PLoS ONE: Den Expression og prognostiske betydning af retinsyre enzymer i kolorektal Cancer

Abstrakt

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige typer af kræft med over halvtreds procent af patienter på et fremskredent stadium. Retinsyre er en metabolit af vitamin A og er afgørende for normal cellevækst og afvigende retinsyremetabolismeblokerende er impliceret i tumorigenese. Denne undersøgelse har profileret ekspressionen af ​​retinsyre enzymer ved anvendelse af en velkarakteriseret kolorektal cancervæv microarray indeholdende 650 primære colorektale cancere, 285 lymfeknudemetastase og 50 normale colon mucosale prøver. Immunhistokemi blev udført på vævet mikroarray anvendelse af monoklonale antistoffer, som vi har udviklet til retinsyre metaboliserende enzymer CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og lecithin retinol acyl transferase (LRAT) under anvendelse af en semikvantitativ scoring til evaluering ekspression. Moderat eller stærk ekspression af CYP26A1was observeret hos 32,5% af cancere sammenlignet med 10% af normale tyktarmsepitelet prøver (p 0,001). CYP26B1 var moderat eller stærkt udtrykt i 25,2% af tumorer og var signifikant mindre udtrykt i normal tyktarmsepitelet (p 0,001). CYP26C1 blev ikke udtrykt i nogen prøve. LRAT viste også signifikant forøget ekspression i primære tarmkræft sammenlignet med normal colon epitel (p 0,001). Stærk CYP26B1 udtryk var signifikant associeret med dårlig prognose (HR = 1,239, 95% CI = 1,104-1,390, χ

2 = 15,063, p = 0,002). Stærk LRAT var også forbundet med dårligere resultat (HR = 1,321, 95% CI = 1,034-1,688, χ

2 = 5,039, p = 0,025). I mismatch reparation dygtige tumorer stærke CYP26B1 (HR = 1,330, 95% CI = 1,173-1,509, χ

2 = 21,493, p 0,001) og stærk LRAT (HR = 1,464, 95% CI = 1,110-1,930, χ

2 = 7,425, p = 0,006), blev også forbundet med dårligere prognose. Denne undersøgelse har vist, at retinsyre metaboliserende enzymer CYP26A1 er CYP26B1 og LRAT væsentligt overudtrykt i kolorektal cancer, og at CYP26B1 og LRAT er signifikant associeret med prognose både i den samlede kohorte og i de tumorer, der er mismatch reparation dygtige. CYP26B1 var uafhængigt prognostisk i en multivariat model både i hele patient kohorte (HR = 1,177, 95% CI = 1,020-1,216, p = 0,026) og i uoverensstemmelse reparation dygtige tumorer (HR = 1,255, 95% CI = 1,073-1,467, p = 0,004)

Henvisning:. Brown GT, Cash BG, Blihoghe D, Johansson P, Alnabulsi A, Murray GI (2014) Den Expression og prognostiske betydning af retinsyre enzymer i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (3): e90776. doi: 10,1371 /journal.pone.0090776

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: November 21, 2013; Accepteret: 4 Februar, 2014; Udgivet: 7 marts 2014

Copyright: © 2014 Brown et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen blev finansieret af University of Aberdeen Development Trust (https://www.abdn.ac.uk/giving/) og Encompass (https://www.encompass-scotland.co.uk/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Graeme Murray er en videnskabelig rådgiver for Vertebrate antistoffer, der har bidraget til denne forskning. Ingen økonomisk vederlag har været eller er modtaget for denne position heller ikke han holder aktier i dette selskab. Beatriz Cash og Ayham Alnabulsi er medarbejdere i Vertebrate antistoffer. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de hyppigste former for malignitet hvis fem år overlevelse fortsat på cirka halvtreds procent trods af indførelsen af ​​tarmkræft screeningsprogrammer [1]. Mens den molekylære patogenese af denne type svulst i stigende grad at blive forstået og defineret især de tidlige stadier af kolorektal kræft udvikling, hvor de molekylære ændringer er blevet afgrænset med en høj grad af detaljer [2] – [4]. Men der er stadig et klart behov for at identificere biomarkører for kolorektal cancer, herunder prognostiske, prædiktive og diagnostiske markører [5] – [15].

