PLoS ONE: Non-Thermal Vindretning Plasma Fortrinsvis inducerer apoptose i p53-muterede kræftceller ved Aktivering ROS Stress-respons Pathways

Abstrakt

Ikke-termiske atmosfærisk tryk plasma (NTAPP) er en ioniseret gas ved stue temperatur og har potentiale som en ny apoptose-fremmende cancerterapi, der fungerer ved at generere reaktive oxygenarter (ROS). Men er det bydende nødvendigt at bestemme dens selektivitet og standardisere komponenter og sammensætning af NTAPP. Her har vi designet en NTAPP-apparats kombineret med en han gas fødesystem og vist sin høje selektivitet mod p53-muteret cancerceller. Vi først fastlagt de rette betingelser for NTAPP eksponering for selektivt at inducere apoptose i cancerceller. Den apoptotiske virkning af NTAPP var større for p53-muterede cancerceller; kunstig p53 ekspression i p53-negative HT29-celler faldt den pro-apoptotiske effekt af NTAPP. Vi undersøgte også ekstra- og intracellulære ROS niveauer i NTAPP-behandlede celler til at udlede den mekanisme af NTAPP handling. Mens NTAPP-medierede stigninger i ekstracellulær nitrogenoxid (NO) påvirkede ikke cellernes levedygtighed, intracellulær ROS steget under NTAPP eksponering og induceret apoptotisk celledød. Denne virkning blev dosisafhængigt reduceret efter behandling med ROS skyllevæsker. NTAPP induceret apoptose selv i doxorubicin-resistente cancercellelinjer påvise, at NTAPP som en potent cancerterapi. Kollektivt, disse resultater støtter stærkt potentiale NTAPP som en selektiv anticancer behandling, især for p53-muterede cancerceller

Henvisning:. Ma Y, Ha CS, Hwang SW, Lee HJ, Kim GC, Lee KW, et al. (2014) Ikke-Termisk Vindretning Plasma Fortrinsvis inducerer apoptose i p53-muterede kræftceller ved Aktivering ROS Stress-respons Pathways. PLoS ONE 9 (4): e91947. doi: 10,1371 /journal.pone.0091947

Redaktør: Subrata Roy, University of Florida, USA

Modtaget: September 25, 2013; Accepteret: 18 februar 2014; Udgivet 23. april, 2014

Copyright: © 2014 Ma et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af en bevilling fra KRICT (SI-1304) og Ministeriet for videnøkonomien, Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Apoptose er en velkendt form af programmeret celledød, der fjerner beskadigede og uønskede celler; det tjener som en afgørende mekanisme til at forsvare væv og organer fra forskellige typer af spændinger og cellebeskadigelse [1]. Selektiv induktion af apoptose i cancerceller betragtes som en ideel metode til cancerterapi, og mange anticancermidler med denne mekanisme er blevet udviklet. Men nuværende tilgange stadig står over for betydelige udfordringer at overvinde, herunder resistens, lav terapeutisk effektivitet, og kræftcelle selektivitet.

p53 tumor suppressor protein er afgørende for at opretholde genomisk stabilitet i pattedyr. Når celler udsættes for forskellige genotoksiske og cellulære stress, såsom oxidativt stress, hypoxi, stråling eller kemoterapeutiske lægemidler, er p53 aktiveret, og dens ubiquitin-afhængige nedbrydning er blokeret, hvilket fører til en ophobning af aktiv p53 transskriptionsfaktor [1]. Aktiveret p53 regulerer cellecyklus arrest, aktivering af anti-oxidanter og DNA-reparation, og apoptose ved at påvirke ekspressionen af ​​sit mål gener, herunder cyklin-afhængige kinase (CDK) inhibitor

p21 /WAF1

og gener involveret i celledød, såsom

BAX

,

PUMA

,

NOXA

, og

Fas

[2], [3]. Når cellerne udsættes for oxidativ stress, p53 aktiverer også transkriptionen af ​​sestrin, glutathionperoxidase (GPX), og aldehyd-dehydrogenase (ALDH), spiller således en central rolle i at opretholde redox balance og genomisk stabilitet under oxidativ stress [4], [5 ]. Mutation af p53-genet eller afbrydelse af veje, der fører til p53-aktivering er ofte blevet observeret i de fleste typer af human cancer [6].

