PLoS ONE: MikroRNA’er associeret med metastatisk prostata Cancer

Abstrakt

Målsætning

Metastase er den mest almindelige dødsårsag af patienter med prostatacancer. Identifikation af specifikke metastase biomarkører og nye terapeutiske mål betragtes som afgørende for forbedret prognose og behandling af sygdommen. MikroRNA’er (miRNA) udgør en klasse af ikke-kodende små RNA molekyler anses for at være vigtige regulatorer af genekspression. Deres fejlregulering er blevet vist at spille en rolle i cancer indtræden, progression og metastase, og miRNA repræsenterer en lovende ny klasse af kræft biomarkører. Formålet med denne undersøgelse var at identificere ned- og op-regulerede miRNA i prostatakræft, der kunne give potentielle biomarkører og /eller terapeutiske mål for prostatakræft metastaser.

Metoder

Næste generation sekventering teknologi blev anvendt til at identificere differentielt udtrykte miRNA i en transplanterbar metastatisk versus en non-metastatisk prostatacancer xenotransplantat linje, begge afledt fra en patient primære cancer. De xenotransplantater blev udviklet via subrenal kapsel podning af kræft

væv

i NOD /SCID-mus, en metode, der har tendens til at bevare egenskaberne af de oprindelige kræftformer (f.eks tumor heterogenitet, genetiske profiler).

Resultater

differentielt udtrykte kendte miRNA, isomiRs og 36 nye miRNA blev identificeret. En række af disse miRNA (21/104) er tidligere blevet rapporteret at udvise tilsvarende ned- eller opregulering i prostatacancere forhold til normale prostatavæv, og nogle af dem (f.eks MIR-16, MIR-34a, MIR-126 *, miR-145, miR-205) er blevet knyttet til prostatakræft metastase, støtter gyldigheden af ​​den analytiske tilgang.

konklusioner

brugen af ​​metastatisk og ikke-metastatisk prostatacancer subrenal kapsel xenografter afledt fra en patients kræft gør det sandsynligt, at de differentielt udtrykte miRNA er identificeret i denne undersøgelse omfatter potentielle biomarkører og /eller terapeutiske mål for menneskelig prostatakræft metastaser

Henvisning:. Watahiki A, Wang Y, Morris J, Dennis K, O’Dwyer HM, Gleave M, et al. (2011) MikroRNA’er associeret med metastatisk prostatacancer. PLoS ONE 6 (9): e24950. doi: 10,1371 /journal.pone.0024950

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: Februar 25, 2011; Accepteret: August 24, 2011; Udgivet den 30. september, 2011

Copyright: © 2011 Watahiki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (YZW /MG). YZW er en modtager af en Overseas Chinese Scholar Award fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.928.027), og en modtager af et innovativt Scholar Award fra International Cancer Alliance for Cancer Research og Uddannelsesudvalget og fibrolamellar Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige kræftform hos mænd og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald i USA [1]. Mens betydelige fremskridt er blevet gjort i behandlingen af ​​lokaliserede, orgel-begrænset tumorer, prostatacancer er for tiden uhelbredelig, når det har udviklet sig til metastase, og de fleste dødsfald af denne sygdom skyldes metastaser, som er meget resistente over for konventionelle terapier. Øjeblikket, prostata-specifikt antigen (PSA) er en væsentlig serum biomarkør anvendes til påvisning og overvågning af prostatacancer progression. Men den prognostiske værdi af øgede PSA niveauer er begrænset, eftersom fremskreden prostatacancer kan være forbundet med meget lave eller normale PSA-værdierne. Der er derfor et presserende behov for nye, mere specifikke biomarkører, som kan anvendes til at forudsige udviklingen af ​​kræft i sig selv eller i samarbejde med en aktuel biomarkør, såsom PSA [2]. Endvidere er et presserende behov hidtil ukendte terapeutiske mål forbundet med prostatacancer metastaser. Salg

