PLoS ONE: Nrf2 Expression reguleres af Epigenetisk Mekanismer i prostatakræft af TRAMP Mice

Abstrakt

Nuclear faktor-erythroide 2 P45-relateret faktor 2 (Nrf2) er en transskription faktor, som regulerer ekspressionen af ​​mange cytobeskyttende gener. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​Nrf2 blev undertrykt i prostata tumor i Transgene Adenokarcinom Mouse Prostata (TRAMP) mus. Tilsvarende ekspressionen af ​​Nrf2 og induktionen af ​​NQO1 var også væsentligt undertrykt i tumorigen TRAMP C1-celler, men ikke i ikke-tumorigene TRAMP C3 celler. Undersøgelse af promotorregionen af ​​muse Nrf2 genet identificeret et CpG ø, som blev methyleret ved specifikke bindingssteder for CpG i prostata TRAMP tumor og i TRAMP C1-celler, men ikke i normal prostata eller TRAMP C3-celler, som vist ved bisulfit genomisk sekventering. Reporter assays indikerede, at methylering af disse bindingssteder for CpG dramatisk inhiberede transkriptionelle aktivitet af Nrf2 promotoren. Chromatin immunopreceipitation (chip) analyser afslørede øget binding af methyl-CpG-bindende protein 2 (MBD2) og trimethyl-histon H3 (Lys9) proteiner til disse CpG steder i TRAMP C1 celler i forhold til TRAMP C3 celler. I modsætning hertil blev bindingen af ​​RNA Pol II og acetyleret histon H3 til Nrf2 promotoren faldet. Endvidere behandling af TRAMP C1 celler med DNA methyltransferase (DNMT) inhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza) og histon deacetylase (HDAC) -hæmmer Trichostatin A (TSA) genoprettede ekspression af Nrf2 samt induktion af NQO1 i TRAMP C1-celler. Taget sammen indikerer disse resultater, at ekspressionen af ​​Nrf2 undertrykkes epigenetisk ved promotor-methylering associeret med MBD2 og histon-modifikationer i prostata tumor TRAMP-mus. Vores nuværende fund afslører en ny mekanisme, som Nrf2 udtryk undertrykkes i TRAMP prostata tumor, kaste nyt lys over den rolle Nrf2 i carcinogenese og give potentielle nye retninger til påvisning og forebyggelse af prostatakræft

Henvisning.: yu S, Khor TO, Cheung KL, Li W, Wu TY, Huang Y, et al. (2010) Nrf2 Expression reguleres af Epigenetisk Mekanismer i prostatakræft af TRAMP mus. PLoS ONE 5 (1): e8579. doi: 10,1371 /journal.pone.0008579

Redaktør: Andy T. Y. Lau, University of Minnesota, USA

Modtaget: 13 september, 2009; Accepteret: December 6, 2009; Udgivet: 5 januar 2010

Copyright: © 2010 Yu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af National Institutes of Health giver R01-CA118947 og R01-094828 at A.-N. T. Kong. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

prostatacancer, såvel som mange andre aldersrelaterede kræftformer, er karakteriseret ved forøget intracellulær oxidativ stress [1], [2]. Kronisk oxidativt stress og dens tilknyttede patologiske tilstande, herunder inflammation og metaboliske forstyrrelser er blevet postuleret at drive somatiske mutationer og neoplastisk transformation, således kan spille en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer [3]. Øget oxidativt stress eller reaktive ilt arter (ROS) niveauer kunne være en følge af øget ROS generation og /eller nedsat antioxidant kapacitet og eller ROS afgiftning. For nylig nedsat antioxidantforsvarssystem i carcinogenese af prostatacancer har vundet øget opmærksomhed.

