PLoS ONE: Den Kolesterol Metabolit 25-hydroxycholesterol Aktiverer østrogen-receptor α-medieret signalering i cancerceller og i Cardiomyocytes

Abstrakt

Baggrund

De hydroxylerede derivater af kolesterol, såsom oxysterols, spille vigtige roller i lipidmetabolisme. Især har 25-hydroxycholesterol (25HC) været impliceret i en række forskellige metaboliske begivenheder, herunder cholesterol homeostase og atherosklerose. 25HC kan påvises i humant plasma efter indtagelse af et måltid rigt på oxysterols og efter en kolesterol udfordring. Desuden er der fundet niveauet af oxysterols, herunder 25HC at være forhøjet i hypercholesterolæmisk serum.

Metodologi /vigtigste resultater

Her viser vi, at østrogen receptor (ER) a medierer genekspression ændringer og vækst responser induceret af 25HC i bryst- og ovariecancerceller. Desuden 25HC udviser den ERa-afhængige evne som 17β-østradiol (E2) til at inhibere opregulering af HIF-1α og bindevæv vækstfaktor ved hypoxiske betingelser i cardiomyocytter og rotte hjerte præparater og forhindre hypoxi-induceret apoptose.

konklusioner /betydning

østrogen handling udøvet af 25HC kan betragtes som en yderligere faktor involveret i udviklingen af ​​bryst- og æggestokkræft. Endvidere kan østrogen-lignende aktivitet af 25HC fremkaldt i det kardiovaskulære system spiller en rolle mod hypoxiske miljøer

Henvisning:. Lappano R, Recchia AG, De Francesco EM, Angelone T, Cerra MC, Picard D, et al. (2011) Den Kolesterol Metabolit 25-hydroxycholesterol Aktiverer østrogenreceptorpositiv α-medieret signalering i cancerceller og i cardiomyocytter. PLoS ONE 6 (1): e16631. doi: 10,1371 /journal.pone.0016631

Redaktør: Vincent Laudet, École Normale Supérieure de Lyon, Frankrig

Modtaget: September 7, 2010; Accepteret: December 27, 2010; Udgivet: 31 Jan 2011

Copyright: © 2011 Lappano et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, projekt n 8925/2009.) (https://www.airc.it/) og Ministero dell’Università e Ricerca Scientifica e Tecnologica (MIUR) (http: //www.istruzione.it/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

østrogenreceptoren (ER) α og β tilhører den nukleare receptor superfamilien af ​​ligand-inducerbare transkriptionsfaktorer [1]. Bindingen af ​​17β-østradiol (E2) til ER’er inducerer receptor homodimerisering og interaktion med specifikke østrogen-responsive elementer (Eres) placeret inden for de regulatoriske regioner af målgener [2]. To separate aktiveringsdomæner medierer ER-afhængig transkriptionel aktivitet: den aktiveringsfunktion (AF) -1 placeret i aminoterminalen og hormon-afhængige AF-2 placeret i ligandbindingsdomænet (LBD) [3]. Bindingen af ​​ligander til ER inducerer dannelsen af ​​en AF-2 hydrofob lomme, som regulerer ansættelse af cofaktorer og vigtigere receptorfarmakologien [4] – [5]

Tidligere resultater opnået i både cellekultur og dyremodeller. har oplyst, at ERa spiller en afgørende rolle ved mediering af virkningerne af østrogen i mælkekirtler udvikling og brystkræft progression [6] – [7]. Desuden har østrogen vist sig at forebygge vaskulær dysfunktion og skade i en ER-afhængig måde [8] – [10], for at reducere cardiomyocythypertrofi [11] og for at formindske infarktstørrelse og myocyt apoptose i dyremodeller med koronar okklusion [12] . Forskellige mekanismer er involveret i den beskyttende virkning, der udøves af E2 i cardiomyocytter. Oxidativ stress og den efterfølgende generation af reaktive oxygenarter (ROS) menes at udløse cardiomyocyte apoptosis [13], mens evnen hos E2-aktiveret ER at modvirke disse redox mellemprodukter er meget sandsynligt en nøglefaktor i den samlede kardiobeskyttelse. Cellen respons på sænket oxygenmiljø implicerer hypoxi-inducerbare-faktor-1 (HIF-1), som regulerer ekspressionen af ​​gener såsom matricellular protein navngivne Connective Tissue Growth Factor (CTGF), der tilhører CCN familie af vækstregulatorer (

Cyr61

, CTGF og

november

) [14]. Niveauerne af CTGF er opreguleret under sår reparation [15], inflammation [16], fibrøse lidelser [17], tumorvækst [18] – [19] og angiogenese [18], [20]. Akkumulerende beviser har også foreslået, at CTGF udøver en afgørende rolle i hjerte-fibrotiske processer, hvilket indikerer det som en mulig biomarkør og en potentiel kandidat til terapeutisk intervention [21].