MikroRNA’er (miRNA) er små ikke-kodende RNA’er (17 til 27 nukleotider), som negativt regulerer ekspressionen af ​​målgener ved at binde til 3′-utranslaterede regioner (UTR’er) af mRNA’er og hæmme oversættelse eller fremme mRNA nedbrydning [3]. Nylige undersøgelser har vist dysregulering af miRNA i humane tumorer indikerer en rolle for sådanne molekyler i kræft patogenese, herunder cancer indtræden, progression og metastase [4], [5]. Indtil videre har kun et lille antal undersøgelser undersøgt miRNA udtryk i prostatakræft, og kun få har beskæftiget sig med metastaser af denne sygdom. Forskelle i udtrykket profiler af miRNA hidtil identificerede kan have prognostisk værdi for de forskellige aspekter af sygdommen og en bedre forståelse af den rolle, miRNA i udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer er behov [6]. Yderligere forskning kan også føre til identifikation af nye miRNA, der er specifikt relateret til prostatakræft progression og metastase. Sådanne metastase-associerede miRNA kan tjene som metastatiske biomarkører og /eller nye mål for behandling af metastatisk sygdom.

Studier formål at identificere genetiske faktorer med centrale roller i prostatacancer metastaser er blevet hæmmet af manglen på optimale forsøgsmodeller . Mens xenograftmodeller baseret på etablerede cancercellelinier repræsenterer forskellige stadier af cancer progression kan være nyttige til identifikation af underliggende mekanismer metastase, de ikke tilstrækkeligt efterligner klinisk sygdom [7]. Indsatsen har derfor fokuseret på brugen af ​​patienternes prostatakræft

væv

. Men den typiske heterogenitet af sådanne væv, der består af både ikke-metastatiske og potentielt metastatiske subpopulationer, gør det vanskeligt at identificere faktorer som gener, der ligger til grund for udviklingen af ​​metastaser [8]. Desuden er det vanskeligt at opnå metastatisk prostatacancer væv fra patienter til forsøg, da de ikke rutinemæssigt eller indpasses biopsi eller resektion fra patienter, og hurtige obduktion programmer er ekstremt dyre og vanskelige at håndtere. For at overvinde de ovennævnte forhindringer, vi udviklet næste generation patient-afledte prostatakræft xenograftmodeller, der ligger tættere den kliniske situation, ved at bruge subrenal kapsel podning af patienternes kræft væv ind svækket immunforsvar mus. Denne metodologi favoriserer bibeholdelse af egenskaberne af de oprindelige cancere [9] – [11]. Endvidere har det været muligt at etablere transplanterbare, metastatiske og ikke-metastatisk prostatacancer underlinjer fra heterogene xenografter [12], [13]. Anvendelse af metastatiske og ikke-metastatiske xenotransplantater har allerede været effektive i identifikationen af ​​prostatacancer metastase-associerede gener [13].

Illumina s massivt parallelle DNA sekventering ved syntese teknologi er en bredt vedtaget næste generation sekventering platform . Det understøtter parallel sekventering under anvendelse af en navnebeskyttet reversibel terminator-baserede metode, der muliggør påvisning af enkelte baser, som de er inkorporeret i voksende DNA-strenge. En fluorescens-mærket terminator afbildes som tilsættes hver dNTP og derefter spaltes for at muliggøre inkorporering af den næste base. Eftersom alle fire vendbare terminator-bundne dNTP’er er til stede under hver sekventering cyklus, naturlig konkurrence minimerer inkorporeringen forspænding, hvilket fører til sand bund-by-basen sekventering [14].

I den foreliggende undersøgelse, Illumina næste generation sekventering teknologi blev anvendt til at sammenligne miRNA profiler af en transplanterbar metastatisk versus en non-metastatisk prostatacancer xenotransplantat linje, begge afledt via subrenal kapsel podning [10] – [12] fra en patient primære cancervæv. Differentielt udtrykt kendte og hidtil ukendte miRNA fundet, der kan have specifikke roller i metastase af prostatacancer.