Det cellulære antioxidantforsvarssystem omfatter et batteri af antioxidant /afgiftende enzymer og proteiner, såsom superoxiddismutase (SOD), katalase, hemeoxgenase ( HO), UDP-glucuronosyltransferaser (UGT), glutathionperoxidase (GPX), glutathion-S-transferaser (GST), og NAD (P) H: quinon oxidoreduktase (NQO) [4]. Nedregulering af GST ved DNA methylering synes at være helt almindelige i human prostatacancer, at det er blevet udviklet som en diagnostisk markør [5]. Ekspressionen og aktiviteterne i SOD, er katalase og GPX blevet rapporteret at være nedsat i prostatacarcinom væv samt i plasma og erytrocytter [6] – [8]. Nylige undersøgelser fra vores laboratorium og andre har fundet, at ekspressionsniveauerne af SOD, UGT1A1, NQO1 og flere GST familie gener blev undertrykt signifikant i prostatatumorer i transgene Adenokarcinom Mouse Prostata (TRAMP) mus [9] – [11]. Selvom nedreguleringen af ​​GST-enzymer i human prostatacancer er blevet bundet til promotoren hypermethylering af GST-gener [5], [12]; promotor-DNA hypermethylering synes ikke at forårsage GST genrepression i TRAMP tumorer [9]. I stedet nedregulering af nuklear faktor-erythroide 2p45 (NF-E2) -relaterede faktor 2 (Nrf2), en central regulator af cellulære antioxidant enzymer, kan være ansvarlig for den transkriptionelle undertrykkelse af GST’er og andre fase II afgiftende enzym gener [11 ].

Nrf2 er en helix-loop-helix grundlæggende leucin-zipper transskriptionsfaktor, som regulerer ekspressionen af ​​mange fase II afgiftende og antioxidant enzymer via dens binding til antioxidanten-responselementet (ARE) i promotorregionen [ ,,,0],4]. Knockout af Nrf2 i mus ophævet væsentligt inducerbar ekspression af ARE-medieret afgiftende og antioxidant enzymer, og gjorde disse mus stærkt modtagelige for kræftfremkaldende stoffer og /eller oxidative skader [13], [14]. I disse sammenhæng tidligere har vi fundet, at proteinet ekspressionsniveauer af Nrf2 og Nrf2-målgen hemoxygenase-1 (HO-1) blev svækket i hudtumorer med musen hudkræft model [15]. Tilsvarende blev ekspressionen af ​​Nrf2 samt dens downstream target gener, såsom UGT1A1, GSTM1 og NQO1 fundet at være gradvist nedreguleret i prostatatumorer med progressionen af ​​prostata tumorigenese i TRAMP-mus [10]. Frolich et al. nylig rapporteret ekspressionen af ​​Nrf2 og GST Mu-familiens gener blev faldt betydeligt i TRAMP prostata tumor, og forbundet dette fænomen til øget oxidativt stress og DNA-skader i prostatacancer. Meta-analyse af væv udtryk profilering af data fra Oncomine database (www.oncomine.org) foreslog, at de udtryk for Nrf2 og flere GST mu gener er også gradvist nedreguleret i humane prostatakræft [11].

transkription af Nrf2 er for nylig blevet vist at være reguleret af aryl hydrocarbon receptor (AhR) og Nrf2 selv [16], [17]. Dog synes den aktuelt accepterede paradigme Nrf2 regulering, der hovedsagelig skal opnås via posttranslationelle mekanismer. Som sådan er Nrf2 funktionelt undertrykt af Kelch-lignende erythroid-celle-afledt protein med CNC homologi (ECH) associeret protein 1 (Keap1), som binder til og sekvestrerer Nrf2 i cytoplasmaet fører til nedbrydningen af ​​Nrf2, og således forhindrer Nrf2 nuklear translokation og transaktivering af sit mål gener [18]. Ved udfordringer ved oxidativ eller elektrofile spændinger, der kan indebære potentielle ændring af kritiske cysteinrester i Keap1 og eller Nrf2 selv kombineret med fosforylering af kinaser, er Nrf2 frigivet fra Keap-1, translokerer ind i kernen, dimeriserer med små MAF proteiner binder til, er og transkriptionelt aktiverer Nrf2-ER målgener [4]. Til dato er det ikke klart, hvordan ekspressionen af ​​Nrf2 i human prostatacancer eller i TRAMP musetumor undertrykkes.