p53-afhængig induktion af apoptose som respons på genotoksisk skade er et vigtigt aspekt tumor undertrykkelse. Således tabet af p53 i humane cancere bidrager til aggressiv tumor adfærd og ofte fremmer resistens af cancerceller over for stråling og kemoterapeutiske lægemidler. For eksempel behandling af p53

+ /+ musethymocytter med stråling resulterer i apoptose, hvorimod p53

– /- thymocytter er resistente. Tilsvarende p53

+ /+ mus embryonale fibroblaster transformeret med adenoviralt E1A protein og Ha-ras oncogen undergå apoptose som reaktion på y-bestråling eller kemoterapeutiske midler, men p53

– /- fibroblaster er resistente over for begge behandlinger [7 ]. Desuden er nogle p53 mutationer i cancere undertrykke funktionen af ​​p73, som inducerer apoptose gennem en p53-uafhængig mekanisme [8]. Således er den fælles tab af p53-funktion i cancerceller præsenterer en stor begrænsning for cancerterapi.

Plasma er beskrevet som kvasi-neutral blanding af ladede partikler og radikaler i en delvist ioniseret gas. For nylig har mange undersøgelser forsøgt at drage fordel af den lave temperatur af ikke-termiske atmosfærisk tryk plasmaer (NTAPPs) til biomedicinske anvendelser af kraft af styrbarhed af plasma kemi og kinetik [9] – [11]. Der findes flere typer af NTAPPs, såsom plasma nål, plasma jets, og dielektriske barriere udledninger (DBDS) [11]. Gassen komponent og varigheden af ​​den elektriske feltstyrke og puls bestemme de nøjagtige plasma sammensætninger. Studiet af NTAPPs for kliniske anvendelser er for nylig blevet en meget aktiv forskning emne; NTAPPs let genereres i luft og kan anvendes uden at forårsage termisk beskadigelse celler. Virkningerne af NTAPPs på levende væv omfatter sterilisering, sårheling, og ændringer celle migration (for anmeldelser [10], [12]). De mange forskellige virkninger af plasma afhænger plasma dosering og deres komplekse kemiske sammensætninger.

Tidligere undersøgelser vedrørende den kliniske anvendelse af NTAPP for mammale celler er hovedsageligt fokuseret på dens virkning på celledød [13], [14] . Adskillige mulige mekanismer relateret til NTAPP-medieret celledød blev rapporteret, herunder faldet af celleadhæsion [15], [16]. Især flere forskergrupper viste, at NTAPP inducerer apoptose i nogle cancerceller og kan anvendes som en cancerterapi [17], [18]. Der er en voksende mængde af beviser tyder på, at reaktive ilt arter (ROS) er de store aktører i NTAPP-induceret apoptose

in vitro

[19] – [22].

ROS er kemisk reaktive radikaler, ioner, eller molekyler indeholdende frie oxygenradikaler og et biprodukt af normal metabolisme. Basale niveauer af ROS aktivere talrige signaleringskaskader at fremme celleproliferation under normale fysiologiske betingelser [23] – [25]. Men overdreven ROS niveauer inducerer oxidative stress og direkte angribe DNA, protein, lipider og andre cellulære komponenter, i sidste ende bidrager til celle ældning og apoptose [26], [27].

Det første skridt til at udvikle NTAPP som en potentiel kræftbehandling er at evaluere dens selektive effekt mod kræftceller. Her viser vi, at NTAPP inducerer apoptose i p53-muterede cancerceller, men ikke i primære eller stamceller. Vi viser også, at NTAPP-medierede stigninger i intracellulær ROS inducere apoptotisk celledød i en koncentrationsafhængig måde. For yderligere at vurdere mulighederne for NTAPP til cancerterapi, testede vi NTAPP i doxorubicin-resistente cancerceller og fandt, at det var i stand til at inducere apoptose. Samlet set viser disse resultater støtter stærkt potentiale NTAPP som en selektiv anticancer behandling, især for p53-muterede kræft og celler, der er resistente over for eksisterende anticancerlægemidler.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur og NTAPP behandling

celler anvendt i denne undersøgelse og deres kilder er opsummeret i tabel 1. HeLa og Hep G2 celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum ( FBS) og 10 ml /L penicillin-streptomycin. G361, HCT116, HCT116 p53