Materialer og metoder Salg

Patient-afledte prostatacancer xenograftmodeller

NOD /SCID-mus anvendes til xenografting blev opdrættet og vedligeholdes på det British Columbia Cancer Research Centre Animal Facility (Vancouver, Canada). Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af University of British Columbia Animal Care udvalg (A10-0100). En prostatakræft biopsi prøve blev opnået ved BC Cancer Agency med patientens skriftligt informeret samtykke. Etisk godkendelse blev leveret af University of British Columbia -. British Columbia Cancer Agency Research Ethics Board (UBC BCCA REB # H04-60131)

Etableringen af ​​transplanterbare prostata cancer væv xenograft linjer via subrenal kapsel podning er blevet beskrevet tidligere [9]. I den foreliggende undersøgelse, en nyligt fremstillet metastatisk prostatacancer xenotransplantat linje, LTL-313H [15], og en ikke-metastatisk modstykke, LTL-313B (upubliceret), blev anvendt som var blevet afledt fra forskellige loci i en patients prostatakræft biopsi prøve (www.livingtumorlab.com). Begge linjer var PSA- og AR-positive som vist via immunhistokemi ([15]; upublicerede data). De blev rutinemæssigt holdt under renale kapsler af mandlige NOD /SCID-mus suppleret med testosteron, som tidligere beskrevet [9]. De LTL-313H xenotransplantater viste invasion af muse host nyre og cancerceller blev detekteret i lungerne hos værterne efter 3 måneders podning. I modsætning hertil viste LTL-313b xenografter ingen indlysende invasion af musen nyre og viste ingen fjernmetastaser (data ikke vist).

Lille RNA bibliotek konstruktion og cDNA sekventering

LTL- 313H og LTL-313B xenograft væv blev opsamlet, og RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Mississauga, ON, Canada) ifølge producentens instruktioner. RNA blev forelagt for Genome Sciences Centre ved British Columbia Cancer Agency (www.bcgsc.bc.ca) for små-RNA cDNA bibliotek konstruktion og sekventering som beskrevet tidligere [16] med mindre modifikationer. Hvert bibliotek havde en specifik indeks sekvens i 5′-adapter, dvs. “ACATCGA” til LTL-313H bibliotek og “CGTGATA” til LTL-313B bibliotek; begge biblioteker blev blandet, og sekventering blev kørt i et flow celle i Illumina platform.

Lille RNA kortlægning og differential udtryk afsløring

5 ‘indekseret cDNA sekvenser blev anvendt til at skelne oprindelsen af RNA’erne. 3’Adaptor-sekvenser blev fjernet fra alle læser og de resterende koder, der var 16 til 27 nukleotider i længden og udtrykt på et tag optælling af 2 eller flere i hvert bibliotek blev anvendt til yderligere analyse. De klippede sekvenser blev kortlagt til miRBase 15 human stem-loop-sekvenser (https://www.mirbase.org/) ved hjælp af Novoalign (www.novocraft.com) program giver mulighed for op til 3 uoverensstemmelser. De, der matchede en miRBase sekvens blev derefter grupperes som: 1) kendte modne miRNA og miRNA *, 2) formodet miRNA *, der ikke tidligere er rapporteret i miRBase, 3) loop sekvenser og 4) sekvenser, der matchede loop-sekvens, men gjorde ikke har kendt modne sekvenser. Sekvenserne matcher kendte miRNA blev yderligere grupperet baseret på deres udgangspositioner, og tælles. De hyppigst forekommende variation /udgangsposition tags blev anvendt til sammenligning mellem bibliotekerne. Tag tællinger blev normaliseret til de samlede tællinger af de sekvenser, som matcher de miRBase 15 stem-loop-sekvenser og de to biblioteker blev sammenlignet for differentiel ekspression af sekvenserne under anvendelse af Fishers eksakte test med Bonferroni korrektion. Sekvenser blev anset signifikant forskelligt udtrykt ved de to biblioteker, hvis p-værdien var. 0,001 og der var mindst en 2-gange ændring i sekvenserne “normaliserede tællinger