Epigenetisk eller epigenomic mekanismer, navnlig DNA-methylering, er ofte blevet impliceret i de ændringer af gen ekspression i prostatacancer [19], [20]. Koordineret hypermethylering af APC og GSTP1 i begyndelsen carcinogenese er blevet anvendt som potentielle diagnostiske markører til påvisning af prostatacancer [21]. Derudover har ændringer i DNA-methylering profiler blevet forbundet med cancer progression [20]. DNA methylering, kombineret med histon modifikationer, ville påvirke samspillet mellem initiativtagerne til kritiske gener med transkriptionelle corepressorer og coactivatorer fører til ændringer i gen-udtryk, som kunne være en af ​​de drivende kræfter for prostata carcinogenese. Silencing af multiple gener ved DNA-methylering er blevet rapporteret i TRAMP prostatatumorer og cellelinier afledt fra TRAMP prostatatumorer [22] – [24]. Inhibering af DNA-methyltransferase-aktivitet ved 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza) er blevet vist at forhindre prostata tumorigenese i TRAMP-mus [25]. Desuden har ekspressionen af ​​Keap1 blevet rapporteret at være reguleret af DNA-methylering i lungecancer [26]. I den foreliggende undersøgelse, vi først identificeret et CpG ø i den opstrøms 5′-flankerende region i det murine Nrf2 genet efterfulgt af interrogation af status for methylering af DNA af hele CpG øen via bisulfit genomisk sekventering. Vi fandt, at visse bindingssteder for CpG i det distale område af CpG øen blev hypermethyleret i TRAMP tumorvæv samt i tumorigen TRAMP-C1 og C2 celler, men ikke i normale prostatavæv og ikke-tumorigene TRAMP-C3-celler. Ved hjælp methyleret reporter assay, kromatin immunofældning (chip) assay og behandlinger med Trichostatin A (TSA) /5-aza, vi forudsat overbevisende beviser for, at ekspressionen af ​​Nrf2 epigenetisk reguleres under udviklingen af ​​prostata tumorer i TRAMP-mus. Nrf2 udtryk blev undertrykt ved methylering af visse CpG sites og dette var ledsaget af ansættelse af MBD2 og trimethyl-histon H3 (Lys9) til Nrf2 genpromotoren i prostata tumor i TRAMP-mus.

Resultater

Hypermethylering af specifikke CpG steder i CpG Island i murine Nrf2 Gene

den genomiske sekvens af Nrf2 gen (NC_000068.6: 75.544.698-75.513.576 Mus musculus kromosom 2, henvises samling (C57BL /6J), herunder to kb af dets 5′-opstrøms sekvens) blev analyseret for CpG island hjælp CpG island Finder (https://people.usd.edu/~sye/cpgisland/CpGIF.htm). Da flere mRNA varianter med forskellige transcription start sites (TSS) er blevet rapporteret i litteraturen [16], [27], [28], således i den foreliggende undersøgelse definerer vi translationsinitieringsstedet (TIS) som position 1 for at undgå enhver mulig forvirring. En CpG Øen blev identificeret mellem -1175 og 1240, med et GC-indhold på 61,53%, CpG observeret /forventede forhold på 0,66 og i alt 150 CpG’er. CpG ø omfatter den murine Nrf2 promotoren, det første exon og en del af den første intron (figur 1A). Lignende resultater blev opnået ved brug af andre kriterier og algoritme (https://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx, data ikke vist). 10 sæt af bisulfit genomisk sekventering (BGS) primere blev udformet under anvendelse af BiSearch webserveren (https://bisearch.enzim.hu/, [29]) for at dække den 5′-flankerende region strækker sig fra -1226 til +844 af murine Nrf2 genet (tabel S1). Bisulfit omdannet genomisk DNA afledt fra 12 palpable prostatatumorer 24 uger gamle TRAMP mus og 10 tilsyneladende normale prostatavæv af C57BL /6J-mus blev anvendt som skabeloner. Som vist i figur 1B, selvom størstedelen af ​​CpG øen er knapt methyleret, fandtes de første 5 CpG sider for at blive hypermethyleret (96%) i prostatatumorer i forhold til tilsyneladende normale prostatavæv (4%). Repræsentative sekventering chromatografer viser de første 5 CpG’er i prostata tumor og normal prostata er vist i figur S1. Følgende 10 CpG’er der er adskilt af to CpG-free huller (-1131 til -1060 og -886 til -798) viste også differentiel methylering status i tumorer (34%) sammenlignet med normale væv (2%). Derudover anden region beliggende i den første intron synes at være tyndt CpG-methyleret i prostata tumor (4,5%).