– /-, HCT15, MES-SA, H1299, HT29, DLD-1, LoVo, doxorubicin-resistente HCT15 /CL02 og MES-SA /DX5-celler blev dyrket i RPMI-1640 suppleret med 10% (v /v) FBS og 10 ml /L penicillin-streptomycin. IMR90 og RKO-celler blev dyrket i Minimum Essential Medium (MEM) suppleret med 10% (vol /vol) FBS og 10 ml /L penicillin-streptomycin. YD-9-celler blev dyrket i DMEM:DMEM /F12 (01:01) suppleret med 10% (vol /vol) FBS og 10 ml /L penicillin-streptomycin. Subkutan fedtvæv blev opnået i løbet af elektive operationer med patient samtykke, som er godkendt af Samsung Hospital Institutional Review Board (IRB nr. KBC11151). Adipøst-væv afledt stamceller (ASC) blev isoleret fra vævet [28] og dyrket i DMEM /Hams F-12 (DMEM /F12) suppleret med 10% (vol /vol) FBS og 10 ml /L penicillin-streptomycin. Alle celler blev holdt ved 37 ° C under en fugtig atmosfære af 5% CO

2.

For at eksponere celler til NTAPP, 1 x 10

5-celler blev podet i 35 -mm dyrkede plader og inkuberet i 24 timer. Celler blev udsat for den angivne dosis (5 standard L /min [SLM], 5 V) i NTAPP i 30 s til 1 min hver gang hver time i højst 10 gange. Når det er nødvendigt, blev NTAPP-eksponerede celler yderligere inkuberet i 15 timer, før andre eksperimenter.

Western blot-analyse

NTAPP-eksponerede celler blev høstet og lyseret som beskrevet [29]. Histoner blev ekstraheret med 0,6 N HCI. Prøver af totalt protein (50 ug) eller histoner blev analyseret med anti-caspase-3 (Cell Signaling Technology), anti-poly ADP ribose polymerase (PARP, Cell Signaling Technology), anti-actin (Sigma-Aldrich) sera og anti -phospho-H2AX (γ-H2AX) sera (Millipore), phospho-p53 (Ser15) (Cell Signaling Technology), PUMA (Cell Signaling Technology) og Bax (Santa Cruz Biotechnology). Peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse og anti-kanin (Jackson Immuno Research) sekundære antistoffer blev anvendt, og de behandlede membraner blev visualiseret ved anvendelse af ECL-kittet (Amersham Biosciences).

Intracellulær ROS påvisning

HeLa-celler (1 x 10

5) blev podet på 35-mm skål med dækglas og repetitivt eksponeret for 5 V NTAPP i 30 s hver h for i alt syv gange før intracellulære ROS-niveauer blev vurderet ved anvendelse af en ROS detektion kit (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Ikke-fluorescerende carboxyl-H

2DCFDA kan nemt permeabilisere til levende celler, og oxideres ved intracellulær ROS til at udsende en lys grøn fluorescens signal. Tert-butylhydroperoxid (TBHP), som vides at inducere intracellulær ROS, blev anvendt som en positiv kontrol. N-acetylcystein (NAC) og natriumpyruvat (SP) blev anvendt som intracellulære og ekstracellulære ROS skyllevæsker, henholdsvis.

Ekstracellulær nitrit detektion

Produktion af ekstracellulært nitrogenoxid (NO) efter eksponering til NTAPP blev bestemt ved at måle akkumulering af nitrit, den stabile metabolit af NO, secerneres til dyrkningsmediet. Efter celler blev udsat for NTAPP blev 50 pi kulturmedium taget, blandet med et tilsvarende volumen af ​​Griess reagens (1% sulfanilamid, 0,1% naphthylethylendiamin-dihydrochlorid, og 2% phosphorsyre), og inkuberet ved stuetemperatur i 10 min. Absorbansen blev målt ved 540 nm med en mikropladelæser (SoftMax Pro 4,0, Molecular Devices) under anvendelse af en kalibreringskurve med en række 0-100 uM koncentrationer af nano

2. I NO scavenger eksperiment blev celler forbehandlet med 30, 50 eller 100 pM koncentrationer af carboxy-PTIO (Sigma-Aldrich), som reagerer støkiometrisk med NO før de blev udsat for NTAPP.

