness-relaterede markører CD29 (integrin beta 1) [30] (figur 7A) og CD44 (hyaluronat receptor) [31] (figur 7B). En stor del af G-2-celler er positive for EpCAM (epitelcelleadhæsionsmolekyle) [31], [32] (figur 7C, venstre), der co-udtrykkes med CD24a og CD49f (integrin alpha 6) proteiner [30] , [33] – [35] (figur 7C, højre). En anden mamma stamfader-associeret markør, CD61 (integrin beta 3) [36], blev opdaget på en stor del af G-2-celler (figur 7D, venstre) og er også co-udtrykkes med CD24a og CD49f (figur 7D, til højre) . Derfor vi kollektivt betegnet den del af G-2-celler co-udtrykker disse cellemembran associerede proteiner som CD24a

høj delmængde. Udsving mellem -30% til -90% i det absolutte antal af celler i denne undergruppe blev bemærket mellem parentale G-2-celler og kloner (data ikke vist). Dernæst vi observeret, at modstykket til CD24a

høj delmængde (figur 7E, til venstre) er kendetegnet ved ekspression af stamcelle markør Sca1 [37] (figur 7E, højre). Tilsammen G-2 kultur omfatter to store adskilte delmængder, CD24a

høj /Sca1

lav og CD24a

lav /Sca1

høj. SV40 transgen lige transkriberes i begge delmængder, men transkriptionen af ​​Krt14 og Krt18 gener er højere i CD24a

høj /Sca1

lave celler (figur S3A, B). Vi har også observeret af qPCR-analyse at

Cd24a

,

CD49f

og

Sca1

gener transskriberes i begge delmængder (Figur S3C).

(A, B) Repræsentative FACS dot plots viser ekspressionen af ​​CD29 (A) og CD44 (B) i G-2 dyrkede celler. (C) Repræsentative FACS dot plots viser ekspressionen af ​​EpCAM (C, til venstre) i dyrkede G-2-celler og fordelingen af ​​CD24a og CD49f (C, til højre) i EpCAM

høj cellepopulation.