(A) et CpG island blev identificeret i 5′-flankerende region af muse Nrf2 genet , der spænder fra position -1175 til +1240 med translationsinitieringsstedet sat som position 1. sekvenserne omfattet af bisulfit genomisk sekventering (-1226 til +844) og indeholde methylerede CpG’er er skematisk præsenteret med bindingssteder for CpG angivet med lodrette linier. (B) De mønstre for methylering og udstrækninger af bindingssteder for CpG i promotoren for Nrf2 genet i TRAMP prostata tumor og tilsyneladende normal prostata blev bestemt ved bisulfit genomisk sekventering som beskrevet i Materialer Metoder. Sorte prikker angiver methylerede CpG’er og åbne cirkler angiver ikke-methylerede CpG’er. (C) De mønstre for methylering og udstrækninger af bindingssteder for CpG i promotoren for Nrf2 genet i TRAMP C1 og C3-celler blev bestemt. De CpG’er i sekvensen mellem 296-594 vises ikke, fordi methylering er ubetydelig.

TRAMP C1, C2 og C3 cellelinjer blev stammede fra en heterogen tumor på 32-ugers TRAMP mus [30 ]. Mens TRAMP C1 og C2 celler er tumorigene når transplanteret ind syngene C57BL /6J værter, TRAMP C3 celler ikke. Genomisk DNA fra C1 og C3-celler var bisulfit sekventeret som ovenfor til påvisning status for methylering af CpG ø i Nrf2 genet. Overraskende blev de methylerede CpG “hot spots”, som findes ovenfor i TRAMP prostata tumor også methylerede i tumorigene C1 celler, men ikke i ikke-tumorigen TRAMP C3-celler (Figur 1C).

Methylering af de første 5 CpG’er undertrykte signifikant den transskriptionelle aktivitet af Mouse Nrf2 promoter

for at undersøge den funktionelle rolle af methylering af specifikke bindingssteder for CpG, især de første 5 CpG’er i CpG øen, luciferase reportere drevet af Nrf2-promotoren med eller uden de første 5 CpG’er (betegnet som -1367 og -1065, henholdsvis) blev konstrueret som beskrevet i Materialer og metoder (figur 2A). De plasmider blev methyleres hjælp M. SSSI CpG methyltransferase

in vitro

og metyleringsstatus blev bekræftet af Hpal /HhaII fordøjelse (figur S2). Som vist i fig. 2B er -1065 Nrf2 promotoren, som tidligere var blevet rapporteret [17], [28], steg betydeligt luciferaseaktiviteten til ca. 200 folder. I modsætning hertil viste -1367 Nrf2 promotor en mindre potent transkriptionel aktivitet (~67 folder). Vigtigere,

in vitro

CpG-methylering af reporterkonstruktet resulterede i et dramatisk fald af den transkriptionelle aktivitet af -1367 Nrf2 promotoren (84% reduktion); medens blev aktiviteten af ​​-1065 promotoren faldt med kun 23,4% af CpG-methylering. Lignende resultater blev opnået i Hep G2 hepatomaceller og humane embryonale nyre HEK 293-celler (Fig S3).

(A) Konstruktionen af ​​luciferase reportere er skematisk præsenteret. Nrf2 promotorer med (-1.367-1) eller uden (-1.065-1) den ekstra sekvens indeholdende de første 5 CpG’er blev amplificeret fra muse genomisk DNA og indsat i PGL 4.15 vektor. De resulterede journalister blev betegnet som PGL-1367 og PGL-1065 hhv. (B) PGL-1367 eller PGL-1065 reportere, enten methyleret CpG methyltransferase eller ej, blev co-transficeret med PGL 4.75 vektor, der indeholder en Renilla reniformis luciferase genet drevet af CMV-promotor i TRAMP C1-celler, og luciferase-aktiviteter blev målt efter 24 timer. De transskriptionelle aktiviteter af hver konstruktioner blev beregnet ved normalisering af ildflueluciferase aktiviteter med tilsvarende Renilla luciferaseaktiviteter, og er repræsenteret som folder af induktion sammenlignet med aktiviteten af ​​tomme PGL 4,15 vektor. Værdierne er gennemsnit ± SD af fire separate prøver.