Oxysterols hydroxyleres derivater af kolesterol, der spiller vigtige funktioner i lipidmetabolismen [22]. 25-hydroxycholesterol (25HC), som er syntetiseret ud fra cholesterol ved en særlig hydroxylase [23], virker som en potent inhibitor af cholesterolbiosyntese i forskellige celletyper [24]. 25HC blev påvist i rotteplasma efter indtagelse af et måltid rigt på oxysterols og efter en kolesterol udfordring [25]. Ligeledes niveauerne af oxysterols, herunder 25HC, var højere i hypercholesterolæmisk serum sammenlignet med dem, der findes i normocholesterolemiske serum [26]. Dernæst mus mangelfuld i oxysterol-catabolizing enzym oxysterol 7α-hydroxylase (Cyp7b) viste forhøjede koncentrationer af både 25HC og 27HC, hvilket tyder på en regulerende rolle fremkaldt af Cyp7b på disse hydroxylerede kolesterol derivater [27].

I foreliggende undersøgelse viser vi, at 25HC fremkalder østrogene effekter aktiverende ERa-medieret signalering enten i bryst- og ovariecancer celler eller i cardiomyocytter. De opnåede resultater blev bekræftet, i det mindste delvis, i isolerede og perfunderede rottehjerter.

Materialer og metoder

Reagenser

17β-estradiol (E2), 25-hydroxycholesterol (25HC), cobaltchlorid (CoCl

2), PD98059 (PD), SB202190 (SB) og actinomycin D blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italien. Eksperimenterne udført ved anvendelse 25HC fra Sigma-Aldrich, Inc., Milano (Italien) blev bekræftet med 25HC indkøbt fra Research Plus, Inc., Barnegat, NJ. ICI 182.780 (ICI) blev opnået fra Tocris Chemicals. Alle forbindelser blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO), undtagen E2 og PD, som blev opløst i ethanol.

Cell Culture

Brystkræft MCF7 og humane embryonale nyre HEK293-celler blev holdt i DMEM med phenolrødt suppleret med 10% FBS. Breast SKBR3 og æggestokkene BG-1 cancerceller blev opretholdt i RPMI1640 og DMEM henholdsvis uden phenolrødt suppleret med 10% FBS. Den murine cardiomyocyte-lignende cellelinie HL-1 blev venligt stillet til rådighed af Dr. William C. Claycomb (Louisiana State University Medical Center, New Orleans, LA). HL-1-celler blev dyrket i overensstemmelse med den publicerede protokol [28] i Claycomb medium (JRH Biosciences, Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italien) suppleret med 10% FBS (JRH Bioscience, Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italien), 100 pg /ml penicillin /streptomycin, 0,1 mM noradrenalin (Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italien) og 2 mM

l

-glutamine (Invitrogen, Milano, Italien). Alle cellelinier blev dyrket i en 37 ° C inkubator med 5% CO

2. For hypoxisk stimulation HL-1 celler blev behandlet med CoCl

2 eller dyrket i tilstedeværelse af lav ilt spænding (2% O

2) i en HeraCell inkubator (ThermoScientific-Heraeus, Milano, Italien). Alle cellelinjer, der skal behandles for immunoblot og RT-PCR-analyser blev skiftet til medium uden serum og phenolrødt 24 timer før behandlinger.

