PLoS ONE: Hyppig epigenetisk inaktivering af folat-metaboliserende Gene Cystathionin-Beta-Synthase i Gastrointestinal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Både mave- og tarmkræft (CRC) er den hyppigst forekommende maligne sygdomme på verdensplan med den generelle overlevelse for patienter forbliver utilfredse. Identifikation af tumorsuppressorgener (GTS) tavshed af promotor CpG methylering afdækker mekanismer tumorigenese og identificerer nye epigenetiske biomarkører for tidlig kræft opdagelse og prognose vurdering. Cystathionin-beta-syntase (CBS) funktioner i folatmetabolismen pathway, som er uløseligt forbundet med methylering af genomisk DNA. Dysregulering af DNA methylering bidrager væsentligt til udviklingen af ​​kræft.

Metode /vigtigste resultater

For at identificere potentielle GTS tavshed af afvigende promotor methylering i CRC, vi analyserede tumor og tilstødende væv fra CRC sager ved hjælp af Illumina Menneskelig Methylation45 BeadChip. Vi identificerede hypermethylering af

CBS

gen i CRC prøver sammenlignet med tilstødende væv. Methylering og nedsat mRNA ekspression af

CBS

blev påvist i de fleste CRC cellelinier ved methylering-specifik PCR og semikvantitativ RT-PCR, samt i gastrisk cancer. Behandling med 5-aza-2′-deoxycytidin og /eller Trichostatin A omvendt methylering og restaureret

CBS

mRNA-ekspression indikerer en direkte virkning. Aberrant methylering blev yderligere påvist i 31% af de primære CRCs (29 96) og 55% af gastriske tumorer (11 af 20). I modsætning hertil blev methylering sjældent fundet i normale væv støder op til tumoren.

CBS

methylering var forbundet med

KRAS

mutationer i ubearbejdet CRC’er (

P

= 0,04, ved χ

2-test). Imidlertid blev ingen sammenhæng fundet mellem

CBS

methylering eller

KRAS

mutationer med kræft tilbagefald /metastaser i fase II CRC patienter.

Konklusion

En roman finde fra denne undersøgelse er, at den folatmetabolismen enzym

CBS

mRNA-niveauer ofte nedreguleret gennem CpG methylering af

CBS

gen i mavekræft og CRC, tyder på, at

CBS

fungerer som et tumorsuppressorgen. Disse resultater berettiger yderligere undersøgelse af

CBS

som en epigenetisk biomarkør for molekylær diagnostik af gastrointestinale kræftformer

Henvisning:. Zhao H, Li Q, Wang J, Su X, Ng KM, Qiu T, et al. (2012) Hyppig epigenetisk inaktivering af folat-metaboliserende Gene

Cystathionin-Beta-Synthase

i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 7 (11): e49683. doi: 10,1371 /journal.pone.0049683

Redaktør: Anthony WI. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Juli 27, 2012; Accepteret: 11 oktober 2012; Udgivet: November 13, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 30.801.344), Beijing Nova program (nr 2009A70) og staten Key Laboratory program (nr 2.060.204). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Både mave- og tarmkræft er de hyppigst forekommende maligniteter verdensplan, hvis forekomst er steget i de senere år [1], [2]. Selvom diverse nye behandlingsmodaliteter, herunder kirurgiske, medicinske og radiologisk er blevet indført, det kliniske forløb af gastrisk og kolorektal cancer (CRC) er variabel og den overordnede prognose fortsat utilfredsstillende. Derfor identifikation af centrale gener involveret i den molekylære patogenese mavekræft og CRC vil sandsynligvis resultere i nye og mere effektive terapeutiske strategier.

Inaktivering af flere tumorsuppressorgener (GTS) er en central molekylær begivenhed i flertrins- genetiske patogenesen af ​​CRC [3]. Foruden genetiske ændringer, epigenetisk inaktivering af GTS spiller en vigtig rolle i carcinogenese [4]. Epigenetisk inaktivering gennem afvigende methylering af CpG øer (CGI) i GTS promotorregioner forekommer i stort set alle tumortyper [4]. Især har en voksende liste af afvigende methylerede GTS blevet rapporteret i CRC’er, herunder