Novel miRNA identifikation

sekvenserne, der ikke matcher kendte miRNA stem-loop sekvenser blev filtreret ud med kendte udskrifter sekvenser downloadet fra UCSC [17]. At identificere nye miRNA kandidater blandt de resterende umatchede sekvenser blev miRanalyzer programmet [18] anvendte (https://web.bioinformatics.cicbiogune.es/microRNA/miRanalyser.php). Output kandidater blev kontrolleret én efter én for homologier til kendte ikke-kodende RNA, og ikke-homologe sekvenser blev taget som nye miRNA kandidater.

miRNA mål forudsigelse og sti analyse

målgener for hver differentielt udtrykte miRNA blev forudsagt ved hjælp mikrokosmos-version 5 [19], [20] med en tærskel på

s

= 0,001. Som nogle af de gener potentielt blev reguleret af både opreguleret og nedreguleret miRNA, fokuserede vi for yderligere analyser af de gener, der var potentielt reguleres kun ved opreguleret eller nedreguleret miRNA. Identifikation af Kegg veje er forbundet med potentielle målgener blev udført ved hjælp af DAVID 6.7 (Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Desuden har vi sammenlignede target gen lister med genekspression data ved microarray under anvendelse af de samme xenograft væv for at identificere de formodede mål, der kan reguleres på mRNA niveau.

Microarray genekspression analyse

det RNA, som blev anvendt til miRNA sekventering bibliotek blev også anvendt til mRNA-baserede genekspression analyse under anvendelse af Agilent human GE 44K platform på Vancouver Prostate Centre Microarray Facility (www.mafpc.ca). Alle data er MIAME kompatibel og de rå data er blevet deponeret i GEO (tiltrædelse nummer GSE28029). Udtrykket signal blev transformeret til z-score og beregnet z-forholdet og de mRNA’er med mere end 1,96 af z-forholdet blev behandlet opreguleret og mindre end -1,96 som nedreguleret [21]. Dataene blev også filtreret ved Flag.

Celledyrkning

22Rv1 prostatacancer-cellelinie blev dyrket i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2.

miRNA precursor transfektion

precursor-sekvensen af ​​mir-486, vist i miRBase, og en ikke-silencing negativ kontrol blev subklonet i den pcDNA6.2-GW /EmGFP miR plasmid (Invitrogen). 22Rv1 celler blev podet i 12 brønds-plader ved en tæthed på 1,0 x 10

5 celler per brønd, 24 timer før transfektion. Transfektion blev udført ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ved at følge producentens instruktioner. Transfektionseffektiviteten blev valideret af GFP signalovervågning anvendelse af et omvendt fluorescensmikroskop systemet (Zeiss). For at bekræfte forhøjede niveauer af modne mål miRNA, blev en del af de transficerede celler anvendt til validering af kvantitative (qPCR). Til dette formål blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af et miRNeasy mini kit (Qiagen), og mængden af ​​RNA bestemt ved NanoDrop spektrofotometri (Thermo Scientific). Dele (25 ng) af hver af de samlede RNA-præparater blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af en Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon) ifølge producentens instruktioner. CDNA’et blev fortyndet og blandet med microRNA LNA PCR-primere og SYBR Green Master Mix (Exiqon). qPCR blev udført under anvendelse af en ABIPrism 7900HT (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner. Den ΔΔCT blev anvendt til beregning af folden skifter i forhold til kontrollen og U6 blev anvendt som en endogen kontrol.

MTT assay

De transficerede celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 1 × 10

4 celler /brønd. MTT-opløsning (20 pi af 5 mg /ml) blev tilsat til kulturerne (200 pi volumen) for en 4 timers inkubation ved 37 ° C. Efter fjernelse af dyrkningsmediet, blev de resterende krystaller opløst i DMSO, og absorbans ved 570 nm blev målt.