transfektioner luciferaseassays og gen silencing eksperimenter

plasmider og Luciferase assays blev tidligere beskrevet [29] – [32]. Især vi brugte ekspressionsvektorer koder for fuld længde ERa og ERp formular, der koder for 485 aa protein [29] – [32]. Celler blev udpladet i 10 cm skåle, holdes i serumfrit medium i 24 timer og derefter transficeres i yderligere 24 timer før behandlinger ved hjælp Fugene6 (Roche Molecular Biochemicals, Milano, Italien) og passende kontrolforanstaltninger vektorer. De SureSilencing ™ shRNA plasmider til muse HIF-1α og respektive negative kontrolprøver plasmider (shRNA) blev indkøbt fra Superarray Bioscience Corporation (Frederick, MD, USA) og blev anvendt ifølge producentens anbefalinger (kat. KM03799P). Kort beskrevet blev celler udpladet i 10 cm skåle, og derefter transficeres i serum-frit medium i 24 timer før behandlinger med en blanding indeholdende 15 pi /plade Fugene6 Reagens og 5 ug /plade kontrol shRNA eller shRNA HIF-1α (shHIF-1α) plasmid. For HIF-1α lyddæmpning, producenten giver 4 separate kort hårnål RNA (shRNA) pre-designede sekvenser for det samme gen, pakket i 4 separate plasmid skeletter (nummereret som 1-4). I vores eksperimenter, en enkelt uafhængig shRNA plasmid sekvens (n.3) var tilstrækkeligt til at lukke munden på HIF-1α genekspression. Styringen shRNA er en kodet kunstig sekvens, som ikke svarer til nogen menneskelig, mus eller rotte gen.

ERa bindende analyser

evne 25HC at konkurrere med [3H] E2 om binding til ERa blev evalueret enten i MCF7-celler eller ved hjælp HEK293 cellelysater i nærvær eller fravær af to picomol oprenset rekombinant humant ERa-protein købt hos PanVera, Invitrogen Srl Milano, Italien. MCF7-celler blev strippet for enhver østrogen ved at holde dem i medium uden serum i 2 dage, derefter celler blev inkuberet med 1 nM [2,4,6,7-3H] E2 (89 Ci /mmol; GE Healthcare, Milano, Italien) og stigende koncentrationer af ikke-mærket E2 eller 25HC i 2 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft /5% CO2. Efter fjernelse af mediet blev cellerne vasket med iskold PBS /0,1% methylcellulose to gange, høstet ved skrabning og centrifugering, og lyseret med 100% ethanol, 500 pi pr 60 mm skål, i 10 minutter ved stuetemperatur [33]. Radioaktiviteten af ​​ekstrakter blev målt ved væskescintillationstælling. Bindingsassayet blev også udført under anvendelse af HEK293 hele cellelysater. Celler blev strippet for enhver østrogen ved at holde dem i medium uden serum i 2 dage, og derefter lyseret i 500 pi RIPA buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7,5; 100 mM NaCI; 0,5% Nonidet P-40; 0,5 mM EDTA) i nærvær af en blanding af proteaseinhibitorer indeholdende 1,7 mg /ml aprotinin, 1 mg /ml leupeptin, 200 mmol /liter phenylmethylsulfonylfluorid, 200 mmol /liter sodiumorthovanadate og 100 mmol /liter natriumfluorid. Proteinkoncentration blev bestemt under anvendelse Bradford reagens ifølge producentens anbefalinger (Sigma-Aldrich, Inc., Milano, Italien). Lige mængder hel proteinekstrakt blev inkuberet i fravær eller nærvær af to picomol rekombinant ERa og inkuberet med 1 nM [3H] E2 og stigende koncentrationer af umærket E2 eller 25HC i 2 timer ved 4 ° C. Bundet og fri radioligander blev separeret på Sephadex G-25 PD-10 kolonner. Mængden af ​​receptor-bundet [3H] E2 blev bestemt ved væskescintillationstælling.