APC

,

MGMT

,

MLH1

,

p16

INK4a

,

VHL

,

RASSF1A

,

HIC1

,

CHFR

,

ADAMTS18

,

PCDH10

DLEC1

[5] – [10] såvel som i gastrisk kræft [11], [12]

i den foreliggende undersøgelse, vi screenet for GTS tavshed af afvigende promotor methylering i CRC. og fandt hypermethylering af

cystathionin-beta-syntase

(

CBS

) gen, der koder for et vigtigt enzym i folatmetabolismen [13], [14]. Nyligt arbejde har fokuseret på enzymer involveret i folatmetabolismen, eftersom methylering af DNA er afhængig af disse pathways [15] – [19]. Genetisk ustabilitet med karakteristiske kromosomale ubalancer er et karakteristisk træk ved carcinogenese. Homocystein og folatmetabolismen er relateret til DNA integritet, og genetiske varianter, der funktionelt påvirke homocystein og folatmetabolismen er forbundet med forskellige typer af kræft, såsom CRC, non-Hodgkins lymfom, osv [20], [21]. Formålet med det foreliggende arbejde var at undersøge, om

CBS

var en ny potentiel GTS og at teste om

CBS

mRNA ekspression blev nedreguleret ved promotor hypermethylering i CRC, samt i mavekræft. Vi undersøgte også den potentielle rolle

CBS

gen hypermethylering som biomarkør til at forudsige tumor tilbagefald eller metastaser i fase II (T

3N

0M

0) CRC patienter.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki retningslinjer for mennesker undersøgelser og blev godkendt af Institutional Review Board of Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Cams), Beijing, Kina. Underskrevet informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere for prøvetagning og analyse.

cellelinier

Fire CRC (HCT116, HT29, LoVo og SW480) og 16 gastrisk cancer (Kato III, YCC1, YCC2, YCC3, YCC6, YCC7, YCC9, YCC10, YCC11, YCC16, SNU719, AGS, MKN28, MKN45, SNU1 og SNU16) cellelinjer blev anvendt [10]. Cellelinier blev rutinemæssigt holdt i RPMI-1640 medium med 10% FBS. Den HCT116 cellelinie med genetisk knockout af DNA methyl-transferase gener

DNMT1

DNMT3B

(dobbelt knockout, HCT116

DKO) var en gave fra Dr. Bert Vogelstein, Johns Hopkins University [22] og dyrket i tilstedeværelse af 0,4 mg /ml genecitin eller 0,05 mg /ml hygromycin.

tumorprøver

Alle delprøver herunder fire parrede frisk CRC og normale væv, 96 primære formalin fast paraffin indlejrede (FFPE) CRC væv og 20 FFPE mavekræft af væv, blev opnået fra Patologisk Institut, cancer Hospital, WEBCAMS, Beijing, Kina. Hertil kommer, for methylering undersøgelse, blev analyseret tilsvarende tumor-fri margener fra 20 mavekræft og 17 CRC patienter. Alle patienter havde ikke undergå forrige kemo- eller strålebehandling, da de præsenterede med resektable tumorer. Friske prøver blev snap-frosset i flydende N

2 og efterfølgende opbevaret ved -80 ° C, indtil den forarbejdes. Diagnosen blev bekræftet gennem hematoxylin og eosin (HE) -staining og histopatologisk analyse blev udført for at definere repræsentative tumor regioner. Klinisk information var tilgængelig for alle CRC patienter, herunder køn, alder, differentiering, og opfølgende data. Den mediane alder af CRC patienter var 68 år (spændvidde 37-93), og mandlige og kvindelige forholdet var 1.4:1 (56:40). Antallet af såvel, moderat og ringe-differentieringsfaktorer tilfælde var 14, 56 og 26, henholdsvis. Kræft mellemstationer (pTNM) blev defineret i henhold til 7

th udgave af amerikansk fælles udvalg af kræft [23]. Alle CRC patienter er i stadie II (pT

3N

0M

0).

DNA og RNA ekstraktion

Total RNA og DNA blev udvundet fra cellelinjer ved hjælp af TRI Reagent (Molecular Forskningscenter). For friske tumorvæv blev frosne snit opnået og gennemgået for at sikre, at tumor indholdet var mere end 80% af afsnit område. DNA blev ekstraheret fra friske væv og FFPE prøver under anvendelse af QIAamp® DNA Mini Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner.

farmakologisk Demethylering

To gastriske cancercellelinier (YCC10 og SNU719) og en CRC (HCT116) cellelinie med tavshed

CBS

blev behandlet med 5 pM af 5-aza-2′-deoxycytidin (aza) (Sigma) i tre dage og fulgt med 100 nM trichostatin A (TSA, Cayman) for én dag som tidligere [24] beskrevne. Efter behandling, totalt DNA og RNA blev ekstraheret.