Transfektion af pcDNA-p53 Ha

Vi har tilføjet 2 pg af plasmidet pcDNA-p53-HA (venligst stillet til rådighed af Dr. J. Song, Yonsei University, Seoul, Korea) i 6 pi lineær L-PEI (polyethylenimin), blandet med 150 mM NaCl og inkuberet ved stuetemperatur i 10 min. Blandingen blev påført på HT29-celler før inkubation natten over.

Flowcytometri

Efter 10 gentagne eksponeringer af 5 V NTAPP efterfulgt af 15 timers inkubering blev cellerne høstet med trypsin-EDTA og fikseret med 70 % kold ethanol. Celler blev behandlet med 100 ug /ml RNase i 30 minutter i 37 ° C og resuspenderet i 1 × bindingspuffer (10 mM Hepes pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2). Celler blev farvet med 0,01 mg /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich), eller dobbeltklik farvet med 5 pi FITC Annexin V (BD Biosciences) og 5 pi 7AAD (eBioscience) per million celler til at detektere celler apoptotisk status. Flowcytometri blev udført med FACScalibur (BD Biosciences) og CellQuest software.

Global model analyse af plasma kemi

Fordi det er svært at eksperimentelt måle hver arter i NTAPP, udviklede plasma ingeniører en global model [30], [31], der beregner rumligt gennemsnit kemiske stoffer samt ladede partikler, under en given kørsel tilstand af eksterne kredsløb ved hjælp tidsafhængige kontinuitet ligninger for hver art. Simuleringen domæne er opdelt i to regioner: plasmakilde regionen og den neutrale gas domæne uden plasmaer. Sidstnævnte område i kontakt med skålen indeholdende cellerne. De betragtede kemiske reaktioner er de samme som i tabel 2 ved Sakiyama

et al.

[31], bortset fra tilføjelsen af ​​helium (He) arter, der blev anvendt som buffergassen af ​​NTAPP anordning, der anvendes til dette eksperiment. Det samlede antal arter er 68, og det samlede antal reaktioner er 826.

global model anvendt i denne undersøgelse løst kontinuitet ligninger for tunge partikler arter og en energibalance ligning for elektron arter. På grund af den kvasi-neutralitet af plasma, kan elektrontæthed beregnes ud fra summen af ​​alle positive arter tæthed og subtraktion af alle negative arter tæthed. Ligningerne blev løst numerisk med en in-house-kode ved hjælp en fjerde ordens Runge-Kutta-metoden.

Statistisk analyse

Alle data er repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse af middelværdien (SEM) af mindst tre uafhængige forsøg. Vi anvendte

t

-tests at vurdere statistisk signifikante forskelle.

p

0,05 (*) og

p

. 0,01 (**) angiver statistisk signifikans sammenlignet med kontrolgruppen

Resultater

Egenskaber af designet NTAPP enhed

Vi har designet et apparat, der genererer NTAPP at eksponere leve celler. Denne NTAPP enhed er designet til at have det elektriske felt vinkelret på retningen af ​​gasstrømmen for at reducere mængden af ​​ladede partikler gennem strålen. Således genererede ROS diffundere bredt, men ladede partikler er indesluttet i plasma generation region. Den lille formatforhold jet område til det plasmavolumen resulterer også i reduceret mængde UV fotoner fra enheden. Desuden langdistance fra indretningen til cellerne og dyrkningsmediet mindske virkningerne af UV fotoner, der absorberes af baggrunden gasser og væsker meget godt. Derfor forventer vi denne enhed hovedsageligt giver ROS fra plasma sammenlignet med direkte plasma jetfly, der leverer ladede partikler direkte til målene. Figur 1 viser et skematisk billede af plasmageneratoren anvendt i dette forsøg. Indretningen er en ringformet typen dielektrisk barriere afladning (DBD) [32] er angivet for NTAPP generation under luft eller andre gasser, når højspændingsledninger sinusformet bølgeformer eller kortvarige pulser påtrykkes mellem to elektroder, hvoraf mindst en er isolerede. Den isolator forhindrer nuværende opbygning mellem elektroderne, skaber elektrisk sikker plasma uden væsentlig gas opvarmning.