chromatin immunoprecipitation (chip) og Re-chip assays

MCF7-celler blev dyrket i 10 cm skåle til 70 -80% konfluens, flyttet til serumfrit medium i 24 timer og derefter behandlet med vehikel, 10 nM E2 eller 1 pM 25HC i 1 time. Derefter celler blev tværbundet med 1% formaldehyd og sonikeret. Supernatanter blev immunocleared med sonikeret laks DNA /protein A agarose (Upstate Biotechnology, Inc., Lake Placid, NY) og immunpræcipiteret med anti-ERa antistof eller ikke-specifik IgG (Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milano, Italien). Pellets blev vasket, elueret med en buffer bestående af 1% SDS og 0,1 mol /l NaHCO3, og fordøjet med proteinase K. DNA blev opnået ved phenol /chloroform-ekstraktion og udfældes med ethanol. En 4 pi volumen af ​​hver prøve blev anvendt som template til amplifikation en ERE-holdige region, som ligger i pS2 promotoren ved real-time PCR (Applied Biosystems, Milano, Italien). De anvendte primere var 5′-GGCCATCTCTCACTATGAATCACTTCTGC-3 ‘(PS2 fremad) og 5′-GGCAGGCTCTGTTTGCTTAAAGAGCG-3’ (PS2 revers). Data blev normaliseret til indgangen for immunfældning. I Re-CHIP eksperimenter blev komplekser elueret ved inkubation i 30 minutter i Re-IP-buffer (0,5 mM dithiothreitol, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-CI pH 8,1, 150 mM NaCl) og underkastet chippen procedure, ved anvendelse af anti-SRC-1, SRC-3 og CBP antistoffer (alle købt fra Santa Cruz Biotechnology, DBA, Milano, Italien).

revers transkription og real-time PCR

Genekspression blev bedømt ved real-time PCR som vi tidligere beskrevet [32]. Til PS2, PR, Cathepsin D, cyklin A, cyklin D1, HIF-1α, CTGF, FAS, SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1 og ribosomale protein 18S, der blev anvendt som en kontrol-gen til opnåelse af normaliserede værdier, var primerne: 5 ‘-GCCCCCCGTGAAAGAC-3′ (pS2 fremad) og 5’-CGTCGAAACAGCAGCCCTTA-3 ‘(pS2 revers); 5’-GAGTTGTGAGAGCACTGGATGCT-3 ‘(PR fremad) og 5′-CAACTGTATGTCTTGACCTGGTGAA-3′ (PR omvendt); 5’-CTGGATCCACCACAAGTACAACA-3 ‘(Cathepsin D fremad) og 5′-CGAGCCATAGTGGATGTCAAAC-3′ (Cathepsin D omvendt); 5’-TGCACCCCTTAAGGATCTTCCT-3 ‘(cyclin A fremad) og 5′-GTGAACGCAGGCTGTTTACTGT-3′ (cyclin A omvendt); 5’-GTCTGTGCATTTCTGGTTGCA-3 ‘(cyclin D1 fremad) og 5′-GCTGGAAACATGCCGGTTA-3′ (cyclin D1 omvendt); 5’-TGCATCTCCATCTTCTACCCAAGT-3 ‘(HIF-1a fremad) og 5′-CCGACTGTGAGTGCCACTGT-3′ (HIF-1α revers); 5’-CATTAAGAAGGGCAAAAAGTGCAT-3 ‘(CTGF fremad) og 5′-TGCAGCCAGAAAGCTCAAACT-3′ (CTGF revers); 5’-CGCTCGGCATGGCTATCT-3 ‘(FAS fremad) og 5′-CTCGTTGAAGAACGCATCCA-3′ (FAS revers); 5’-CCCGGATCGTCTTTGAGAAG-3 ‘(SERPINF1 fremad) og 5′-TCCAGAGGTGCCACAAAGCT-3′ (SERPINF1 omvendt); 5’-CCGTGCCAGCCTATTTCAAT -3 «(HSPA1L fremad) og 5’AGCAATCACACCTGCATCCTT-3 ‘(HSPA1L omvendt); 5’-GCAGCGCCATGAGATTGTG-3 ‘(SELENBP1 fremad) og 5′-CGGATCTCCAAGGGAATAAGC-3′ (SELENBP1 omvendt), og 5’-GGCGTCCCCCAACTTCTTA-3 ‘(18S fremad) og 5′-GGGCATCACAGACCTGTTATT-3’ (18S omvendt), henholdsvis .

immunblotting

Cellelysater og immunoblotting blev udført som tidligere beskrevet [32]. Antistofferne mod ERa (F-10), cyclin D1 (M-20), CTGF (L-20), phosphoryleret ERK1 /2 (E-4) og ERK2 (C-14), β-actin (C-2) og β-tubulin (H-235-2) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (DBA, Milano, Italien). ERp og HIF-1α blev indkøbt fra R at opnå positiv kontrol blev slides behandlet med 1 pg DNAse I /ml i 10 minutter ved stuetemperatur, før udsættelse for fluorescein dUTP og TdT.