Migration /invasion assay

BioCoat Matrigel invasion kamre (BD Biosciences) blev anvendt til at måle væv invasiv af celler. I de øvre kamre, 1 x 10

5 celler /brønd blev udpladet i 0,50 ml serum-frit medium. I de nedre kamre, 0,75 ml medium /10% FBS blev leveret. Kamrene blev inkuberet i 30 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. De celler, der forblev i det øvre kammer blev fjernet, og transmigrated cellerne fikseret i methanol og farvet med krystalviolet og farvede celler blev talt ved mikroskopisk analyse. Tumorcelleinvasion blev udtrykt som procentdelen af ​​celler, der havde passeret gennem Matrigelcoatede membraner i forhold til antallet af celler, der var passeret gennem de ikke-coatede membraner (invasion index). Alle analyser blev udført i tre eksemplarer.

Resultater

miRNA sekventering og annotation

Små RNA blev isoleret fra metastatisk LTL-313H og ikke-metastatiske LTL-313b prostatacancer væv implanteret og forarbejdet til at tillade dybe sekventering under anvendelse af Illumina platform. Den læser med adapter indeks sekvenser “ACATCGA” og “CGTGATA” fik LTL-313H oprindelse og oprindelse LTL-313B, hhv. Mere end 10 millioner samlede læsninger blev opnået for hvert af bibliotekerne. Disse aflæsninger blev sammenlignet med sekvensen data i miRBase 15 microRNA Sequence Database. For metastatiske og ikke-metastaserende prostatacancer væv biblioteker, 3,445,642 og 2,272,677 tags henholdsvis var fuldt kortlagt til humant miRNA stem-loop-sekvenser til stede i miRBase databasen (tabel 1). Det helt matchede lyder blev kommenteret, i henhold til deres stilling i hårnåle-struktur. Et skift af op til 2 baser i start og slut positioner fik lov til sekvenser, der skal kommenteret som

isomerer

kendte modne miRNA (isomiRs). Det samlede antal kendte miRNA plus miRNA * s i den metastatiske og ikke-metastatiske biblioteker var 447 og 509 (tabel 1). Den mest udtrykte miRNA (og isomiR) var den miR-148a med samlede tællinger af 270.801 og 763.877 læser pr metastatiske og ikke-metastatiske biblioteker hhv. Når isomiRs blev grupperet under anvendelse af samme udgangsposition, det MIR-148a forblev den mest rigelige miRNA i den ikke-metastatisk bibliotek med en samlet optælling af 846.468, hvorimod MIR-21 i den metastatiske biblioteket var mest forekommende med en samlet optælling af 310.102 .

miRNA og miRNA * udtryk

i miRBase, miRNA stammer fra en forløber betegnes miRNA, overvejende udtrykt arm, og miRNA * de mindre udtrykt, modsatte arm. Hvis begge arme på samme måde udtrykkes, bliver de betegnet som 5p og 3P arme. Ekspressionen af ​​kendte miRNA i prostata cancer xenotransplantater var generelt højere end for miRNA * s. I en række tilfælde, miRNA * s (som identificeret ved miRBase) var mere udtryk end de tilsvarende miRNA (tabel 2). Således miR-144 * blev væsentligt mere udtrykt end miR-144 i både metastatiske og ikke-metastatiske biblioteker; tilsvarende miR-126 * blev mere udtrykt end miR-126, men kun i den ikke-metastatisk bibliotek. Forskelle blev også fundet i udtrykket mønstre af 3P og 5p arm miRNA (tabel 2). 3P arme miR-28 og miR-339 viste højere udtryk end de tilsvarende 5P våben i den metastatiske linje, mens de viste lavere udtryk end de tilsvarende 5P våben i den ikke-metastatisk linje. I den metastatiske linie, den MIR-542 viste opregulering af 3p arm, men nedregulering af 5p arm. Fragmenter, der var modstykker af kendte modne miRNA, men der havde ikke tidligere har været indberettet til miRBase databasen, blev betegnet “formodede roman miRNA *” arter (tabel 3). blev observeret i alt 32 af sådanne formodede miRNA * s viser mindst to læser i en af ​​de to biblioteker. Nogle af disse miRNA * s også viste højere udtryk end deres tilsvarende miRNA, fx, miR-1277 * og miR-1307 *.