Retinsyre (RA) er en metabolit af vitamin A (retinol), der udfører vigtige funktioner i normal vækst og differentiering celle og dysreguleret retinsyre stofskifte er blevet impliceret i tumorigenese [16], [17]. Retinoider, et begreb, der anvendes til at beskrive naturlige eller syntetiske forbindelser, der viser en strukturel eller funktionel lighed med retinol, har fremtrædende roller i cellevækst, differentiering og apoptose [16]. Den mest aktive form af RA, all-trans-retinsyre (atRA), har et gen regulatorisk funktion og spiller en afgørende rolle i udviklingen af ​​de multiple organer. 4-oxo-9-cis-retinsyre (9-cis-RA) og 4-oxo-13-cis-retinsyre (13-cis-RA) er stereo-isomerer af atRA og også spille en vigtig rolle i RA signalering . Nogle retinoider besidder anti-cancer egenskaber, der allerede er udnyttet til behandling af flere typer af kræft, herunder livmoderhalskræft og promyelocytleukæmi.

Den intracellulære behandling af retinol involverer lecithin retinol acyl transferase (LRAT), som er ansvarlig for forestring af retinol [18], [19] mens hydroxylering af retinol udføres af retinsyren hydroxylaser (CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1), som alle medlemmer af cytochrom P450 (P450) familie af enzymer [20], [21] .

de tre medlemmer af CYP26 familien er alle i stand til at metabolisere atRA i mindre biologisk aktive 4-hydroxy, 4-oxo, og 18-hydroxy-RA mellemprodukter [22] – [24], af som, 4-oxo-RA er den mest almindelige metabolit [16]. Skønt tidligere undersøgelser har undersøgt P450-ekspression i tumorer og vist tumor selektiv ekspression af individuelle P450’er mest bemærkelsesværdigt CYP1B1 [25] CYP26 familien af ​​P450’er har fået meget lidt opmærksomhed forudgående i forhold til deres ekspression i tumorer.

Denne undersøgelse har profileret udtryk for retinsyre metaboliserende enzymer CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT ved hjælp af en velkarakteriseret kolorektal cancer væv microarray med monoklonale antistoffer mod CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT henholdsvis som er blevet udviklet og karakteriseret for deres anvendelse ved immunhistokemi på formalin fast voks indlejret væv.

Materialer og metoder

monoklonale antistoffer

monoklonale antistoffer mod CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT blev udviklet i samarbejde med hvirveldyr antistoffer Ltd (Aberdeen, UK ) under anvendelse af syntetiske peptider. Peptider inden for de formodede proteinsekvenser blev identificeret som var antigene, eksponeret på overfladen og unik for målproteinet. Aminosyresekvenserne og placering på proteinerne er angivet i tabel 1. Peptiderne blev opnået fra Almac Sciences Ltd., (Edinburgh, Storbritannien) og konjugeret individuelt til ovalbumin for immuniseringer og til bovint serumalbumin til ELISA test [26]. Immunisering af mus, blev produktionen af ​​hybridomaceller og ELISA screening udført i det væsentlige som beskrevet tidligere [26], bortset fra at antigen blev givet subkutant. Hybridomerne blev klonet ved begrænsende fortynding, indtil en enkelt ELISA positiv koloni blev dyrket i en plade med 96 brønde. Individuelle cellelinier blev derefter dyrket ved høj celledensitet for udarbejdelsen af ​​antistoffet bestand, som blev brugt senere til deres karakterisering ved immunoblotting og immunhistokemi.

