PLoS ONE: Identifikation af C16orf74 som en markør for Progression i Primær ikke-Muscle Invasive Blære Cancer

Abstrakt

Formål

Methylering-induceret nedregulering af

PRSS3

har været vist sig at være signifikant associeret med invasiv blærekræft, og udtryk for

C16orf74

gen locus har vist sig at korrelere positivt med

PRSS3.

Formålet med aktuelle undersøgelse var at evaluere forholdet mellem

C16orf74

udtryk niveau og progression i ikke-muskel invasiv blærekræft (NMIBC).

Materialer og metoder

C16orf74

mRNA-niveauer blev undersøgt af real -Time revers transkriptase polymerasekædereaktion (RT-PCR) analyse af 193 tumorprøver fra patienter med primær NMIBC. Ekspressionssystemer data blev analyseret med hensyn til kliniske og eksperimentelle parametre. Kaplan-Meier kurver og multivariate Cox regressionsmodeller henholdsvis blev brugt til at bestemme progressionsfri overlevelse og for at identificere uafhængige prædiktive parametre progression.

Resultater

Analyse ved hjælp af Kaplan-Meier kurver afslørede længerevarende progressionsfri overlevelse af høj-

C16orf74

-expressors i forhold til lav-ekspressorer (p 0,001). Multivariat Cox regressionsanalyse viste, at lav

C16orf74

mRNA ekspressionsniveauerne er en væsentlig risikofaktor for sygdomsprogression hos patienter med primær NMIBC (HR: 10,042, CI: 2,699 til 37,360, p = 0,001)

konklusioner

Nedsat udtryk for

C16orf74

korrelerer signifikant med progression i primær NMIBC.

C16orf74

udtryk niveau repræsenterer en potentielt nyttig markør til at forudsige progression i primære NMIBC patienter

Henvisning:. Kim WT, Yun SJ, Park C, Kim IY, Moon SK, Kwon TG, et al . (2010) Identifikation af

C16orf74

som en markør for Progression i Primær ikke-Muscle Invasive blærekræft. PLoS ONE 5 (12): e15260. doi: 10,1371 /journal.pone.0015260

Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA

Modtaget: August 16, 2010; Accepteret: November 2, 2010; Udgivet: December 21, 2010

Copyright: © 2010 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (2010 til 0.001.730). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mere end 90% af blære kræft er overgangsordninger celle carcinomer, og de fleste er papillær, vel- eller moderat-opdelte non-muskel invasiv blærekræft (NMIBC) [1] – [2]. Efter endoskopisk resektion, cancertilbagefald forekommer i de fleste (50-70%) af patienterne med NMIBC [3]. Ca. 20% af disse patienter efterfølgende oplever sygdomsprogression til muskel invasiv blærekræft (MIBC) efter passende behandling, herunder transurethral resektion (TUR) og intravesikal behandling med epirubicin, mitomycin-C, eller Bacillus Calmette-Guerin (BCG) [1] – [2]. Således hyppige tilbagefald efter TUR og efterfølgende kræft progression er problematiske for patienter og urologer ens. Næsten 25% af nydiagnosticerede patienter blærekræft har MIBC, og langt de fleste af disse tilfælde er af høj histologisk kvalitet. Næsten 50% af patienterne med MIBC allerede har okkult fjerne metastaser på diagnosetidspunktet [1] – [2]

En række potentielle tumormarkører er blevet identificeret for blærekræft, men kun få har vist virkning i. hensyn til at forudsige recidiv og progression. Imidlertid har flere nylige undersøgelser antydet, at de undertrykkende gener

p53

,

RUNX3

,

RASSF1A

, og

PRSS3

er tæt forbundet med udviklingen og progression af blærecancer [4] – [7]. Konkret

RASSF1A

PRSS3

promotor methylering er forbundet med fremskreden tumor stadie [7], hvilket tyder på, at disse gener kan være forbundet med blærekræft progression.