DNA methyleringsanalyse

Alle DNA-prøver blev underkastet bisulfit modifikation under anvendelse af EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research) ifølge producentens instruktioner. Et ug genomisk DNA fra hver prøve blev bisulfit konverterede og elueret i 18 pi elueringspuffer, og 5 pi af hver prøve blev analyseret med Illumina Infinium DNA-methylering under anvendelse Human Methylation45 BeadChip (Infinium Methylering 450 K, Illumina), som er en allel-specifikt assay med 480.000 CpG loci, der dækker hele genomet [25]. Protokollerne og probe information findes på www.illumina.com. Resultaterne af DNA-methylering assayet blev kompileret for hvert locus ved hjælp af Illumina Bead Studio software (Illumina) og rapporteres som beta (p) værdier, som er DNA-methylering scorer spænder fra 0 til 1, hvilket afspejler den fraktionerede DNA methylering niveau af et enkelt CpG site [25].

Semi-kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR)

RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [9], under anvendelse af

GAPDH

som kontrol. Primerne til

CBS

er angivet i tabel 1. PCR-program anvendes en indledende denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, 35 cykler (94 ° C i 30 s, 55 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s), og en endelig udvidelse ved 72 ° C i 10 min.

KRAS

Mutation Detection af Real-time PCR

De syv hotspot mutationer i codon 12 og 13 i

KRAS

gen blev undersøgt ved hjælp af menneskelige

KRAS

Mutation Kvalitativ Detection Kit (ACCB Biotech Ltd.). Fluorescerende prober blev designet til specifikt at påvise 7 forskellige punktmutationer (G12V /S /R /D /A /C og G13D). Assayet blev udført ifølge producentens protokol under anvendelse af MX3000P real-time PCR-system (Stratagene). Nærvær eller fravær af mutationer blev vurderet kvalitativt fra fluorescensen amplifikationskurven.

Bisulfit Behandling og Methylering-specifik PCR (MSP) Analyse

Bisulfit modifikation af DNA blev udført som beskrevet tidligere under anvendelse af 2,4 M natriummetabisulfit [26]. MSP blev udført som tidligere beskrevet [9]. MSP-primere er listet i tabel 1. MSP PCR primer specificitet blev bekræftet som de ikke amplificere ikke-bisulfit-behandlet genomiske DNA-templates. De MSP produkter af udvalgte prøver blev bekræftet ved direkte sekventering.

Statistisk analyse

χ

2 tests blev anvendt til at analysere mulige sammenhænge mellem kliniske parametre,

KRAS

mutation og

CBS

status for methylering af tumorprøver. Alle analyser blev udført ved hjælp af SPSS til Windows.

P

. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Identifikation af

CBS

som hypermethyleret Gene i CRC

Vi analyserede tumor og tilstødende væv fra fire kinesiske CRC sager ved hjælp af Illumina methylering array, screene for 480.000 CpG

loci

dækker hele genomet. Blandt alle bindingssteder for CpG, som blev hypermethyleret i tumorprøver (data ikke vist), fire CpG lokaliseret var i

CBS

genet (figur 1A). Analyse af den genomiske sekvens af

CBS

gen, viste, at dets formodede promotor, exon 1 og intron 1 var en typisk CGI og således modtagelige for epigenetisk inaktivering (figur 1A) [27].

En

, skematisk diagram af

CBS

promoter CpG øen (CGI), med exon 1 (sort rektangel), CpG sites (korte lodrette linier), er vist MSP region. Transkriptionsstartstedet er angivet med en buet pil. De fire CpG sites placeret i

CBS

gen region identificeret ved Illumina methylering array til betydeligt hypermethyleret i tumor sammenlignet med ikke-tumorvæv (CT /CN) er vist.

B

, Angivelse af

CBS

blev let påvises i normale væv.

C

, Expression og methylering af

CBS

i cancer cellelinjer blev undersøgt ved RT-PCR og MSP, med

GAPDH

som kontrol. M, methylerede, U, umethyleret.

Hyppig Silencing af

CBS

af Arrangøren Methylering i flere CRC og Gastric Cancer Cell Lines

Tidligere

CBS

har vist sig at være stærkt udtrykt i hjernen, samt lever, bugspytkirtel, nyre og føtale væv [13]. For yderligere at undersøge sammenhængen mellem

CBS

methylering og mRNA-ekspression, vi først undersøgt et panel af normale humane væv ved semikvantitativ RT-PCR. Vores resultater viste, at

CBS

blev udtrykt i alle normale væv, herunder kolon, rektum og mave, men i forskelligt ekspressionsniveauer. Den højeste udtryk niveau blev fundet i bugspytkirtel og åndedrætsorganerne væv (strubehoved, luftrør og lunger) mens lav ekspression var i knoglemarven væv (Figur 1B).