Immunoblotting

Hele cellelysater fra celler (humane embryoniske nyreceller) overudtrykker CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT blev anvendt som positive kontroller for immunoblotting mens lysater fra celler indeholdende vektor kun blev anvendt som negative kontroller. Den CYP26A1 cellelysat og dens kontrol blev købt fra Abnova (Taipei, Taiwan), mens CYP26B1 blev CYP26C1 og LRAT indeholder cellelysater og deres tilsvarende kontroller fås fra (Novus Biologicals, Cambridge, UK). Cellelysater (5 ug protein /lane) blev løst ved elektroforese på NuPAGE 4-12% bis-Tris geler (Fisher Scientific, Loughborough, UK). Efter protein overførsel blev membranerne blokeret i 1 time ved stuetemperatur i phosphatbufret saltvand-Tween-20 (PBST) indeholdende 1% (vægt /volumen) skummetmælkspulver. Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med CYP26A1 (1/5 fortynding), CYP26B1 (1/2 fortynding), CYP26C1 (1/2 fortynding) eller LRAT (1/2 fortynding) monoklonale antistoffer fortyndet i PBST. Membraner blev vasket (6 gange) i 1 time i 1% skummetmælk. Membranerne blev derefter probet i 1 time med et sekundært antistof konjugeret peberrod-peroxidase-konjugeret anti-muse-IgG (1/2000, Sigma-Aldrich, Dorset, UK). Membraner blev derefter vasket (6 gange) i 1 time i 1% skummetmælk og proteinbånd visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens påvisningssystem (Fisher Scientific) Salg

kolorektal cancervæv microarray Salg

Alle tilfælde af. kolorektal cancer inkluderet i denne undersøgelse blev retrospektivt vælges fra Aberdeen kolorektal tumor bank (nu indarbejdet i og governanced af NHS Grampian Biorepository, Aberdeen, UK). I alt blev tumor prøver fra 650 patienter involveret i denne undersøgelse, i hvert enkelt tilfælde, havde en diagnose af primær kolorektal cancer er foretaget, og patienterne havde gennemgået elektiv kirurgi for primær kolorektal cancer, i Aberdeen, mellem 1994 og 2009. Ingen af patienterne havde modtaget nogen form for præoperative kemoterapi eller strålebehandling. Især patienter med endetarmskræft, som havde fået neoadjuverende terapi, herunder kort kursus stråleterapi blev udelukket. Dataene for patienterne og deres tumorer inkluderet i denne undersøgelse er anført i tabel S1. Survival oplysninger (total mortalitet) var til rådighed for alle patienter og på tidspunktet for censurere patientdata resultatdata der havde været 309 (47,5%) dødsfald. Den gennemsnitlige patient overlevelse var 115 måneder (95% CI 108-123 måneder).

De tumorer blev rapporteret ifølge The Royal College of Pathologists britiske retningslinjer for histopatologiske rapportering af kolorektal cancer resektion prøver, og som inkorporerer vejledning fra udgave 5 i TNM [27]. Den histopatologiske behandling af kolorektale cancer excision enheder er nærmere beskrevet i Materialer og metoder S1.

En kolorektal cancervæv microarray blev konstrueret indeholdende normale colon mucosale prøver (n = 50), primær (n = 650) og metastatisk colorektal cancer prøver (n = 285) som tidligere beskrevet [28] – [30]. Detaljer ved konstruktionen af ​​vævet mikroarray er angivet i Materialer og Fremgangsmåder S1.

Immunhistokemi

Immunhistokemi for hvert antistof blev udført med biotin-frit Dako Envision systemet (Dako, Ely, UK) anvendelse af en Dako Autostainer (Dako) som tidligere beskrevet [28] – [30]. Nærmere oplysninger om immunhistokemi er givet i Materialer og metoder S1. Sektionerne blev evalueret ved lysmikroskopisk undersøgelse og intensiteten af ​​immunofarvning i hver kerne vurderes uafhængigt af to forskere (GTB og GIM) under anvendelse et pointsystem tidligere beskrevet til vurdering af proteinekspression i tumor microarrays [28] – [30]. Intensiteten af ​​immunofarvning i hver kerne blev scoret som negativ, svag, moderat eller stærk. Den sub-cellulære lokalisering (nukleare, cytoplasmatisk eller membranøs) af immunfarvning blev også registreret. Variation i immunfarvning mellem kerner i hvert enkelt tilfælde blev ikke identificeret. Eventuelle uoverensstemmelser i immunhistokemisk vurdering af væv kerner mellem de to observatører blev løst ved samtidig mikroskopisk revurdering.

Vurdering af mismatch repair status

Mismatch reparation status (MMR) blev vurderet ved immunhistokemi anvendelse af antistoffer til MLH1 og MSH2 som tidligere beskrevet [28], [30]. MMR-status blev registreret som enten dygtige eller defekt.