hypermethyleret CpG Island var forbundet med methyl-CpG-bindende domæne (MBD2) og histon Ændringer, der er reversibel, med 5-aza /TSA behandling

undertrykkelse af genekspression ved CpG methylering opnås typisk ved MBD proteiner, der binder til denatureret DNA fører til rekruttering af kromatin remodellering og transskriptionsrepressor komplekser [31]. I den aktuelle undersøgelse blev chip assays anvendes til at undersøge de proteiner, der kunne være potentielt associeret med Nrf2 promotor i TRAMP C1 og C3-celler. Baseret på status for methylering af Nrf2-promotoren, blev primersæt designet til at dække de første 5 CpG’er og TSS at detektere association af specificerede DNA-bindende proteiner og RNA-polymerase II (Pol II). Specificiteten af ​​chip assays blev verificeret ved uspecifik IgG som ikke trække noget ned. Som en positiv kontrol, er β-actinpromotoren ligeligt forbundet med Pol II i C1 og C3 (figur 3A). Bindingen af ​​Pol II til Nrf2 genet TSS blev signifikant reduceret i C1-celler i sammenligning med i C3-celler, hvilket indikerer en undertrykt transkription af Nrf2 i C1-celler (figur 3A B). Efter aftale med denne iagttagelse, bindingen af ​​MBD2 og tri-methylerede histon 3-Lys9, (H3K9me3) til de methylerede CpG’er i Nrf2 promotor var højere i C1 celler end i C3 celler, mens sammenslutningen af ​​acetyleret histon 3 (H3Ac) vises en omvendt mønster (figur 3A B). Methyl CpG bindende protein 2 (MeCP2) og pattedyr Sin3A (mSin3A) blev også testet for deres binding med denne Nrf2 promotor; men ingen påviselig binding blev observeret (data ikke vist).

(A) chips assay blev udført for at detektere bindingen af ​​angivne proteiner til specifikke regioner af Nrf2 genet tværbundet og immunopræcipiteret fra TRAMP C1 og C3-celler. Resultaterne fra 3 uafhængige eksperimenter blev kvantificeret ved densitometri som vist i (B). (C) TRAMP C1-celler blev behandlet med vehikel, 5-aza eller 5-aza + TSA som beskrevet, hvorefter cellerne blev underkastet chip assay. Resultaterne fra 2 uafhængige eksperimenter blev kvantificeret ved densitometri som vist i (D). Chip assays blev udført som beskrevet i Materialer Metoder der bruger antistoffer mod Pol II, MBD2, H3K9m3 og AcH3. 3 sæt af chip primere blev anvendt (tabel S2), med Nrf2P1 dækker de første 5 CpG’er (-1190 til -1092) i CpG øen og Nrf2P2 dækker et område tæt på TSS (-62 til +20). Uspecifik IgG blev anvendt som en negativ kontrol og binding af Pol II til p-actin-promotoren blev anvendt til at verificere effektiviteten af ​​chip assay. Forsøgene blev gentaget mindst to gange med lignende resultater.

status methylering af DNA reguleres af DNA methyl-transferaser (DNMTs) og 5-aza er en DNMT inhibitor, anvendes ofte til at undersøge virkningen af ​​DNA methylering [32]. Som vist i figur 3C D, 5-aza behandling af C1 celler nedsætter bindingen af ​​MBD2 og H3K9me3 til Nrf2 promoteren, mens H3Ac udviser nogen observerbar effekt. Men kombineret behandling af C1 celler med 5-aza og en histon deactylase (HDAC) -hæmmer, TSA, forøger det væsentlige bindingen af ​​H3Ac til Nrf2 promotoren, og mindsker yderligere bindinger af MBD2 og H3K9me3 til Nrf2 promotoren. I overensstemmelse med ovenstående resultater, rekruttering af Pol II til Nrf2 promotor øger også tilsvarende, mens Pol IIs binding til p-actin promotor ikke blev ændret (figur 3C).

transkriptionel Induktion af Nrf2 og NQO- 1 i TRAMP cellelinier var korreleret med CpG Islands Methylering status og kunne genoprettes ved 5-aza /TSA Behandling