Isolerede og perfunderet hjerte præparater

Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af Udvalget om brug af dyr i Farmakoterapeutisk Biologi Institut ved universitetet i Calabrien (godkendelse ID 110 /2000A). De procedurer i undersøgelsen var i overensstemmelse med Fællesskabets standarder for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og med

Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr

udgivet af det amerikanske National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, revideret 1996). Voksne hanrotter (Wistar, 220-280g, Harlan, Udine, Italien) blev bedøvet ved i.p. injektion af ethylcarbamat (2 g /kg legemsvægt). Hjerter blev derpå dissekeret ud og forbundet til et Langendorff apparat til perfusion med en Krebs-Henseleit-opløsning (KHS) bestående af (i mM) NaCI 113, KCI 4,7, NaHCO3 25, MgSO4 1,2, CaCI2 1,8, KH2PO4 1,2, glucose 11, mannitol 1.1, Na-pyruvat 5 og gasset med 95% O

2-5% CO

2 (pH 7,4, 37 ° C). KHS blev leveret ved en konstant flow-hastighed på 12 ml /min. For at måle hjerteaktivitet, en vandfyldt latexballon, forbundet til en BLPR gauge (WRI, Inc. USA), blev indsat gennem mitralklappen ind i venstre hjertekammer for at tillade iso-volumetrisk sammentrækninger og til løbende registrering mekaniske parametre. Ballonen blev gradvist fyldt med vand til opnåelse af en initial venstre ventrikel, diastolisk tryk på 5 til 8 mmHg [35]. Alle hjerter blev perfuseret for en 15 min ækvilibreringsperiode. Efter ligevægt periode, hjerter (n = 3) blev randomiseret til én af følgende grupper: Gruppe 1 (kontrol): KH gasset med 95% O

2-5% CO

2; Gruppe 2: KH gasset med 95% O

2-5% CO

2 plus 1 nM E2; Gruppe 3: KH gasset med 95% O

2-5% CO

2 plus 100 nM 25HC; Gruppe 4: KH gasset med 50% O

2-45% N

2-5% CO

2; Gruppe 5: KH gasset med 50% O

2-45% N

2-5% CO

2 plus 1 nM E2; Gruppe 6: KH gasset med 50% O

2-45% N

2-5% CO

2 plus 100 nM 25HC

Alle hjerter perfunderet i 60 minutter for at undersøge effekten. af hver forbindelse og af de forskellige oxygenniveauer om ændringer af CTGF og HIF-1α-mRNA-ekspression. Opløsning indeholdende behandlinger var frisk forberedt før eksperimenter. Tryk i venstre ventrikel, hjertefrekvens og koronar flow blev overvåget gennem hele perfusionsprotokollen. Ved slutningen af ​​perfusioner blev ventrikler udskåret og straks bearbejdet til RNA-ekstraktion.

Statistical Analysis

Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af ANOVA efterfulgt af Newman-Keuls ‘test for at bestemme forskelle i middel. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

25HC aktiverer ERa i kræftceller

Vi begyndte at vurdere, om 25HC er i stand til at transaktivere en forbigående transficeret ER reporter gen i. brystkræftceller (MCF7), som udtrykker ERa og ikke ERp som vurderet ved RT-PCR (data ikke vist). Interessant 25HC aktiveret ERa på en dosis-afhængig måde, dog med en lavere effektivitet sammenlignet med E2 (fig. 1A). Vi næste vurderet, om 25HC kunne antagonisere transkriptionel aktivering induceret af E2. MCF7-celler blev derefter behandlet samtidigt med stigende koncentrationer af både 25HC og E2, men de transskriptionelle responser svarede til dem, der opnås anvendt E2 alene (fig. 1A). Tværtimod blev luciferaseaktiviteten induceret af 10 nM E2 eller 1 uM 25HC ophævet under anvendelse af stigende doser af ER-antagonist ICI (fig. 1B), hvilket antyder, at ERa medierer transkriptionel aktivering ved udsættelse for hver forbindelse. At give yderligere data vedrørende evne 25HC til at aktivere ERa og at vurdere, om ERp også kunne reagere på 25HC, vi forbigående transficeret ER-negative HEK293 celler med ER reporter genet sammen med ekspressionsvektoren kodning ERa eller ERp. Af note, kun ERa udtryk tilladt 1 uM 25HC at inducere luciferaseaktiviteten, der blev afskaffet ved 10 pM ICI (fig. 1C-D). At give yderligere beviser vedrørende evne 25HC at aktivere ERa men ikke ERp, vi henvendte os til et helt heterolog system. I HEK293-celler, 1 pM 25HC aktiveret et kimært protein bestående af DNA-bindingsdomænet (DBD) i gærtranskriptionsfaktor Gal4 og LBD’et af ERa men ikke ERp (fig. 1 E-F). Igen blev transaktivering af ERa afskaffet ved 10 pM ICI (fig. 1E-F). For at underbygge de førnævnte resultater, vi efterprøves, om 25HC kunne inducere ekspressionen af ​​de ERp målgener SERPINF1, HSPA1L, SELENBP1, der blev rapporteret til at reagere på E2 behandling [36]. Brug af HEK293-celler transient transficeret med et ERp ekspressionsplasmid, blev transkriptionen af ​​disse gener stimuleret af E2, men ikke af 25HC (fig. S1). Taget sammen viser disse resultater, at 25HC aktiverer ERa på en selektiv måde og viser, at ERa-LBD er tilstrækkelig til transkriptionel respons.