PRSS3

til gengæld har vist sig at have en positiv sammenhæng med

C16orf74

udtryk [8].

C16orf74

(MGC17624) gen locus er på kromosom 16q24.1, og dens funktion er endnu ikke karakteriseret. Resultaterne af adskillige genom-dækkende undersøgelser har vist, at

C16orf74

er involveret i inflammatoriske processer. Tumornekrosefaktor (TNF) -α er en central regulator af den inflammatoriske kaskade i kroniske inflammatoriske sygdomme, og hos patienter med inflammatorisk sygdom,

C16orf74

er stærkt forbundet med et anti-TNF-respons [9].

C16orf74

er en hypoxi reguleret gen [10] – [11]. Winter et al. [10] rapporterede, at

C16orf74

median RNA udtryk niveau er en uafhængig prognostisk faktor for tilbagefald overlevelse i hoved og halscancer.

C16orf74

er også blevet vist at være opreguleret i lymfeknudeceller-positive metastaser hos patienter med oral tunge pladecellecarcinom [12], og at korrelere positivt med

PRSS3

ekspression i brystcancer [8 ].

for nylig rapporterede vi identifikationen af ​​en progression-relateret gen klassificeringen, der havde stærk prædiktiv værdi i form af sygdom resultater i NMIBC [13]. I denne undersøgelse,

C16orf74

var en af ​​otte kandidatgener identificeret til at forudsige sygdomsprogression hos NMIBC, hvilket tyder på en potentiel sammenhæng mellem blærekræft og

C16orf74

. I den aktuelle undersøgelse, vurderede vi forholdet mellem

C16orf74

og NMIBC slutresultaterne efter data fra en tidligere undersøgelse befolkning samt nye sager, alle med langsigtet opfølgning.

Resultater

1. Baseline karakteristika

Den gennemsnitlige alder af de 193 forsøgspersoner med primær NMIBC var 64,1 ± 14,0 år, og median follow-up periode var 44,9 måneder. Halvfjerds-én patienter (36,8%) oplevede recidiv og 20 (10,4%) oplevet progression. Andre baseline karakteristika for de patienter, er præsenteret i tabel 1.

2. Værdien af ​​

C16orf74

mRNA udtryk niveau som en prognostisk markør for progression

Forholdet mellem

C16orf74

mRNA udtryk niveau og tid til progression blev analyseret. Ved hjælp af en ROC-kurve, blev en afskæringsværdi (11,7784) for progression med den højeste kombinerede følsomhed (53,2%) og specificitet (85%) bestemt. Tid til progression var signifikant forskellig mellem de høje og lave

C16orf74

mRNA ekspression grupper, i den tid til progression i den høje

C16orf74

udtryk gruppe var signifikant længere end den lave udtryk gruppen (p 0,001) (fig. 1). I univariate Cox regressionsanalyse af adskillige klinisk-patologiske variabler (alder, køn, tumorstørrelse, nummer, klasse, scene, intravesikal terapi og

C16orf74

mRNA ekspression niveauer), alder, intravesikal terapi og

C16orf74

mRNA ekspressionsniveauerne var betydelige risikofaktorer for progression (p = 0,031, p = 0,034 og p 0,001 henholdsvis). I multivariat Cox regressionsanalyse, alder og lav

C16orf74

mRNA ekspressionsniveauerne var betydelige risikofaktorer for progressionsfri overlevelse hos patienter med primær NMIBC (HR: 1,049, CI: 1,005-1,094, p = 0,030; og HR : 10,042, CI: 2,699 til 37,360, p = 0,001, henholdsvis) (tabel 2). I multivariat Cox regressionsanalyse hos patienter med intravesikal terapi, alder og lave C16orf74 mRNA ekspressionsniveauerne var betydelige risikofaktorer for progressionsfri overlevelse hos patienter med primær NMIBC med intravesikal terapi (HR1.055, CI: 1,005-1,108, p = 0,031; og HR: 14,170, CI:. 2,719 til 73,837, p = 0,002, henholdsvis)

diskussion

Trypsin er medlem af serin protease familien kodet af tre trypsinogen gener, herunder