Vi og andre har tidligere rapporteret, at ekspressionen af ​​Nrf2 og dets målgener undertrykkes i TRAMP prostatatumorer [10], [11]. Marvis et al., Havde rapporteret, at ekspressionen af ​​GST familie gener blev undertrykt i TRAMP C2-celler og 5-aza og TSA behandling kan genoprette ekspressionen [9]. Her undersøgte vi ekspressionen af ​​Nrf2 og en af ​​dens downstream målgener NQO1 i TRAMP C1 og C3-celler. Som vist i figur 4A, mRNA-niveauet af Nrf2 er betydeligt lavere i C1-celler end i C3 celler. Ekspressionen af ​​NQO1 blev let induceret af tBHQ, en klassisk Nrf2 agonist, i C3-celler, mens en sådan induktion blev sløvet i C1-celler (figur 4A & C). Behandling af C1 celler med 5-aza og TSA beskedent restaureret Nrf2 udtryk og væsentligt forbedret induktion af NQO1 af tBHQ. Men behandlingen af ​​C3-celler under de samme betingelser udviste ingen virkning på ekspressionen af ​​Nrf2 eller NQO1 (figur 4A, B & C). Western blotting blev udført for at undersøge de protein ekspressionsniveauerne for Nrf2, NQO1, MBD2, H3Ac og H3K9me3 (figur 4D). Protein- niveauerne af Nrf2 og NQO1 var lavere i C1-celler end i C3-celler, og 5-aza og TSA behandling forbedret induktion af NQO1 protein ved tBHQ. Selvom 5-aza og TSA behandling ikke øgede basisniveauet af Nrf2 protein behandlingen signifikant forøget tBHQ-induceret Nrf2 proteinekspression. stærkt øgede TSA behandling acetyleret histon 3 protein mens havde ingen effekt på histon 3 methylering status. Interessant, selvom proteinniveauet af MBD2 ikke var påvirket af 5-aza og TSA behandling, det var meget højere i C1-celler end i C3-celler (figur 4D).

TRAMP C1 og C3-celler blev behandlet med 2 pM 5-aza, 200 nM TSA, eller 1 pM 5-aza plus 100 nM TSA i 60 timer eller 48 timer efterfulgt af inkubation i nærvær af 5 pM tBHQ for yderligere 12 timer. Efter behandlingerne blev cellerne høstet til total protein- eller RNA-ekstraktioner. (A) mRNA-niveauer af Nrf2 og NQO1 blev bestemt ved RT-PCR, med GAPDH tjente som intern kontrol, og resultaterne fra 3 uafhængige eksperimenter blev kvantificeret ved densitometri og resultaterne er vist i B og C. (D) proteinet niveauer af Nrf2, NQO1, MBD2, H3K9me3 og H3Ac blev bestemt ved Western blotting med aktin som en loading kontrol. Hvert forsøg blev gentaget mindst to gange med lignende resultater.

Diskussion

Tidligere resultater fra flere laboratorier, herunder vores laboratorium har vist, at Nrf2 spiller en væsentlig rolle i udviklingen af ​​forskellige kræftformer [ ,,,0],33]. Nrf2 regulerer ekspressionen af ​​antioxidant og fase II afgiftende enzymer herunder NQO1, HO-1 og GST [33]. Derfor vil kontrollen med transkriptionel aktivering af Nrf2 og Nrf2-målgener synes at være en vigtig homeostatiske mekanisme, der beskytter cellulære skader eller skader resulterede fra oxidativ stress [33]. Nrf2 mangel kan føre til defekt i det cellulære forsvarssystem mod oxidativ stress, hvilket kan medføre kræft initiering, promotion og progression [34]. Den undertrykte udtryk for antioxidant og afgiftende enzymer såsom GSTP1 i prostatakræft er i udstrakt grad blevet undersøgt [2], [5]. Men rollen som Nrf2 i prostatacancer har ikke fået nok opmærksomhed indtil for nylig [10], [11].

Frolich et al. rapporterede, at nedregulering af Nrf2 synes at være ansvarlig for den reducerede GST udtryk, forhøjet oxidativt stress og DNA-skader i prostata tumorigenese i TRAMP mus [11]. Vi har for nylig fundet, at ekspressionen af ​​Nrf2 samt Nrf2-målgener er gradvist nedreguleres under progression af prostatacancer hos TRAMP mus [10]. Tidligere analyse af de online humane prostata-genekspression datasæt viste, at ekspressionen af ​​Nrf2 og GST [11] samt NQO1 gradvist blev reduceret i human prostata carcinogenese (fig S4). Det er desuden blevet rapporteret, at adskillige GST gener nedreguleret i primær, men ikke i metastatiske TRAMP tumorer [9]. I aktuelle undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af ​​Nrf2 og induktionen af ​​NQO1 blev kompromitteret i tumorigen TRAMP C1-celler, men ikke i ikke-tumorigene TRAMP C3-celler (figur 4A). Denne undertrykkelse af Nrf2 udtryk og Nrf2-målgen NQO1 i begge disse TRAMP cellelinjer ville udelukke, at Nrf2 udtryk ville blive påvirket af SV40 transgen, da disse TRAMP cellelinjer ikke udtrykker SV40 transgen [30].