Novel miRNA kandidater

En fordel udnytte en sekventering tilgang for miRNA profilering er mulighed for at identificere nye miRNA eller miRNA * s. Til dette formål har vi brugt en miRanalyzer, et microRNA detektion og analyse værktøjet [18], i kombination med homologisøgninger at identificere kendte udskrifter, herunder ikke-kodende RNA (fx rRNA, tRNA, etc.). Brug miPred software til at skelne ægte pre-miRNA fra andre hårnål sekvenser med lignende stamceller-loops [22], vi identificeret 36 nye miRNA kandidater. Deres sekvenser, kromosom steder og antallet af læser i metastatiske og ikke-metastatiske biblioteker er vist i tabel 4 og tabel S1. Sammenlignende analyse af de to biblioteker viste signifikant forskellen udtryk for nogle af disse nye miRNA, herunder nedreguleret miR-5680-3p og miR-5681a-3p.

Potentielle metastase-associerede miRNA

Sammenlignende analyse af de metastatiske og ikke-metastatisk xenograft miRNA biblioteker afslørede i alt 104 differentielt udtrykte miRNA eller miRNA * s med 55 nedreguleret og 49 opreguleret i metastatiske linie (tabel 5,6,7). Af de ned-regulerede miRNA, viste 24 miRNA a 5 gange fald, herunder fire miRNA, dvs. miR-205, miR-503, miR-708 og miR-2115 *, som var målbart i metastatisk linje. To miRNA, dvs. MIR-24-2 * og MIR-101 *, viste øget ekspression i en én-basis-shift formular. En en-basis-shift form af miR-203 viste nogle forøget ekspression i metastatiske linje i forhold til reference miR-203, mens der i den ikke-metastatiske linie viste en lavere udtryk. Af de up-regulerede miRNA, viste 23 miRNA a 5-gange ændring i normaliserede tæller. One-basis-shift former af miR-9 *, miR-148b * og miR-1246 udviste højere udtryk end reference- former i både metastatiske og ikke-metastatiske linier. Vejviser

Nogle af de differentielt udtrykte miRNA er tidligere blevet associeret med prostatacancer, prostatacancer metastaser eller metastase af andre typer cancer (tabel 5,6,7). De nedregulerede miRNA er blevet rapporteret at blive nedreguleret i prostatacancer forhold til benign prostata væv, dvs. MIR-16 [23] et tal – [25], MIR-24 [26] – [28], miR- 29a [26], miR-145 [23], [24], [27], [29], [30], og miR-205 [24], [31], [32]. Nedreguleringen af ​​MIR-16 [25], MIR-34a [33], MIR-126 * [34], MIR-145 [35], og MIR-205 [36] korreleret med udviklingen af ​​prostatakræft metastase. De opregulerede miRNA (i den metastatiske bibliotek), har MIR-210 blevet rapporteret at være opreguleret i prostatacarcinomer forhold til BPH prøver [23] og MIR-301 er blevet forbundet med prostatacancer metastaser [37]. I nogle tilfælde, at miRNA som blev fundet at være opreguleret i den foreliggende undersøgelse er blevet rapporteret at være enten opreguleret i prostatacarcinomer forhold til normalt prostatavæv [38] – [40], eller nedreguleres [23], [24], [27] – [29]. Desuden har nogle af de differentielt udtrykte miRNA blevet rapporteret at spille en rolle i metastasen af ​​andre typer cancer, for eksempel den opregulerede miRNA, lad-7i, MIR-9, MIR-30a, MIR-125b, miR -142-5p, miR-151-3p, miR-450a og ned-regulerede miRNA, miR-24, mir-145, miR-146b-5p, miR-185, miR-186, miR-203 og miR-335 .