PRSS1

,

PRSS2

og

PRSS3

encode trypsinogen I, trypsionogen II, og trypsinogen IV (også kendt som mesotrypsinogen) henholdsvis [14] – [16] . Dette enzym har været kendt som en potent proteolytisk enzym, der kan ødelægge væv [17] – [18]. Der er modstridende rapporter i litteraturen af ​​den rolle, trypsin eller PRSS3 i tumor progression, med nogle undersøgelser tildele en positiv rolle [19] – [23], mens andre har rapporteret, at trypsin eller PRSS3 spiller en tumor undertrykkende rolle. Ekspressionen af ​​PRSS3 reduceres i blæren, esophageal, og gastriske cancere, og tab af PRSS3 ekspression skyldes epigenetisk inaktivering gennem promotor hypermethylering [7], [24] – [25]. Især har lyddæmpning af

PRSS3

ved promotor methylering været signifikant associeret med invasive tumor etape i blærekræft [7].

udtryk for

C16orf74

har vist sig at korrelerer positivt med

PRSS3

. Hockla et al. [8] rapporterede, at

C16orf74

er nedreguleret ved knockdown af

PRSS3

og opreguleret ved mesotrypsin behandling. Til dato har der ikke været nogen rapporter om en sammenslutning af

C16orf74

med blærekræft, medmindre andet er angivet i en tidligere arbejde af forfatterne [13]. Her har vi analyseret sammenhængen mellem mRNA ekspressionsniveauer af

C16orf74

og progression i primær NMIBC. Reduceret udtryk for

C16orf74

var signifikant associeret med sygdomsprogression i NMIBC patienter, hvilket tyder på, at

C16orf74

har en tumor undertrykkende rolle, svarende til

p53, RUNX3

og

PRSS3

, i sygdomsprogression. Til dato, funktionen af ​​

C16orf74

er ukendt, og der er behov for yderligere undersøgelser for at definere den præcise sti, som

C16orf74

påvirkninger progression i primær NMIBC.

Generelt klinisk og patologiske parametre som tumor kvalitet, tumor stadie, lymfe invasion, tumorstørrelse, CIS, papillær eller fast tumor arkitektur, og multifocality er blevet anset nyttige prognostiske parametre for sygdomsprogression i NMIBC. Af disse faktorer, generelt tumor kvalitet, scene, og tilstedeværelse af CIS er betragtes som den vigtigste. I den aktuelle undersøgelse, intravesikal terapi var en risikofaktor for progression på univariat analyse. Imidlertid er det muligt, at patienter, der fik intravesikal terapi var i en klinisk højrisikogruppe for recidiv eller progression, snarere end at den behandling påvirkede progression [26]. Forskellige molekylære markører er også blevet vurderet for sygdomsprogression. For nylig har flere undersøgelser identificerede formodede progression-relaterede gener i NMIBC vha genekspressionsanalyse [27] – [29]. Wang et al. [27] foreslået en 57-gen panel til at hjælpe med at forudsige progression i NMIBC. Birkhahn et al. [28] rapporterede, at

HRAS

,

VEGFR3

, og

VEGF

ekspressionsniveauerne var relateret til progression med 81% sensitivitet og 94% specificitet. Eguchi et al. [29] rapporterede, at tabet af 8p23.3 er en markør til at forudsige progression og tilbagefald i NMIBC. Tidligere identificerede vi en kandidat progression-relateret gen klassificeringen, der havde stærk prædiktiv værdi i form af sygdom resultater i NMIBC [13]. Selvom

C16orf74

er en enkelt molekylær markør inden for denne kandidat progression-relateret gen klassificeringen, det var tilstrækkeligt til at forudsige risikoen for progression i NMIBC med en stærk hazard ratio på mere end 10 på multivariate analyse.