Statistik

Statistisk analyse af data, herunder af Mann-Whitney U test, Wilcoxon-test, chi-squared test, Kaplan-Meier overlevelse analyse, log-rank test og Cox multi-variate analyse (variabler angivet som kategoriske variable), herunder beregning af hazard ratio og 95% CIs blev udført ved hjælp af IBM SPSS-version 21 til Windows 7 ™ (IBM, Portsmouth, UK). Den log rank test blev anvendt til bestemmelse overlevelse forskelle mellem de enkelte grupper. En sandsynlighed værdi på p ≤ 0,05 blev betragtet som signifikant. Indflydelsen af ​​forskellige Inddelingen i relation til overlevelse blev undersøgt ved dichotomizing intensiteten score for hver markør. De grupper, der blev analyseret var negative farvning versus enhver positiv farvning, negativ og svag farvning versus moderat og stærk farvning og negative, svage og moderat farvning versus stærk farvning.

Etik

Projektet havde godkendelse af det nordlige Skotland videnskabsetisk komité (ref. nr. 08 /S0801 /81 og 11 /NS /0015). Den videnskabsetisk komité ikke kræver skriftlig patient samtykke til de retrospektive vævsprøver, der var inkluderet i kolorektal cancer væv microarray.

Resultater

monoklonale antistoffer

specificitet monoklonale antistoffer mod CYP26A1, CYP26B1, CYP26C1 og LRAT blev bestemt ved ELISA under anvendelse af de immunogene peptider og også ved immunoblotting (figur 1) ved anvendelse af hele cellelysater fra celler, der overudtrykker hvert protein. Et bånd, der migrerer ved den forventede molekylvægt blev observeret for hvert antistof i et lysat fremstillet ud fra celler, der overudtrykker det relevante protein, mens der ikke blev påvist med den tilsvarende kontrol lysat.

venstre vognbane af hvert panel indeholder kontrolcelle lysat mens højre vognbane af hvert panel indeholder lysat fremstillet ud fra celler, der overudtrykker det relevante protein. 5 mikrogram protein blev læsset per brønd.

Immunhistokemi

CYP26A1, CYP26B1 og LRAT alle viste immunoreaktivitet i både normal colon epitel og primær og metastatisk kolorektal cancer og i hvert tilfælde immunfarvning var lokaliseret til cytoplasmaet af celler (figur 2). Der var ingen nukleare eller celle overflade imunoreactivity membran. I normal colon epitel immunfarvning blev overvejende lokaliseret overflade epitelceller og ingen intratumour heterogenitet blev observeret i enten primære eller metastatiske kolorektale tumorer. CYP26C1 viste ikke nogen immunfarvning i nogen af ​​vævsprøverne undersøgt.

Intensiteten af ​​immunofarvning var signifikant højere i primær colorektal cancer sammenlignet med normal colon mucosa for CYP26A1 (p = 0,002), CYP26B1 (p lt 0,001) og LRAT (p 0,001) (figur 3, tabel 2). Der var ingen forskel i intensiteten af ​​ekspression af enten CYP26A1 eller CYP26B1 mellem Dukes C colorectal cancer og deres tilsvarende lymfeknudemetastase henviser til LRAT der var et signifikant fald i immunreaktivitet i lymfeknudemetastaser sammenlignet med de tilsvarende primære tumorer (p 0,001 ) (figur 3 og tabel 2)

udtryk for CYP26A1 var stærkt korreleret med både CYP26B1 udtryk (χ

2 = 192,2, s. 0,001) og LRAT udtryk (χ

2 = 89,54, p 0,001), mens CYP26B1 udtryk også korreleret med ekspressionen af ​​LRAT (χ

2 = 144,88, p. 0,001)

Forholdet til klinisk-patologiske parametre

Sammenligninger af ekspressionen af ​​CYP26A1, CYP26B1 og LRAT og klinisk-patologiske parametre er opsummeret i tabel 3. CYP26B1 og LRAT begge viste signifikante associationer til tumorstedet, tumor (T) trin, extramural venøs invasion og samlet fase. I modsætning hertil CYP26A1 viste kun et forhold til tumor websted og viste ikke et forhold til nogen af ​​de andre klinisk-patologiske parametre undersøgt.