For at kontrast

CBS

udtryk i normal væv til maligne celler, analyserede vi gastrointestinale tumorcellelinier. Semikvantitativ RT-PCR viste, at

CBS

udtryk blev reduceret eller tavshed i 56,3% (9/16) af gastrisk kræft og 75,0% (3/4) af CRC cellelinier (figur 1C).

CBS

status methylering blev også analyseret af MSP i disse cellelinjer. Vi fandt, at cellelinjer med nedsat eller tavshed

CBS

udtryk havde methylerede initiativtagere, mens ingen methylering blev fundet i det normale

CBS

udtryk cellelinier (figur 2B) indikerer, at

CBS

promotor methylering er en vigtig mekanisme til transkriptionel dæmpning af dette gen i de fleste af de undersøgte CRC og gastrisk cancer cellelinjer.

en

, farmakologiske eller genetisk demethylering hjælp Aza med TSA inducerer

CBS

udtryk i methylerede og bragt til tavshed cellelinjer. A + T: Aza og TSA behandling.

B

, repræsentant MSP resultater af

CBS

methylering i primær gastrisk cancer (GC) og kolorektal cancer (CRC). U: MSP til umethyleret promotor, M:. MSP for methylerede promotor

Restaurering af

CBS

Expression af farmakologiske og genetiske Demethylering

For at bestemme om methylering medierer direkte faldet i

CBS

mRNA-ekspression, en methyleret CRC (HCT116) og to methylerede gastrisk cancer (YCC10 og SNU719) cellelinjer blev behandlet med Aza, en DNA methyltransferase inhibitor, og TSA. Efter behandlingen,

CBS

udtryk blev restaureret i denatureret cellelinjer sammen med en markant stigning af umethylerede promoter alleler (Figur 2A). Vi fandt også, at

CBS

kunne reaktiveres i HCT116

DKO CRC cellelinie, som er genetisk demethyleres gennem dobbelt knockout af både DNMT1 og DNMT3B. Samtidigt, umethyleret

blev opdaget CBS

alleler i Aza-behandlet og HCT116

DKO celler, hvilket indikerer, at methylering af

CBS

promotor fører direkte til sin lyddæmpning i CRC og gastrisk kræft.

Hyppige

CBS

Methylering i Primary CRC og Gastric Tumorer

Vi undersøgte forekomsten af ​​

CBS

promotor methylering i 96 primære CRC og 20 mavekræft prøver yderligere Anvendelse af MFP-analyse.

CBS

promotor methylering blev påvist i 30% af CRC (29/96) og 55% af gastriske tumorer (11 af 20), men blev sjældent findes i normal gastrisk (1/20, 5%) eller kolon væv (0/17, 0%) prøver (Figur 2B). Der var ingen signifikant sammenhæng af

CBS

methylering med køn, alder eller tumor differentiering i CRC patienter (data ikke vist). Disse resultater tyder på, at hypermethylering af

CBS

promotor er en almindelig begivenhed i CRC og gastrisk kræft.

Korrelation af

CBS

Methylering og

KRAS

Mutation i Primary CRC tumorer

Almindelige mutationer af codon 12 og 13 ved exon 2 i

KRAS

gen blev undersøgt i 96 primære CRC, hvor

CBS

methylering status var tidligere analyseret (tabel 2).

KRAS

mutation blev påvist i 45% (13/29) af

CBS

-methylated og 24% (16/67) af

CBS

-unmethylated primære CRCs indikerer en positiv korrelation mellem

CBS

methylering og

KRAS

mutationer (

P

0,05). Yderligere analyse viste ingen korrelation af

CBS

methylering og

KRAS

mutation med kræft tilbagefald /metastaser i stadie II CRC patienter (Tabel 2).

Diskussion

så vidt vi ved, er dette den første rapport til at identificere

CBS

som en methyleret kandidat TSG i gastrointestinale kræftformer. Vi viste, at

CBS

mRNA-ekspression var fraværende i flere kolorektale og gastrisk cancer cellelinjer grund promotor methylering. Desuden

CBS

genet blev ofte methyleret i CRC og gastrisk kræftpatienter, hvilket tyder på, at

CBS

fungerer som en GTS i CRC og gastrisk kræft bliver ofte inaktiveret ved methylering.

genet

CBS

, beliggende på kromosom 21q22.3, koder et vigtigt enzym involveret i transulfuration af homocystein produceret under methyl-gruppe stofskifte [27]. Især