(A) MCF7-celler blev transficeret med en ER luciferasereportergenet sammen med det indre transfektion kontrol Renilla Luciferase og behandles med stigende koncentrationer (logaritmisk skala) af E2 og 25HC. Desuden blev cellerne behandlet samtidigt med lignende doser af hver forbindelse. De normaliserede Luciferaseaktivitet værdier af celler behandlet med vehikel (-) blev fastsat som 1-gange induktion, hvorpå aktiviteten induceret af behandlinger blev beregnet. (B) MCF7-celler transficeret med ER-reportergenet blev behandlet med 10 nM E2 eller 1 uM 25HC alene og i kombination med stigende koncentration af ER-antagonist ICI, som angivet. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre eksperimenter udført i triplikat. (C-F) HEK293-celler blev transficeret med ER luciferasereportergen (EREluc) og ERa (C) eller ERp (D) ekspressionsplasmider, med Gal4 reportergenet GK1 og GAL4-fusionsproteiner koder for ligandbindingsdomænet (LBD) i ERa (GalERα) (E) eller ERp (GalERβ) (F) og behandlet med 10 nM E2 eller 1 uM 25HC alene og i kombination med 10 pM ER-antagonist ICI, som angivet. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre eksperimenter udført tredobbelt.

På grundlag af resultaterne opnået i transfektionsforsøg, spurgte vi, om 25HC kunne opføre sig som en ligand og konkurrere med E2 for binding til ERa. I en hel celle bindingsassay med MCF7-celler 25HC forskydes det radioaktivt mærkede E2 på en dosis-afhængig måde (Fig. 2A). Tilsvarende, når rekombinant ERa blev tilsat til en HEK293 cellelysat, der i sig selv ikke binder E2, 25HC konkurrerede effektivt mod sporstoffet E2 (fig. 2B-C). Resultaterne af disse bindingsassays er kompatible med den idé, at 25HC binder ERa direkte, men vil være nødvendigt yderligere forsøg for at etablere virkemåde entydigt.

Graferne viser resterende binding af det radioaktive sporstof i overværelse af stigende koncentrationer af umærket E2 og 25HC i MCF7-celler (A), i HEK293 cellelysater i nærvær (B) eller fravær af rekombinant ERa protein (C). Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tredobbelte prøver af tre separate forsøg. Bemærk, at mængden af ​​sporstof bundet i fravær af konkurrenten arbitrært var sat til 100%, og at de underliggende absolutte værdier varierer mellem de tre paneler.

25HC inducerer rekruttering af ERa til PS2-promotorsekvensen i MCF7 celler

på baggrund af de nævnte resultater, vi vurderet om 25HC kunne fremkalde rekruttering af ERa til målrettet ERE-holdige DNA-region inden PS2 promoter sekvensen. Udførelse af en kromatin immunofældning (chip) assay i MCF7-celler, 1h behandling med 1 uM 25HC inducerede rekruttering af ERa til PS2 promotor som observeret ved hjælp 10 nM E2 (fig. 3A). Desuden at kontrollere, om 25HC kan rekruttere co-aktivatorer til PS2 promotoren, udførte vi Re-ChIP assay under anvendelse af antistoffer mod SRC-1 og SRC-3, der tilhører steroid receptor co-aktivator (SRC) familier og imod CBP ( CREB-bindende protein) [37]. Alle co-aktivatorer blev effektivt rekrutteret til PS2 promotor udsætte MCF7-celler til 10 nM E2, men 1 pM 25HC viste en lille effekt (fig. 3A). Derfor E2 og 25HC vise et andet evne i rekruttering co-aktivatorer, der bidrager til agonistisk styrken af ​​ligander.