DNA-methylering er blevet impliceret i undertrykkelse af GSTP1-genet i human prostatacancer, og tilsvarende DNA-methylering silencing af flere andre gener er også impliceret i TRAMP prostata tumor [5], [23], [24]. Men interessant MassARRAY Kvantitativ DNA-methylering Analyser (MAQMA) analyse af 5′-området af flere GST gener viste ingen signifikante forskelle mellem normale prostata epitelceller og prostata tumor fra Vagabonden mus [9]. For nylig, flere rapporter viser, at i både TRAMP og Rb – /- prostata tumorer, en Rb /E2F-afhængig forøgelse af DNMT1 udtryk og methylering aktivitet [25], [35]. Hypermethylering Nrf2 promotoren blev udelukket under anvendelse af MSP og at 5-aza behandling havde ingen virkning på Nrf2 ekspression (med data ikke vist) [11]. Vi analyserede 5′-flankerende region i Nrf2 genet og identificeret et CpG ø, der strækker sig til position -1175 (figur 1A). Brug af bisulfit sekventering, hvilket ville være mere specifik identificere CpG-methylering og ville afsløre flere detaljer om DNA-methylering end MSP, fandt vi, at de første 5 CpG’er i CpG øen er hypermethyleret i TRAMP prostatatumorer og i tumorigene TRAMP C1-celler, men ikke i normale prostatavæv og ikke-tumorigene TRAMP C3-celler (Figur 1B). Bemærkelsesværdigt er disse 5 CpG’er placeret ved siden af ​​den tidligere rapporterede Nrf2 promotor [17]. Således forekommer status for methylering af disse specifikke CpG’er at være korreleret med tumorigeniciteten samt Nrf2 ekspression og NQO1 induktion (figur 1 og 4). Især har lignende mønster af specifik methylering af den distale CpG øen også blevet observeret i Keap1 genet i lungecancerceller [26]. Det er vigtigt at bemærke, at nogle af vores nuværende resultater ser ud til at være noget modstridende med resultaterne tidligere [11], men tidligere har konstateret omfattende nedregulering af Nrf2 og GST under prostata tumor progression i TRAMP-mus [11], er i overensstemmelse med vores nuværende resultater.

for at bestemme den funktionelle rolle af methylering af disse 5 CpG’er i undertrykkelsen af ​​Nrf2 expession blev luciferase reportere i Nrf2 promotor med eller uden disse 5 CpG’er konstrueret (figur 2A). Den Nrf2 promotor besidder meget GC-rige ikke-kanoniske promotor, der hverken indeholder TATA-boksen eller en CCAAT boks [28], men dette Nrf2-promotor kraftigt aktiverede transkriptionen af ​​luciferasereportergenet (figur 2B). Interessant vises tilsætning af-sekvenser fra -1065 til -1367 at være undertrykkende til den transkriptionelle aktivitet af Nrf2-promotoren (figur 2B). En sådan undertrykkende sekvens kunne fungere ved at rekruttere specifikke undertrykke faktorer [36], men den nøjagtige mekanisme tegner sig for denne repressive funktion af denne sekvens, selv i fravær af methylering vil kræve yderligere undersøgelser. Men når reporterne blev methyleret

in vitro

efter CpG methyltransferase, luciferase reporter aktiviteten af ​​Nrf2-promotoren med den yderligere sekvens indeholdende de 5 CpG’er (PGL-1367) blev reduceret med ca. 84%. I modsætning hertil methylering af reporteren uden den yderligere sekvens resulterede i ca. 23% reduktion (figur 2B). Dette skyldes sandsynligvis den tunge methylering af hele konstruktionen inklusive luciferasegenet (men yderligere undersøgelse ville være nødvendig for at bevise dette). Alt i alt tyder disse resultater på, at de ekstra 5 CpG’er (-1065 til -1367) kan spille en kritisk rolle ved methylering-afhængig suppression af Nrf2 promotoraktivitet.