i den aktuelle undersøgelse, vi undersøgte mRNA ekspressionsniveauerne af

C16orf74

i humane primære NMIBC væv i en relativt stor population med en langsigtet opfølgningsperiode, sammen med flere kendte risikofaktorer kliniske, herunder alder , tumorstørrelse, antal tumorer, T-kategori, tumorklassificering, og intravesikal terapi [30] – [31]. Disse aspekter af undersøgelsen design låne styrke til resultaterne, og tyder på, at

C16orf74

kan være en klinisk anvendelig indikator for progression i primær NMIBC.

Som konklusion, nedsat udtryk for

C16orf74

var signifikant associeret med progression i primær NMIBC, og ekspressionsniveauet af

C16orf74

var en uafhængig prognostisk faktor for tumor progression.

C16orf74

kan spille en central rolle i udviklingen af ​​NMIBC. Således

C16orf74

udtryk niveau repræsenterer en nyttig markør til at forudsige progression i primære NMIBC patienter.

Materialer og metoder

1. Etik Statement

Den etiske udvalg Chungbuk Nationale Universitet godkendt denne protokol, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver emne. Indsamling og analyse af alle prøver blev godkendt af Institutional Review Board of Chungbuk Nationale Universitet.

2. Patienter og vævsprøver

Primær NMIBC prøver fra patienter med histologisk-verificerede overgangsordning celle karcinom fås ved henvendelse til vores institut blev anvendt til den aktuelle undersøgelse. Patienter med samtidig karcinom

in situ

(CIS) eller en kort sigt follow-up periode (mindre end 6 måneder), og dem, der gennemgik radikale cystektomi eller for hvem der var ufuldstændig dataindsamling, blev udelukket for at gøre studiepopulation mere homogen. blev analyseret i alt 193 primære NMIBC prøver.

Alle tumorer blev macrodissected, typisk inden for 15 minutter kirurgisk resektion. Hver blære cancer prøve blev bekræftet ved patologisk analyse af en del af vævsprøven i friske frosne snit fra TUR prøver, og blev derefter frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. En anden TUR blev udført 2-4 uger efter den første resektion når en blærecancer prøve ikke indeholdt ordentlig muskel eller når blev detekteret high-grade tumor [32]. Patienter, som havde en T1 tumor, multiple tumorer, store tumorer (≥ 3 cm i diameter), eller høj kvalitet Ta NMIBC modtog en cyklus af intravesikal behandling (BCG eller mitomycin-C) [26], [32]. Hvis en patient nægtede intravesikal terapi, var det ikke administreres efter TUR. Respons på behandling blev vurderet ved cystoskopi og urin cytologi. Patienter, der var fri for sygdom inden for 3 måneder efter behandlingen blev vurderet hver 3. måned i de første 2 år og derefter hver 6. måned derefter [26], [32]. Tumorer blev iscenesat og karakter efter TNM klassifikationen 2002 og 1973 WHO klassificeringssystem henholdsvis [32] – [33]. Gentagelse blev defineret som tilbagefald af primær NMIBC med en lavere eller den samme patologiske stadium, og progression blev defineret som sygdom med en højere TNM stadie ved tilbagefald.

3. RNA-ekstraktion og konstruktion af cDNA

RNA blev isoleret fra væv ved anvendelse af 1 ml TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og homogenisering i et 5 ml reagensglas. Homogenatet blev overført til et 1,5-ml rør og derefter blandet med 200 pi chloroform. Efter inkubation i 5 minutter ved 4 ° C blev homogenatet centrifugeret i 13 minutter (min) ved 13.000 ×

g

ved 4 ° C. Den øvre vandige fase blev overført til et rent rør og derefter blev der tilsat 500 pi isopropanol. Blandingen blev inkuberet i 60 minutter ved 4 ° C, og derefter blev røret underkastet centrifugering i 8 minutter ved 13.000 ×