(A) Skematisk beskrivelse af NTAPP frembringende enhed, der bruges til at behandle levende celler. Det dielektriske materiale svarer Teflon (polytetrafluoroethyle), og elektroden er fremstillet af kobber. (B) NTAPP genereret fra indretningen. Plasmaet massefylde er af størrelsesordenen 10

12 /cm

3, og den samlede effekt, der forbruges i plasma er 1,11 W for en spids til spids spænding på 7 kV med et input jævnspænding på 5 V. mængder af beregnede ROS arter er vist i figur S1.

Som vist i figur 1 er apparatet kombineres med en He gas-fodringssystem, en vekselstrøm leverandør, og DBD enhed dækket med plast tilfælde at reducere ROS diffusion. Han gas strømmer ind i indløbet af anordningen med en hastighed på 1 til 5 standard liter per minut (SLM), som styres af en massestrømstyring (MKP, MPR-2000). AC spænding påføres den indre elektrode af DBD enheden ved en frekvens på 11,4 kHz og en anvendt spids til spids spænding på 7 til 20 kV, som genereres under anvendelse af en transformer kredsløb bestående af ensretter dioder og bipolære power transistorer (Ramsey Electronics, PG13 plasma generator kit). DC indgangsspænding varierer fra 5 til 12 V, der er udpeget som et kontrolparameter for at ændre den anvendte spænding til DBD-enheden. For eksempel indgangsspændinger af 5, 6, og 12 V svarer til spids-til-spids udgangsspændinger på 7,5, 8,9, og 18,8 kV hhv. Den totale effekt, der forbruges i plasma er 14,11 W for spids til spids spænding på 7 kV med et input jævnspænding på 5 V, hvilket er en forudsætning for de fleste af den eksperimentelle måling.

Oplysningerne vedrørende plasma komponenter og sammensætning er nødvendig for reproducerbarhed og mekanisme NTAPP handling. Det er dog svært at måle hvert element genereres fra plasmaet enheden, især ved atmosfærisk tryk, fordi mange ROS ikke udsender lys, der kan detekteres i optisk emission spektroskopi, og massespektroskopi er også vanskeligt at bruge ved dette tryk. Global modellering er generelt bruges til analyse af NTAPP reaktionskinetik og plasma kemi under de givne driftsbetingelser [30], [31]. Derfor, for at analysere de komponenter og sammensætning af vores NTAPP enhed, anvendte vi global modellering, som er meget lig med den for Sakiyama et al. [31], bortset fra tilføjelsen af ​​He-relaterede reaktioner. Resultaterne af global modellering med variationen af ​​He molbrøk samt fugtighed, ved en fast indgangseffekt på 80 W er vist i fig S1.

I tør luft med nul fugtighed, reaktionerne tilknytning til vand er udelukket, og dermed det samlede antal arter og det samlede antal reaktioner er reduceret til 43 og 454, henholdsvis. Som Sakiyama et al. [31] viste to forskellige simulation regioner for udledning lag og neutral gas domæne, blev simulation domæner af udledning region og neutral gas region betragtes separat. Figur S1A og S1B er resultatet af udladningsområdet, og fig S1c og S1D er for den neutrale gas region kontaktes retterne. Figur S1A viser ROS densitet indersiden af ​​plasma indretningen til forskellige Han gas fraktioner, der kan styres ved at ændre gassens strømningshastighed. Fordi de tærskelværdier energi til interaktioner med ROS er lavere end dem med He, er ROS densiteter hovedsagelig bestemt af mængden af ​​luft, og de mest dominerende art inde i udladningsområdet er atomart oxygen på grund af electron impact dissociationsprocessen af ​​O

2 og O

3 [30]. De hyppigst forekommende arter er oxygenatomer, nitrogenoxid og ozon, når fraktionen blandet luft er større end 1%. Figur S1B viser virkningen af ​​fugtighed på ROS densitet for blandingen af ​​99% He, og 1% luft. Den betragtede molbrøk af vanddamp er 1%, hvilket svarer til 30% relativ fugtighed ved stuetemperatur. Ændringen i ROS tæthed ikke er signifikant med inddragelse af effekten af ​​fugt bortset fra den ekstra eksistens OH, H, H