Survival analyse

Hele patient kohorte.

forholdet af ekspressionen af ​​CYP26A1, CYP26B1 og LRAT med samlet overlevelse blev undersøgt ved hjælp af forskellige cut-off points (negativ v svag v moderat v stærk, negativ v positiv, negativ /svag positiv v moderat /stærkt og negativt /svag /moderat v stærk) af den immunhistokemiske scoring og er sammenfattet i tabel 4 og figur 4.

A-D hel patient kohorte. A. samlede overlevelse viser individuelle CYP26B1 kategorier. I B-D er vist indflydelsen af ​​forskellige snit af point. E-H mismatch repair dygtige kohorte. E. samlet overlevelse viser individuelle CYP26B1 kategorier. I F-H er vist indflydelsen af ​​forskellige cut-off point.

Der var en konsekvent og signifikant sammenhæng mellem CYP26B1 udtryk og resultat (figur 4). I betragtning af hver CYP26B1 intensitet gruppe separat, stigende intensitet af CYP26B1 immunoreaktivitet var forbundet med dårligere prognose (HR = 1,239, 95% CI = 1,104-1,390, χ

2 = 15,063, p = 0,002). For CYP26B1 negative tumorer (n = 242) den gennemsnitlige overlevelse var 133 måneder (95% CI = 118-148 måneder) for CYP26B1 svage udtrykke tumorer (n = 216) den gennemsnitlige overlevelse var 106 måneder (95% CI = 95-116 måneder), for CYP26B1 moderat udtrykke tumorer (n = 106) den gennemsnitlige overlevelse var 103 måneder (95% CI = 85-120 måneder), og for stærkt udtrykke CYP26B1 tumorer (n = 58) den gennemsnitlige overlevelse var 81 måneder (95% CI = 60-101 måneder).

Sammenligning CYP26B1 negative tumorer med tumorer, der viste nogen CYP26B1 immunoreaktivitet derefter dårligere overlevelse var forbundet med CYP26B1 udtryk (HR = 1,352, 95% CI = 1,054-1,735, χ

2 = 5,707, p = 0,017). For CYP26B1 negative tumorer (n = 242) den gennemsnitlige overlevelse var 133 måneder (95% CI = 118-148 måneder), mens for CYP26B1 positive tumorer (n = 380) den gennemsnitlige overlevelse var 107 måneder (95% CI = 98-116 måneder ). Sammenligning CYP26B1 negative og svagt positive tumorer med CYP26B1 moderate og stærke udtrykker tumorer viste, at der var en meget signifikant sammenhæng med overlevelse (HR = 1,465, 95% CI = 1,151-1,865, χ

2 = 9,832, p = 0,002). Gennemsnitlige overlevelse for de negative /svage tumorer (n = 458) var 125 måneder (95% CI = 115-135 måneder), mens den gennemsnitlige overlevelsestid for den moderate /stærk gruppe af tumorer (n = 164) blev 96 måneder (95% CI = 108-124 måneder). CYP26B1 negative /svage /moderate udtrykker tumorer sammenlignet med CYP26B1 stærkt udtrykker tumorer viste også en meget signifikant sammenhæng med overlevelse (HR = 1,737, 95% CI = 1,248-2,418, χ

2 = 11,092, p = 0,001). Den gennemsnitlige overlevelse for CYP26B1 negative /svag /moderat (n = 564) var 119 måneder (95% CI = 111-128 måneder) mens betyde overlevelse for CYP26B1 stærke tumorer (n = 58) var 80 måneder (95% CI = 60-101 måneder).

for LRAT var der en signifikant sammenhæng med overlevelse (HR = 1,321, 95% CI = 1,034-1,688, χ

2 = 5,039, p = 0,025), når immunhistokemi intensitet score blev dikotomiseret ind LRAT negative og svage tilfælde (n = 239) versus LRAT moderate og stærke tilfælde (n = 383) (figur 5). For LRAT negative og svage tilfælde betyde overlevelse var 132 måneder (95% CI = 119-146 måneder) mens LRAT moderate og stærke sager betyde overlevelse var 106 måneder (95% CI = 96-116 måneder). Der var ingen sammenhæng mellem CYP26A1 og overlevelse i hele patient kohorte.