rolle CpG-methylering i undertrykkelse Nrf2 ekspression og aktivering var testet ved behandling med 5-aza i TRAMP celler. 5-Aza er tidligere blevet vist at være i stand til at forhindre tidlig sygdomsprogression, forsinke androgen-uafhængig sygdom og forbedre overlevelsen af ​​TRAMP-mus [25], [37]. Desuden har scenen og fænotype-specifikke CpG ø metylering og DNA methyltransferase ekspression blevet godt dokumenteret under prostatakræft progression i TRAMP-mus [38], [39]. Disse offentliggjorte resultater antyder relevansen af ​​at bruge denne TRAMP system til at afhøre den mulige rolle af epigenetiske ændringer i prostata carcinogenese. 5-aza behandling af TRAMP C1 celler let øget mRNA-niveauet af Nrf2, mens kombinerede behandlinger af 5-aza og TSA inducerede en mere fremtrædende stigning på Nrf2 (figur 4A). Dette resultat er i overensstemmelse med rapporten fra Mavis et al., Hvori kombinerede 5-aza og TSA behandlinger signifikant forøget ekspression af GST-gener [9]. Proteinet niveau af Nrf2 i TRAMP C1 celler forblev upåvirket af enten 5-aza eller 5-aza /TSA behandlinger imidlertid tilsætning af en potent Nrf2-aktivator tBHQ ville øge akkumulering af Nrf2-protein (figur 4B). Som forventet induktionen af ​​NQO1 mRNA og protein niveauer viste en lignende tendens med den for Nrf2 protein. Det er meget sandsynligt, at der siden Nrf2 signalering primært reguleres via post-translationelle mekanismer, uden udfordringer med Nrf2-aktivatorer såsom tBHQ, ville Nrf2 protein hurtigt vendes ved proteosom-afhængige nedbrydning [18]. Den præcise årsag til, hvorfor tBHQ er nødvendig for NQO1 induktion ville kræve yderligere undersøgelse.

For yderligere at afgrænse den molekylære mekanisme, hvormed det specifikke CpG-methylering undertrykker Nrf2 udtryk, chip assays blev udført. Resultatet viser, at bindingen af ​​MBD2 og H3K9m3 til de specifikke CpG’er var væsentligt højere i TRAMP C1-celler end i TRAMP C3-celler korrelerer med det faktum, at de CpG’er minimalt blev methyleret i TRAMP C3-celler (figur 3A). I modsætning hertil AcH3 vises en modsat bindingsmønster til samme CpG’er sekvens i TRAMP C1-celler sammenlignet med TRAMP C3-celler, og på lignende måde bindingen af ​​Pol II til transkriptionsstartsitet viste lignende mønster som AcH3 (figur 3A). Disse methylering afhængige sammenslutninger af corepressorer kunne moduleres ved 5-aza og TSA behandlinger og vores resultater (figur 3B) korrelerede meget godt med transkriptionsniveauet af Nrf2 (mRNA-niveau) inden for disse to cellelinjer (figur 4A). MBD2 er blevet rapporteret at mediere epigenetisk inaktivering af 14-3-3σ i TRAMP C1-celler og humane LNCaP prostataceller [24], og har vist sig at være involveret i den transskriptionelle repression af GSTP1 i MCF-7 brystcancerceller [40] . MBD2 og andre MBD proteiner binder til methylerede CpG’er og rekruttere co-repressorkomplekset komplekser, som indeholder HDAC, kromatin remodeling proteiner samt andre proteiner, der fører til undertrykkelsen af ​​ekspressionen af ​​hypermethyleret gener [31]. Interessant proteinniveauet af MBD2 var meget højere i TRAMP C1-celler end i TRAMP C3-celler (figur 4A), hvilket tyder på en mulig fælles MBD2-medieret epigenetisk suppression af Nrf2 i TRAMP C1-celler. I modsætning hertil proteinniveauet af AcH3 tilsyneladende var lavere i TRAMP C1-celler end i TRAMP C3-celler, men blev forøget voldsomt af TSA behandling (figur 4D). Eftersom ekspressionen af ​​MBD2 ville være afhængige af HDAC aktiviteter, ville vores ovennævnte resultater potentielt forklare kravet om HDAC-inhibitorer for effektivt modulere corepressorer bindende og maksimalt genoprette reexpression af Nrf2 samt induktion af NQO1 i TRAMP C1-celler. Hertil kommer, når denne undertrykkende sekvens indeholdende de ekstra 5 CpG’er blev yderligere analyseret ved anvendelse af transkriptionselementer Search System (TESS, https://www.cbil.upenn.edu/tess) baseret på TRANSFAC V6.0-databasen flere transkriptionsfaktor bindingssteder blev identificeret, herunder bindingssteder for E2F1-p107 og NF-E2 (data ikke vist).