2O

2, HNO

2, HNO

3, HO

2, og H

2. Den ROS genereret i plasma enhed diffundere ud til luften, og de er plottet i figur S1c efter diffusion tid på 0,1 ms, der blev anslået som ankomsttidspunktet af arterne fra plasma dyse til fadet. Efter diffusion processen med ROS i hele luften, de mest dominerende art er ozon i stedet for atomare ilt, og det nemt tillægger O

2 for at generere O

3. Endelig viser fig S1D viser mol antal ROS ankommer til skålen per arealenhed og tidsenhed. Det samlede antal mol kan estimeres ved at gange overfladearealet af skålen og samlede interaktion tid. For eksempel med en skål diameter på 3,5 cm og med driftstider på 30 sekunder, den samlede multiplikationsfaktoren er 289. Derfor er den maksimale mol antal ozon leveret til mediet er ca. 30 mmol. Transporten af ​​ROS indersiden af ​​flydende medier er ikke godt forstået, og er meget svært at beregne, men der er nogle referencer for reaktionshastighederne af hydratiserede elektroner og hydroxylradikaler, samt til transport proton hopping i vandig opløsning [31]. Hvis vi antager, at 10-30% af gasformige ROS leveres i flydende medier, det samlede muldvarp antal indersiden af ​​flydende intervaller 3-9 mmol.

Differential effekter af NTAPP på forskellige typer af humane celler

for at bestemme de optimale betingelser for NTAPP eksponering til at hæmme kræft celleproliferation, den indledende forsøg vurderede effekten af ​​forskellige NTAPP intensiteter på cellelevedygtighed i normale og kræftceller. Ved første, vi anvendte NTAPP med en række indgangsspænding (5-10 V) en gang til cancercellen HepG2, den normale embryoniske lunge fibroblastcellelinie WI38, og ASC’er i 1 min, hvorefter cellerne blev inkuberet i 24 timer før vi kvantificeret cellelevedygtighed ved hjælp MTT-assays. MTT assayet er til vurdering cellelevedygtighed, som afspejler antallet af levedygtige celler til stede. Øget levedygtighed tyder på, at de behandlede celler prolifererer hurtigere end kontrolcellerne. Nedsat levedygtighed betyder, at de behandlede celler prolifererer langsommere end kontrollen eller nogle af de behandlede celler undergår celledød. I dette eksperiment blev afstanden (3 cm) mellem NTAPP enheden og cellerne og gasstrømmen (5 SLM) fastgjort.

Som vist i figur S2, mens forskelle i levedygtighed ikke blev observeret mellem behandlede og ubehandlede HepG2-celler, antallet af WI38-Va13 og ASC celler lidt mere forøget end de ubehandlede kontrolceller. Disse resultater antyder, NTAPP udsættelse kan inducere forskellige fysiologiske reaktioner i ikke-kræft og kræftceller. Vi verificerede også, at ændringerne i cellelevedygtighed skyldes NTAPP eksponering og ikke af Han anvendte gas til generering NTAPP (fig S3).

Dernæst forsøger at udlede de rette NTAPP betingelser for at blokere proliferation i cancerceller men ikke i normale celler. Da HeLa-celler blev udsat for 5 V NTAPP i 30 s hver h i maksimalt 9 timer (10 gentagne NTAPP engagementer), som vist i figur 2A, den relative procentdel af levedygtige celler var lidt mindre forøget i eksponerede celler (134%) i forhold til ueksponerede kontrol celler (145%). Desuden er forskellen i de relative levedygtige celler mellem NTAPP-behandlede og ubehandlede HeLa-celler blev mere udtalt, når cellerne blev yderligere inkuberet i 15 timer efter 10 NTAPP eksponeringer: Den procentvise andel af levedygtige celler var kun 106% i celler udsat for 10 gentagne NTAPP med 15 timer yderligere inkubation, sammenlignet med 200% i ubehandlede kontrol (figur 2A). Interessant, når vi anvendte de samme betingelser for NTAPP til primær fibroblast IMR90 celler og ASC’er blev den relative antal celler augmented i NTAPP-eksponerede celler i forhold til ubehandlede kontrol (Figur 2C og E). De relative procentdele af levedygtige celler i ASC og IMR90 celler der blev udsat for NTAPP 10 gange og yderligere inkuberet i 15 timer var 178% og 168%, henholdsvis, mens den for ubehandlede celler var ca. 150% (figur 2C og E). Disse observationer antyder kraftigt, at vi ansat de rigtige NTAPP eksponeringsforhold (gentagen eksponering på 5 V input NTAPP med yderligere inkubering) til selektivt at hæmme HeLa celle proliferation og aktiverer proliferation i IMR90 celler og ASC-kontrakter.