g

, 4 ° C. Den øvre vandige fase blev kasseret, og blandet med 500 pi 75% ethanol, og derefter centrifugeret i 5 min ved 13.000 ×

g

, 4 ° C. Efter bortkastning af øvre vandige lag blev pelleten tørret ved stuetemperatur, opløst i diethylpyrocarbonat (DEPC) -behandlet vand, og derefter opbevaret ved -80 ° C. Kvaliteten og integriteten af ​​RNA blev bekræftet ved agarosegelelektroforese og ethidiumbromidfarvning, efterfulgt af visuel inspektion under ultraviolet lys. cDNA blev fremstillet ud fra 1 ug totalt RNA ved anvendelse af en First-Strand cDNA Synthesis Kit (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Tyskland) ifølge producentens protokol.

4. Real-time PCR

Real-time PCR-amplifikation blev udført ved hjælp af en Rotor Gene 6000 instrument (Corbett Research, Mortlake, Australien) at kvantificere ekspressionen af ​​

C16orf74

. Real-time PCR-analyser blev udført i mikro-reagensglas (Corbett Research, Mortlake, Australien) ved hjælp af SYBR Premix EX Taq (TAKARA BIO INC., Otsu, Japan). Primerne anvendt til amplifikation var

C16orf74

(179 basepar) sense (5′-AAT GTG TGT CAG CAG CAG CA-3 ‘) og anti-sense (5’-TTT CTC CAT CAT CTG GGC AC-3 ‘). PCR-reaktionen blev udført i et slutvolumen på 10 pi bestående af 5 pi 2 X SYBR premix EX Taq-puffer, 0,5 pi hver af 5′- og 3’-primer (10 pmol /pl), og 1 pi af prøven cDNA. Produktet blev oprenset med en QIAquick Extraction kit (Qiagen, Hilden, Tyskland), kvantificeret med et spektrofotometer (Perkin Elmer MBA2000, Fremont, CA), og derefter sekventeret med et automatisk laser-fluorescens-sekventeringsapparat (ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer, Foster City, WI). Ti gange serielle fortyndinger af en kendt koncentration af produktet (fra 100 pg /pl til 0,1 pg /pl) blev anvendt til at etablere standardkurven for real-time PCR. Real-time PCR-betingelserne var som følger: 1 cyklus i 20 sekunder (sek) ved 96 ° C, efterfulgt af 40 cykler af 2 sekunder ved 96 ° C til denaturering, 15 sekunder ved 60 ° C til annealing, og 15 sekunder ved 72 ° C i forlængelse. Smeltningen program blev udført ved 72-95 ° C med en opvarmningshastighed på 1 ° C pr 45 sek. Spektrale data blev taget til fange og analyseret ved hjælp af Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0 Build 14 (Corbett Research, Mortlake, Australien). Alle prøver blev kørt tredobbelt.

glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH)

blev analyseret som et endogent RNA henvisning genet og genekspression blev normaliseret til ekspressionen af ​​

GAPDH

.

5. Statistisk analyse

For at normalisere den meget skæv fordeling af mRNA ekspressionsniveauer af

C16orf74

, oplysningerne blev naturlige log transformeret og derefter tilbage forvandlet til fortolkning af resultaterne [34]. Receiver Operating egenskaber (ROC) kurver blev anvendt til at bestemme det optimale cutoff punkt af mRNA-niveauet, der gav den højeste kombinerede følsomhed og specificitet for progression. Ved hjælp af disse værdier blev patienterne inddelt i høje eller lave

C16orf74

udtryk grupper. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt til at estimere tid til progression og forskelle blev vurderet ved anvendelse af log-rank statistik. Den prognostiske værdi af

C16orf74

i form af progression blev analyseret ved hjælp af multivariat Cox proportional hazard regressionsmodeller. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 12.0 software (SPSS Inc., Chicago, IL), og en p-værdi på 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

.