(A) E2 og 25HC inducere rekruttering af ERa til ERE stedet ligger i PS2 promotor sekvens i MCF7-celler. Celler blev behandlet i 1 time med bærer, E2 (10 nM) eller 25HC (1 uM) og sendes til kromatin immunoprecipitation procedure ved anvendelse af anti-ERa eller uspecifikke anti-IgG-antistoffer. For Re-chip assays, anti-SRC-1, SRC-3 og CBP antistoffer blev brugt. De amplificerede sekvenser blev evalueret ved realtids-PCR. (B-C) evaluering af mRNA ekspression af PS2, progesteronreceptor (PR), Cathepsin D, cyklin A og cyclin D1 ved real-time PCR i MCF7 og BG-1-celler. Cellerne blev behandlet i 24 timer med 10 nM E2 og 1 uM 25HC. Resultater opnået fra forsøg udført tredobbelt blev normaliseret til 18S ekspression og vist som gange ændring af RNA-ekspression sammenlignet med celler behandlet med bærer. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien ± SD af tre eksperimenter udført i triplikat. (•), (°), (▪), (□) (♦) angiver

p

. 0,05 for celler, der modtager køretøj (-) versus behandlinger

25HC regulerer ekspressionen af ​​ERa- målgener i MCF7 og BG-1 celler

Vi næste evalueret potentiale 25HC at regulere ekspressionen af ​​velkendte ERa- målgener, såsom PS2, PR, Cathepsin D, cyklin A og cyclin D1 i MCF7 bryst og BG-1 ovariecancerceller. Som bestemt ved real-time RT-PCR, en 24 h udsættelse for 1 uM 25HC opreguleret mRNA ekspression af alle generne undersøgt, svarende til behandling med 10 nM E2 (fig. 3B-C). For yderligere at underbygge disse resultater, undersøgte vi evnen hos 25HC at modulere ekspressionen af ​​ERa- og cyclin D1 proteinniveauer i MCF7 og BG-1 tumorceller. Til dato har nedregulering af ERa af østrogen været betragtet som et kendetegn for receptoraktivering [38], mens den opregulering af cyclin D1 af E2 er blevet grundigt beskrevet [39]. Især en 24 h udsættelse for 1 uM 25HC nedreguleret ERa- proteinniveauer (fig. 4A-B). Tværtimod, en 24 h behandling med 1 uM 25HC opreguleret cyclin D1-proteinekspression, som blev ophævet af 10 pM ICI (fig. 4C-D). Alt i alt tyder disse resultater på, at 25HC er i stand til at regulere ekspressionen af ​​ERa- målgener som E2.

immunoblotter af ERa (A, B) og cyclin D1 (C, D) fra MCF7 og BG-1-celler. Cellerne blev behandlet i 24 timer med vehikel (-), 10 nM E2 eller 1 uM 25HC og i nærvær af 10 uM ER-antagonist ICI, som angivet. β-actin tjener som ladningskontrol. 25HC inducerer proliferative virkninger i MCF7 og BG-1-celler (E-H). Cellerne blev behandlet i 5 dage med stigende koncentrationer (logaritmisk skala) for E2 og 25HC og talt på dag 6 (E, G). Celler blev behandlet med 10 nM E2 eller 1 uM 25HC og i kombination med 10 pM ER-antagonist ICI og talt på dag 6 (F, H). Proliferation af celler, der modtager bærer blev sat som 100% på hvilken cellevækst induceret af behandlinger blev beregnet. Hvert datapunkt er gennemsnittet ± SD af tre uafhængige forsøg. (•), (°) angiver

s

. 0,05 for celler, der modtager køretøj (-) versus behandlinger

25HC inducerer proliferative effekter i MCF7 og BG-1 celler

Derefter forsøgte vi at evaluere den biologiske modstykke af de ovennævnte virkninger udøvet af 25HC. Vækst assays udført i MCF7 og BG-1 cancerceller viste, at 25HC kan fremkalde proliferative virkninger på en dosisafhængig måde (fig. 4E og 4G). Derefter blev væksten reaktioner på 10 nM E2 og 1 uM 25HC ophævet ved 10 pM ICI (fig. 4F og 4H), hvilket antyder, at ERa medierer celleproliferation induceret ved udsættelse for begge forbindelser.