(A-F) (A, B) HeLa, (C, D) fedtvæv-afledte stamceller (ASC) og (e, F) IMR90 celler blev udsat med 5 V indgang NTAPP i 30 s hver h til 10 gange, og cellelevedygtighed var evalueret ved hver angivne eksponering frekvens. Inkubationstiden angiver tiden efter første eksponering for NTAPP. Inkubationen prøve 24-h blev fremstillet med 10 gentagne NTAPP eksponeringer efterfulgt af yderligere inkubation i 15 timer. (A, C, E) De relative procentdele af levedygtige celler er vist at sammenligne den oprindelige celleantal før eksponering og inkubation som 100%. Levedygtige celler blev kvantificeret med MTT-assays, og data er vist som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg.

s

0,05 (*) og

s

0,01 (**) angiver signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen betingelse. (B, D, F) Af samme NTAPP-eksponerede prøver af (A), (C), (E), henholdsvis γ-H2AX, caspase-3, spaltet caspase-3, PARP, og spaltes PARP blev vurderet ved western blot-analyser. Actin er vist som en loading kontrol.

Vi derefter undersøgt, om nedsat HeLa-celleproliferation efter gentagne NTAPP eksponering skyldtes apoptose ved at overvåge spaltning af caspase-3 og dets nedstrømseffektor PARP, som begge aktiveres ved apoptose. Ved udsættelse for 10 gentagne 5 V NTAPP i 30 sek hver, spaltet caspase-3 og PARP blev detekteret i HeLa-celler, men ikke i IMR90 eller ASC celler (figur 2B). I overensstemmelse med tallene relative celle vist (figur 2A, C, og E), spaltede caspase-3 og PARP blev signifikant forhøjet ved yderligere 15 timer inkubation i HeLa-celler, men blev ikke observeret i ASC eller IMR90 celler (figur 2B, D, og F). Disse resultater viser, at NTAPP behandling inducerer apoptose i HeLa-celler, men ikke i normal ASC eller IMR90-celler. Vi bekræftede også, at gentagen NTAPP eksponering inducerer apoptose i HeLa-celler ved anvendelse af flowcytometri med Annexin-V /7AAD-farvning (fig S4).

I betragtning af at genom-ustabilitet på grund af DNA-ødelæggelse er en væsentlig årsag til apoptose, undersøgte vi hvorvidt NTAPP eksponering induceret DNA-skader i apoptotiske HeLa-celler. Phosphoryleringen af ​​histon H2AX er en af ​​de tidligste cellulære hændelser, der opstår som reaktion på DNA dobbelt-strengbrud [7]. Mens cancerceller, herunder HeLa, viser normalt lav basal γ-H2AX udtryk uden nogen stress, var det steget markant i NTAPP-eksponerede HeLa-celler (Figur 2B). Ikke overraskende blev der ikke γ-H2AX udtryk påvist i ASC eller primære IMR90 celler (figur 2D og F). Denne observation viser at NTAPP eksponering selektivt inducerer DNA-skade, der fører til HeLa celle apoptose.