A. Forholdet mellem LRAT og overlevelse i alle kolorektal kræft og B. Forholdet mellem LRAT og overlevelse i misforhold reparation dygtige tumorer.

Den detaljerede forhold mellem CYP26A1, CYP26B1 og LRAT udtryk, patologiske parametre og samlet overlevelse er vist i tabel S2, S3, S4 og S5.

i multivariat analyse CYP26B1 forblev uafhængigt prognostiske (p = 0,026), mens der ikke var nogen uafhængig prognostisk betydning LRAT ekspression (tabel 5). Hvis den multivariate analyse model indeholder kun de variabler, der ville være til rådighed fra en biopsi af kolorektal cancer (dvs. ingen oplysninger om pT stadium PN scenen og EMVI) derefter CYP26B1 er en betydelig uafhængig prognostisk markør (p = 0,017, tabel S6)

MMR dygtige kohorte.

i MMR dygtige tumorer var der en konsistent sammenhæng mellem intensiteten af ​​CYP26B1 udtryk og samlet overlevelse (tabel 6, figur 4). Stigende intensitet CYP26B1 immunoreaktivitet var forbundet med dårligere prognose (HR = 1,330, 95% CI = 1,173-1,509, χ

2 = 21,493, p 0,001). For CYP26B1 negative tumorer (n = 200) den gennemsnitlige overlevelse var 143 måneder (95% CI = 127-158 måneder) for CYP26B1 svage tumorer (n = 186) den gennemsnitlige overlevelse var 106 måneder (95% CI = 94-116 måneder ), for CYP26B1 moderate tumorer (n = 87) den gennemsnitlige overlevelse var 96 måneder (95% CI = 82-112 måneder) og for stærkt udtrykke CYP26B1 tumorer (n = 49) den gennemsnitlige overlevelse var 77 måneder (95% CI 56- 98 måneder).

Sammenligning CYP26B1 negative tumorer med tumorer, der viste nogen CYP26B1 immunoreaktivitet derefter dårligere overlevelse var forbundet med CYP26B1 udtryk (HR = 1,604, 95% CI = 1,207-2,132, χ

2 = 10,796, p = 0,001). For CYP26B1 negative tumorer (n = 200) den gennemsnitlige overlevelse var 143 måneder (95% CI = 127-158 måneder), mens for CYP26B1 positive tumorer (n = 322) den gennemsnitlige overlevelse var 104 måneder (95% CI = 94-114 måneder ). Sammenligning CYP26B1 negative og svagt positive tumorer med CYP26B1 moderate og stærke udtrykker tumorer viste en meget signifikant sammenhæng med overlevelse (HR = 1,617, 95% CI = 1,242-2,105, χ

2 = 12,962, p 0,001). Mean overlevelse for de negative /svage tumorer (n = 386) var 130 måneder (95% CI = 120-141 måneder), og den gennemsnitlige overlevelse for den moderate /stærk gruppe af tumorer var 92 måneder (95% CI = 79-106 måneder ). CYP26B1 negative /svage /moderate udtrykker tumorer sammenlignet med CYP26B1 stærkt udtrykker tumorer viste også en meget signifikant sammenhæng med overlevelse (HR = 1,948, 95% CI = 1,366-2,777, χ

2 = 14,149, p 0,001). Den gennemsnitlige overlevelse for CYP26B1 negative /svag /moderat (n = 473) var 123 måneder (95% CI = 113-132 måneder), og det betyder overlevelse for CYP26B1 stærkt udtrykker tumorer blev 77 måneder (95% CI = 56-98 måneder).

For LRAT var der en signifikant sammenhæng med overlevelse (HR = 1,464, 95% CI = 1,110-1,930, χ

2 = 7,425, p = 0,006), når immunhistokemi intensitet scoringer blev dikotomiseret ind LRAT negative og svage tilfælde (n = 198) versus LRAT moderate og stærke tilfælde (n = 326) (figur 5). For LRAT negative og svage tilfælde betyde overlevelse var 139 måneder (95% CI = 124-156 måneder) mens LRAT moderate og stærke sager betyde overlevelse var 106 måneder (95% CI = 96-116 måneder). Der var ingen sammenhæng mellem CYP26A1 og overlevelse i MMR dygtige patient kohorte.