CBS

mangel årsager forhøjede plasma methionin niveauer og faldt cystein niveauer [14], [28], som igen er kendt for at korrelere med homocystinuri, hjerte-karsygdomme og hepatocellulært carcinom [14], [21]. Den transulfuration pathway forbinder methioninmetabolisme til biosyntesen af ​​cellulære redox-kontrollerende molekyler, såsom cystein, glutathion, og taurin [18]. Cystein genereret gennem transulfuration vej bestemmer cellulære redox-kontrollerende molekyle niveauer, såsom glutathion og taurin beskytter celler mod reaktive arter-induceret skade [29] af DNA gennem basen og sukker modifikationer, base-fri sites, DNA-protein krydsbindinger og streng pauser [30], [31]. Således nedregulerede ekspression af

CBS

kan forringe produktionen af ​​glutathion således letter tumorigenese [16]. Desuden redox ubalance stimulerer proteinkinase og poly- (ADP-ribosylering) veje, der fører til inhibering af apoptose og resulterer i nekrotisk celledød, efterfulgt af inflammatoriske responser og tumorudvikling [32]. Der er nogle undersøgelser, der har evalueret sammenhængen mellem ondartet svulst modtagelighed og polymorfier i

CBS

gen (844ins68) i CRC [19], [33], men ikke i spiserøret eller mavekræft [15]. Desuden

CBS

844ins68 polymorfi er forbundet med nedsat overlevelse i hoved og hals pladecellekræft [34].

Endvidere tabet af

CBS

ekspression kan føre til ophobning af homocystein, som vil blive recirkuleret til methionin ved methionin systhase via remethyleringen pathway [14]. Som methionin virker som kilden til methylgruppen donor for DNA-methylering, dens stigning på grund af nedsat

CBS

ekspression kan dysregulate DNA-methylering. Vores resultater viste, hyppig methylering af

CBS

i gastrointestinale kræft cellelinjer og primære tumorer. Således undertrykkelsen af ​​

CBS

ved promotor-methylering, i stedet for genetiske ændringer, vil også resultere i en forstyrrelse af methyl-gruppe metabolisme og bidrage til udvikling af kræft med øget DNA-beskadigelse ved oxidativ stress, svække antioxidant kapacitet, og dysregulating DNA-methylering. Men

CBS

methylering var ikke associeret med tilbagefald i vores kohorte af patienter med stadie II CRC. Vi foreslår, at større grupper af patienter er nødvendigt at undersøge dette potentiale association med tilstrækkelig statistisk styrke.

Den prognostiske værdi af

KRAS

mutationer hos patienter med CRC stadig kontroversielt. En undersøgelse foretaget af Roth

et al.

Foreslog, at den prognostiske værdi for

KRAS

mutation status for PFS og OS manglede i patienter med stadie II og III resekterede tyktarmskræft [35]. Det er imidlertid blevet rapporteret, at stadium III patienter, der har

KRAS

mutationer viste markant dårligere sygdomsfri overlevelse sammenlignet med dem, der har vildtype

KRAS

[36]. Endnu vigtigere er, har kun få undersøgelser differentieret

KRAS

mutationer ved codon 12 fra dem ved codon 13 med hensyn til klinisk-patologiske træk og overlevelse [37] – [40]. I denne undersøgelse, kunne vi ikke identificere

KRAS

mutation status som prognostisk faktor for tilbagefald eller metastaser hos patienter med stadie II resekteres CRC. Vi fandt stedet, at

CBS

methylering var signifikant associeret med

KRAS

mutationer. Denne funktion er i tråd med en tidligere rapport, der viser, at CpG ø methylator fænotype (CIMP) er forbundet med

KRAS

mutationer [41].

Sammenfattende fremtrædende fund fra denne undersøgelse er, at

CBS

undertrykkes af promotor methylering i tyk- og gastrisk kræft. Vi fandt, at methyleringen-medieret inaktivering af

CBS kunne

vendes ved genetisk eller farmakologisk demethylering, hvilket antyder, at

CBS

fungerer som en tumorsuppressor i disse kræftformer. Den deregulering af

CBS

og dens tilknytning til en ondartet svulst fænotype er potentielt associeret til den afgørende rolle, CBS i methionin metabolisme og vedligeholdelse af intracellulære redox homeostase. Vores undersøgelse berettiger yderligere analyse af

CBS

som en epigenetisk biomarkør for molekylær diagnosticering af CRC og mavekræft.

Tak

Vi takker professorerne Qian Tao og Jing Wang for nyttige kommentarer og teknisk support og Drs Sergio Rey og Yuan Qiao for kritisk redigering for dette håndskrift. Vi takker også Dr. Bert Vogelstein for HCT116

DKO cellelinje og Dr. Keith Robertson for DNA-prøver på nogle CRC cellelinjer.