Anti-proliferativ effekt af NTAPP på melanom og orale carcinomaceller

Da eksponeringen af ​​NTAPP selektivt inducerer apoptose i HeLa-celler, men ikke i den primære IMR90 eller ASC’er undersøgte vi dens virkning på andre typer af cancerceller, herunder melanom G361 og orale pladecarcinom yd-9-celler, der er afledt af kræft fundet i overfladen af ​​legemet, hvor plasma behandling kunne være let anvendelse. Som vist i figur 3A og C, 10 gentagne eksponeringer af 5 V NTAPP efterfulgt af 15 timers inkubering havde en antiproliferativ virkning på G-361 og YD-9-celler sammenlignet med ubehandlede kontrolceller. NTAPP eksponering inducerede også γ-H2AX ekspression ved DNA-beskadigelse og apoptose i G-361 og YD-9 celler (figur 3B og D). Disse resultater viser, at som i HeLa-celler, NTAPP eksponering medfører væsentlig apoptotisk celledød i melanom og orale skællede carcinomceller, hvilket antyder potentiale plasma påføring på hud og oral cancer.

(A-D) (A , B) Oral pladecarcinom yd-9 og (C, D) melanom G361 celler blev udsat med 5 V indgang NTAPP i 30 s hver h til 10 gange, og cellelevedygtighed blev evalueret ved hver angivet frekvens eksponering. Inkubationstiden angiver tiden efter første eksponering for NTAPP. Inkubationen prøve 24-h blev fremstillet med 10 gentagne NTAPP eksponeringer efterfulgt af yderligere inkubation i 15 timer. (A, C) De relative procentdele af levedygtige celler er vist at sammenligne den oprindelige celleantal før eksponering og inkubation som 100%. Levedygtige celler blev kvantificeret med MTT-assays, og data er vist som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg.

s

0,05 (*) og

s

0,01 (**) angiver signifikante forskelle i forhold til kontrolgruppen betingelse. (B, D) Af samme NTAPP-eksponerede prøver af (A) og (C), henholdsvis γ-H2AX, caspase-3, spaltet caspase-3, PARP, og spaltes PARP blev vurderet ved Western blot-analyser. Actin vises som en belastning kontrol.

Meget fortrinsret anti-proliferative effekt af NTAPP på p53-mangelfulde cancerceller

Under de samme NTAPP betingelser, dens anti-proliferativ effekt var større i HeLa-celler end i G-361 og YD-9 celler (figur 2A og 3), selv om alle celletyper sidst undergik apoptose. γ-H2AX phosphorylering og apoptose blev observeret i HeLa-celler, når 10 gentagne NATPP stimulationer blev anvendt, men dette blev kun observeret i G-361 og YD-9-celler, når celler blev yderligere inkuberet i 15 timer efter NTAPP eksponering. HeLa, G-361, og yd-9 er alle cancerceller, men kun HeLa celler mangler funktionelt p53 [33] – [35]. I betragtning af at NTAPP inducerer apoptose gennem DNA-skader, og at p53 er nøglen tumorsuppressor i afhængighed genotoksiske belastninger, postulerede vi, om tilstedeværelsen eller fraværet af funktionelt p53 i HeLa, yd-9, og G361-celler gør forskellen i antiproliferativ effekt af NTAPP.

for at demonstrere forholdet mellem p53 og følsomheden af ​​kræftceller til NTAPP, vi sammenlignede anti-proliferative effekt af NTAPP i kolorektal cancer cellelinjer HCT116 (p53

+ /+) og HCT116-E6 (p53

– /-), som begge har nøjagtig den samme genetiske baggrund bortset funktionelt p53. Når HCT116 (p53

+ /+) og HCT116-E6 (p53

– /-) modtog 10 gentagne 5 V NTAPP stimulationer efterfulgt af 15 timer yderligere inkubation samme tilstand i den tidligere NTAPP behandling, den relative procentdelen af ​​levedygtige celler blev faldet både i HCT116 (p53

+ /+) og HCT116-E6 (p53

– /-) sammenlignet med ubehandlede kontrolceller (figur 4A og B). Interessant HCT116-E6 (p53

– /-) celler viste overfølsomhed over for NTAPP sammenlignet med HCT116 (p53

+ /+); Den procentvise andel af levedygtige celler var kun 80% i HCT116-E6 og 140% i HCT116, sammenlignet med 180% i begge ubehandlede kontrolgrupper (figur 4A og B). Disse resultater stemmer overens med virkningen af ​​NTAPP observeret for HeLa, yd-9, og G361-celler og antyder kraftigt, at cancerceller uden funktionelt p53 er betydeligt mere følsomme over for NTAPP end celler, som med funktionelt p53.

(A