I multivariate analyse CYP26B1 forblev uafhængigt prognostiske (p = 0,026), mens der ikke var nogen selvstændig prognostisk betydning af LRAT udtryk (tabel 7). Hvis den multivariate analyse model indeholder kun de variabler, der ville være til rådighed fra en biopsi af kolorektal cancer (dvs. ingen oplysninger om tumor stadie, nodal scene og ekstra-vægmaleri venøs invasion), så CYP26B1 er en meget betydelig uafhængig prognostisk markør (p = 0,001, tabel S6)

Der var ingen sammenhæng af MMR defekte tumorer med CYP26A1, CYP26B1 eller LRAT udtryk og samlet overlevelse.

diskussion

Tyktarmskræft er en af ​​de almindeligste former for kræft, hvis hyppighed er fortsat med at stige, og mens de molekylære begivenheder, der kendetegner den tidlige fase af tyk- og udvikling af kræft er blevet beskrevet i detaljer er der stadig klart krav at identificere, karakterisere og validere biomarkører for kolorektal cancer [4] – [6] , [12].

Denne undersøgelse har defineret udtrykket profil retinsyre metaboliserende enzymer CYP26A1, CYP26B1 og CYP26C1 som er medlemmer af P450-familien af ​​enzymer og LRAT i en stor kohorte af godt karakteriserede kolorektal kræft. Den prognostiske betydning af ekspressionen af ​​disse retinsyre enzymer er også blevet etableret

P450’er er en stor gruppe af NADP afhængige hydroxylaser klassificeret i familier, undergrupper og enkelte medlemmer [31] -. [34] . Der er to forskellige funktionelle grupper af P450’er baseret på deres substratspecificitet for enten xenobiotika eller endogene forbindelser. CYP1, CYP2 og CYP3 er de fremherskende familier involveret i metabolismen af ​​miljøfremmede stoffer, mens andre familier fra CYP4 opefter er involveret i metabolismen af ​​bestemte grupper af biologisk aktive endogene forbindelser, herunder eicosanoider, steroidhormoner, galdesyrer og vitaminer, herunder vitamin A og D [ ,,,0],35] – [42]. De har flere transkriptionel og post-transkriptionelle reguleringsmekanismer [43]. har vist de xenobiotiske metaboliserende former af P450 er blevet grundigt undersøgt i tumorer og mange individuelle elementer, der skal overudtrykt i bestemte typer tumorer især CYP1B1 som har vist sig at have forøget ekspression i en lang række tumorer [25], [44 ] – [52]. Tumoren selektiv ekspression af P450 er blevet foreslået som et terapeutisk mål især for P450 medieret aktivering pro-drug [51] – [57]. De P450’er involveret i endogen forbindelse metabolisme har generelt fået meget mindre studie i tumorer med undtagelse af P450, der er involveret i kønshormon (østrogen og testosteron) metabolisme i forhold til mål i bryst- og prostatacancer henholdsvis [58] -. [60]

Strukturelt de P450’er viser størst aminosyre mangfoldighed i deres C-terminale ender, som er den hydrofile komponent af proteinet i modsætning til den N-terminale ende, som er den mest lipofile komponent af proteinet. I betragtning af den markerede C-terminale aminosyre variation og dens hydrofilicitet anvendelsen af ​​peptider til den C-terminale ende af individuelle P450 som immunogener til at producere monoklonale antistoffer mod individuelle former af P450 har vist for mange forskergrupper herunder vores egne at være en meget effektiv strategi at udvikle individuel form-specifik P450 monoklonale og polyklonale antistoffer [30], [61], [62].