formodede target gener for differentielt udtrykte miRNA

Som et første skridt i identifikationen af ​​miRNA med potentiel betydning i den metastatiske proces, vi identificeret formodede målgener for hver af de differentielt udtrykte miRNA hjælp mikrokosmos analyse, et mål forudsigelse program med en bestemt algoritme og dækning af miRNA, herunder sorter i stjerne arme; en tærskel

s

-værdi = 0,001 blev opretholdt for at få mere pålidelig target identifikation (Mikrokosmos) [41]. Formodede målgener blev identificeret for 49 ud af 55 ned-regulerede miRNA og 47 ud af 49 opreguleret miRNA (tabel S2); de blev kommenteret under anvendelse af DAVID programmet. De formodede målgener af nedregulerede miRNA var forbundet med en række Kegg pathways herunder “Fc gamma R-medieret fagocytose” og “ECM-receptor-interaktion (Tabel S3). For de formodede målgener af de up-regulerede miRNA blev veje som “veje i kræft”, “Focal vedhæftning” og “purin metabolisme” bemærkede.

Sammenligning af formodede miRNA target gener med gener udtrykkes forskelligt i metastatiske og ikke-metastatiske xenograft linjer

Selvom miRNA menes at ændre proteinniveauer, har de i nogle tilfælde vist sig at også påvirke mRNA-niveauer [3]. I lyset af dette, blev de to xenograft linjer undersøgt for differentiel mRNA-ekspression. Som vist i tabellen S4, blev 622 mRNA’er nedreguleres og 348 mRNA’er opreguleret i metastatiske linie. Nogle af de gener identificeret ved differentiel mRNA-ekspression blev potentielt mål for både op- og ned-regulerede miRNA. I lyset af dette, blev yderligere analyse begrænset til gener, der blev potentielt er mål for enten opreguleret eller nedreguleret miRNA. Den gruppe, der viste opreguleret mRNA forbundet med kun nedreguleret miRNA bestod af 85 mRNA; den gruppe, der viste nedreguleret mRNA’er associeret med kun opreguleret miRNA bestod af 58 mRNA’er. Blandt de mRNA’er opreguleret i den metastatiske linie, er nogle blevet rapporteret at have en rolle i væv invasion og /eller metastase af en række forskellige cancerceller, herunder mRNA udtrykt af

FSCN1

[42],

VEGFA

[43]

FGFR1

[44],

ADAMTS1

[45],

CCL2

[46] og

VIM

[47 ] gener. Tilsvarende mRNA nedreguleret i metastatisk linje, herunder mRNA udtrykt af

CTGF

[48] og

SERPINB5

[49] gener, har vist sig at være nedreguleret i forskellige metastatisk kræftformer, der attesterer pålideligheden af ​​vores analyser (tabel S5).

Øget modent miR-486 i transficerede celler

efter 24 timer efter transfektion af 22Rv1 celler med pcDNA6.2-GW /EmGFP-mir486 eller pcDNA6.2-GW /EmGFP-kontrol sekvens, blev mere end 90% af cellerne sig at være GFP positive. Den mir-486 forløber var blevet korrekt behandlet til den modne miR-486 blanket som angivet af qPCR. I forhold til kontrollen, ekspressionsniveauerne af både MIR-486-5p og -3p arme var 11,6 gange højere, hvilket indikerer, at størstedelen af ​​de celler udtrykte forhøjede MIR-486 niveauer.

invasivitet af MIR-486- transficerede 22Rv1 celler Salg

proliferationshastighed af mIR-486-transficerede og kontrolsekvens-transficerede celler var den samme som angivet ved MTT-assayet (fig. 1A). Men viste miR-486-transfekterede celler, en stigning på omkring 85% i væv invasiv forhold til kontrol celler (Fig. 1B). Selv om dette resultat har borderline signifikans (

s

= 0,08), betyder det, at øget ekspression af miR-486 forbedrer væv invasiv.