25HC efterligner virkningerne af E2 mod hypoxi-induceret apoptose i cardiomyocytter

for yderligere at evaluere de østrogene egenskaber 25HC, vi henvendte os til en helt anden model-system ligesom HL-1 cardiomyocytter [28], som udtrykker ERa og meget lave ERp niveauer, som bedømt af RT-PCR (data ikke vist). Det er blevet rapporteret, at E2 beskytter celler fra hypoksisk insult i forskellige celle sammenhænge [40] – [42]. Derfor vurderede vi, om E2 og 25HC kunne beskytte HL-1 cardiomyocytter fra apoptose induceret af den velkendte hypoxi-mimetisk middel CoCl

2 [43] – [44]. Bestemmelse DNA nedbrydning ved TUNEL-assay, ca. 70% af HL-1-celler resulterede positive for TUNEL-farvning efter udsættelse for CoCl

2 (fig. 5 og fig. S2). Af note, blev procentdelen af ​​apoptotiske celler signifikant reduceret i nærvær af enten 10 nM E2 eller 1 uM 25HC (fig. 5 og fig. S2). De beskyttende virkninger udøves af begge forbindelser blev ophævet ved hjælp 10 pM ICI, som alene ikke inducere apoptose (fig. 5 og fig. S2). Tilsammen de viste resultater indikerer, at E2 og 25HC kan beskytte cardiomyocytter fra hypoxi-induceret apoptose i en ER-afhængig måde.

blev påvist Apoptotiske ændringer ved hjælp af TUNEL (med grønt) og kerner blev farvet ved propidiumiodid ( PI, med rødt), som angivet. Repræsentative fotografier efter 18 h behandling med vehikel og 100 uM CoCI2, 10 nM E2, 1 pM 25HC alene, eller en kombination af 100 uM CoCl2 med 10 nM E2 i nærvær eller fravær af 10 uM ICI, 100 pM CoCl2 med 1 uM 25HC i nærvær eller fravær af 10 uM ICI.

E2 og 25HC forhindre hypoxi-induceret ekspression af HIF-1α og CTGF i cardiomyocytter Salg

det er tidligere blevet rapporteret, at HIF-1α medierer CTGF ekspression stimuleres af hypoxi i forskellige celle sammenhænge [ ,,,0],45] – [47]. Mens den potentielle regulering af HIF-1α af E2 er blevet foreslået i visse modeller [48] – [49], østrogen evne til at påvirke hypoxi-induceret CTGF ekspression i det kardiovaskulære system mangler at blive undersøgt. På grundlag af disse observationer, vi konstateret, at HIF-1α og CTGF er opreguleret på både mRNA og protein niveauer i en tidsafhængig måde ved 100 pM CoC

2 i HL-1-celler (fig. 6A, C) . Lignende responser blev observeret inkubering HL-1-celler i nærvær af lav oxygenspænding (2% O

2) (fig. 6B, D). Dernæst blev hypoxi-induceret ekspression af HIF-1α og CTGF afskaffes ved hjælp inhibitoren af ​​DNA-primet RNA-syntese actinomycin D (fig. S3), hvilket antyder, at transkriptionelle mekanismer er ansvarlige for opreguleringen af ​​både HIF-1α og CTGF . Så, vi fastslået, at lyddæmpning af HIF-1α ophæver CTGF induktion observeret enten ved udsættelse for CoCl

2 eller hypoxiske betingelser (2% O

2) (fig. 6E-F), hvilket indikerer, at HIF-1α medierer opreguleringen af ​​CTGF af hypoxi i HL-1-celler. Derefter vi spurgte, om E2 og 25HC kunne påvirke HIF-1α og CTGF udtryk. Interessant fandt vi, at enten 10 nM E2 eller 1 uM 25HC forhindre opregulering af HIF-1α og CTGF enten ved CoCl

2 eller lav spænding oxygen (2% O

2) ved både mRNA (Fig. S4) og proteinniveauer (fig. 7A-B).