i denne undersøgelse har vi produceret antistoffer, der er specifikke for individuelle former af CYP26 familien nemlig CYP26A1, CYP26B1 og CYP26C1. Alle tre CYP26 enzymer hydroxylat retinsyre og den mest fuldstændigt karakteriseret, er CYP26A1, som er den fremherskende form involveret i retinsyre hydroxylering. CYP26B1 og CYP26C1 er mere nylig identificeret medlemmer af CYP26 familie og er mindre godt karakteriseret i sammenligning med CYP26A1. CYP26C1 synes at have fremherskende, men ikke nødvendigvis eksklusivt udtryk i bestemte områder af hjernen [22], [23].

tarmkræft kan klassificeres efter deres mikrosatellit instabilitet /MMR status, og dette er en stor vej for kolorektal cancer udvikling [63], [64]. I denne undersøgelse fandt vi prognostisk betydning for CYP26B1 i både hele patient kohorten og i de tumorer, der blev defineret som mikrosatellit intakt eller stabil. I modsætning de tumorer, der var MMR defekte viste ikke nogen prognostisk betydning tyder på, at distinkte reguleringsmekanismer kan opererer i MMR dygtige og MMR defekte tumorer.

De CYP26 enzymer er blevet foreslået som anti-cancer drug mål [65 ] og den øgede ekspression af CYP26A1 og CYP26B1 i kolorektal cancer vil foreslå, at disse enzymer kan være relevante terapeutiske mål i denne type af tumorer. Flere serier af forbindelser baseret på forskellige strukturelle egenskaber er blevet syntetiseret, der inhiberer CYP26 [66] – [69]. Disse forbindelser er meget selektive for CYP26 og viser høj hæmmende aktivitet (nanomolær potens) mod CYP26A1. Men den inhibitoriske aktivitet af disse forbindelser mod CYP26B1 og CYP26C1 er endnu ikke blevet evalueret. Epidemiologiske undersøgelser har også foreslået målretning af retinoider og retinsyre veje for chemoprevention af kolorektal cancer og den øgede udtryk for CYP26A1 og CYP26B1 i kolorektal cancer tyder på, at målrette disse enzymer kan være en nyttig tilgang [70] -. [72]

Denne undersøgelse fandt også øget udtryk for LRAT i primær kolorektal cancer sammenlignet med normal colon epitel. Denne opdagelse synes at kontrast med tidligere undersøgelser af andre typer tumorer, herunder blærekræft [73], brystcancer [74] og prostatacancer [75], som har foreslået reduceret LRAT ekspression i cancerceller omend i disse studier relativt lille antal tumorprøver var analyseret og hovedsagelig biokemiske analyser af hele tumor ekstrakter blev anvendt resulterer i vurderingen af ​​et “gennemsnitligt niveau” som tumor stroma og nekrotisk væv vil have været inkluderet. Der var signifikante sammenhænge mellem LRAT udtryk i både hele patient kohorten og MMR dygtige tumorer når LRAT scoringer blev dikotomiseret i negativ /svag /moderat og stærk. Denne forening var ikke så markant for andre cut-off point og var mindre robust end observeret for CYP26B1 i form af prognostiske betydninger.

Det største problem med de fleste typer af kræft, herunder kolorektal cancer, er metastatisk sygdom og behandling er normalt rettet mod metastaser selvom fænotypisk vurdering på hvilke behandling beslutninger er ofte lavet ved analyse af primære tumor prøver. I modsætning til de veldefinerede molekylære begivenheder, der fører til udviklingen af ​​colorectal cancer de veje for metastase har fået langt mindre opmærksomhed [76]. Denne undersøgelse blev designet til at omfatte en vurdering af fænotypisk ekspression i både primære tumorer og deres tilsvarende lymfeknudemetastase. Det blev konstateret, at der ikke var nogen forskel i udtryk i CYP26A1 eller CYP26B1 mellem primære tumorer og tilsvarende lymfeknude metastaser. Viste imidlertid LRAT signifikant fald i ekspression i lymfeknudemetastaser sammenlignet med de tilsvarende primære tumorer. Dette tyder begge primære tumor relaterede faktorer og microenvironmental faktorer er involveret i reguleringen af ​​ekspression af disse enzymer i metastase af colorektal cancer. De potentielle konsekvenser af ændret udtryk for CYP26A1, CYP26B1 og LRAT i metastatiske kolorektal cancer celler og deres bidrag til en pro-metastatisk fænotype er skitseret i figur 6.

A.