A) Som anført af MTT assay, var der ingen signifikant forskel mellem væksten af ​​mIR-486-transficerede celler og kontrolceller over en 72-timers periode. B) Væv invasivitet, som målt ved Matrigel invasion af MIR-486 transficerede celler og kontrolceller. Data udtrykkes som procent invasivitet ± S.D. og viser øget invasionsevne af miR-486-transfekterede celler (85%;

s

= 0,08)

Diskussion

MikroRNA’er har været impliceret i reguleringen af. genekspression ved post-transkriptionel niveau i næsten alle biologiske begivenhed, og der er en stigende mængde af beviser, at ændrede udtryk for specifikke miRNA er involveret i udviklingen og progressionen af ​​kræft [4], [5]. Brug af næste generation sekventering for små RNA identifikation, blev den foreliggende undersøgelse med henblik på at identificere differentielt udtrykt kendte og hidtil ukendte miRNA i metastatisk versus ikke-metastatisk prostatacancer-xenotransplantater, som kunne spille en rolle i progressionen af ​​prostatacancer til den metastatiske formular. De transplanterbare cancer linjer, der blev anvendt synes at være særdeles velegnet til formålet, da de var blevet afledt fra en patients kræft og dermed besad en fælles genetisk baggrund. Endvidere havde de blevet udviklet via subrenal kapsel podning af kræft

væv

i NOD /SCID-mus, en metode, der har tendens til at bevare vigtige egenskaber ved de oprindelige kræftformer (f.eks tumor heterogenitet, genetiske profiler) [9] – [11], [50]. Samt, vedligeholdelsen af ​​tumor linjer i den samme type transplantatsted (under nyre kapsel) sikret, at deres vækst ikke var markant påvirket af mikro-miljø forskelle, der kan have stor indflydelse på udviklingen af ​​kræft [51]. På samme måde ville den samme type transplantatsted minimere forskelle i miRNA produktion af vært celler til stede i xenotransplantaterne. Selv om det er påvist, at xenografting kan ændre ekspressionen af ​​miRNA [52], vores undersøgelse primært fokuseret på forskelle i miRNA mellem matchede prøver og disse forskelle vil derfor sandsynligvis være reel. Tilsammen bør de opnåede i denne undersøgelse data være nyttige til afgrænsning af miRNA med onkogene egenskaber, som er involveret i udviklingen af ​​prostatacancer metastaser.

Den højeste læser i de to RNA-biblioteker blev observeret for miR- 148a. Ekspressionen af ​​dette miRNA er androgen-inducerbar i LNCaP-celler [53]. Dette antyder, at den relativt høje ekspression af MIR-148a findes i de to biblioteker er et resultat af testosteron tilskud af dyrene.

Af de 104 miRNA der blev konstateret at være ned- eller opreguleres i metastatisk prostatacancer-xenotransplantater, i forhold til deres ikke-metastatiske modstykker, 39 var tidligere blevet rapporteret at være involveret i prostatacancer (tabel 5,6,7). Disse rapporter meste baseret på sammenligninger af miRNA udtryk i prostata cancer væv versus normale prostata væv uden at definere det metastatiske evne til maligne prøver. Det er af interesse, at 21 af de 39 miRNA viste ned- eller op-regler i de metastatiske xenografter der matchede dem rapporteret for prostatacancer væv (i forhold til godartede væv), hvilket tyder på, at disse prostatakræft væv kan have haft metastatisk evne. Af de miRNA sig at være nedreguleret i metastatisk xenotransplantater, miR-16, viser en 17-fold fald i udtryk, er blevet rapporteret til at blive nedreguleret i prostatacancer [23], [24] og for at have en metastase-undertrykkende funktion. Desuden metastatisk prostata tumorvækst

in vivo

kunne inhiberes af systemisk levering af syntetisk miRNA-16 [25]. Den reducerede ekspression af MIR-34a i den metastatiske xenograft linje er i overensstemmelse med dens rapporterede inhibering af prostatacancer metastaser [33]. Den lavere ekspression af miR-126 * er i overensstemmelse med rapporter om, at denne miRNA nedreguleres i prostatacancer metastaser [34], og at ektopisk udtryk for miR-126 * hæmmede migration og invasiv af prostata kræftceller [34]. Den sidstnævnte er et eksempel på et miRNA * spiller en rolle som en tumor suppressor. Interessant, miR-126, en miRNA rapporteret som nedreguleret i prostatakræft i forhold til normal prostata væv [54], var opreguleret i metastatisk xenograft linje.