PLoS ONE: Potente antiproliferativt, Pro-apoptotiske aktivitet af Maytenus Royleanus Uddrag mod prostatakræft Celler: Evidens i in vitro og in vivo modeller

Abstrakt

Prostatakræft er en førende årsag til kræft dødsfald hos mænd. Trods intensiv investering i at forbedre tidlig diagnose, er det ofte undslipper rettidig opdagelse. Dødeligheden er fortsat høj i fremskredent stadium prostatakræft, hvor palliativ pleje er fortsat den eneste mulighed. Der er derfor behov effektive strategier for at forhindre forekomsten og udviklingen af ​​sygdommen. Planteafledte forbindelser har været en vigtig kilde til adskillige klinisk nyttige anti-cancermidler og tilbyde et attraktivt tilgang mod prostatakræft. Vi har tidligere vist, at methanol ekstrakt af Maytenus royleanus (MEM) blade og fraktioner deraf besidder betydelig antioxidant aktivitet med terapeutisk potentiale mod frie radikaler tilknyttede skader. Den foreliggende undersøgelse vurderede anti-proliferative aktivitet af MEM i prostatacancer modelsystemet. Analyse af MEM og dens forskellige fraktioner afslørede tilstedeværelsen af ​​triterpenoider, flavonoider og tanniner, konjugeret til en eller flere polære grupper og kulhydratdele. Yderligere undersøgelser mod kendte standarder godtgjort, at der kaffesyre og quercetin 3-rhamnosid i varierende koncentration i forskellige MEM fraktioner. Tidsforløbsanalyse af MEM behandlede prostatacancerceller angivet signifikant fald i cellelevedygtighed, vurderet ved MTT og klonogene overlevelse assays. Dette blev ledsaget af G2 fase anholdelse af cellecyklus, nedregulering af cyklin /cdk netværk og øget CDK-inhibitorer. MEM behandlede celler udviste spaltning af caspase-3 og PARP, og modulation af apoptotiske proteiner, oprettelse apoptose som den primære mekanisme for celledød. Navnlig MEM undertrykt AR /PSA signalering både i prostata cancer cellekulturer og i in vivo-model. Intraperitoneal injektion af MEM (1,25 og 2,5 mg /dyr) til athymiske nøgne mus implanteret med androgen følsomme CWR22Rν1 celler viste signifikant inhibering i tumorvækst og nedsat serum PSA niveauer tilbagegående in vitro-resultater. Tilsammen vores data tyder på, at MEM kan undersøges nærmere for sine potentielle terapeutiske virkninger mod prostatakræft progression hos mennesker

Henvisning:. Shabbir M, Syed DN, Lall RK, Khan MR, Mukhtar H (2015) Potent antiproliferativt, Pro-apoptotiske aktivitet af Maytenus Royleanus Uddrag mod prostatakræft Celler: Evidens i

In-vitro

In-vivo

modeller. PLoS ONE 10 (3): e0119859. doi: 10,1371 /journal.pone.0119859

Academic Redaktør: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung University, TAIWAN

Modtaget: 12. september 2014 Accepteret: 17 januar 2015; Udgivet: 23 marts 2015

Copyright: © 2015 Shabbir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. der blev leveret af National Institute of Health /National Cancer Institute RO1CA160867. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af fremskridt i diagnosticering og behandling, prostatakræft er stadig en af ​​de mest almindelige sundhedsmæssige betænkeligheder, der påvirker mænd i løbet af deres levetid. Faktisk prostatakræft er den anden hyppigste dødsårsag blandt mænd i USA og mange vestlige lande [1]. Nylige data projekt, prostata-, lunge-, og tyktarmskræft vil tegne sig for omkring halvdelen af ​​alle nydiagnosticerede kræfttilfælde hos mænd i 2014, med prostatakræft alene tegner sig for omkring 1 i 4 tilfælde [2].

androgen receptor (AR), som hører til den nukleære receptor superfamilien spiller en afgørende rolle i udviklingen, funktion og homeostase af [3] prostata. Tilstedeværelse af en ligand, såsom dihydrotestosteron (DHT) inducerer phosphorylering og konformationel ændring i AR, hvilket resulterer i dets nukleare translokation, hvor det binder til androgen responselementer på målgener og regulerer transkription. Over-ekspression af AR og opregulering af dens transkriptionsaktivitet ses ofte i fremskreden prostatacancer [4, 5]. Androgen deprivationsbehandling stadig den standard pleje til behandling af fremskreden sygdom. Trods en indledende positiv respons, næsten alle patienter uvægerligt videre til en mere aggressiv, kastrere-resistente fænotype. Undersøgelser af patientprøver viser, at AR udtrykkes i næsten alle cancere i prostata, både før og efter androgen ablation [6]. Faktisk er blevet detekteret prostataspecifikt antigen (PSA), som er kodet af en androgen-responsive gen, i de fleste hormonresistent cancere, hvilket indikerer, at AR signalvejen er stadig funktionel i disse cancere [7].

Screening for PSA, i kombination med digital rektal undersøgelse og nålebiopsi, har forbedret patienternes overlevelse ved at lette påvisning af tidlig og lokaliseret sygdom. Imidlertid kur for den avancerede og metastatisk sygdom er stadig undvigende [8]. Aktuelle medicinske behandlingsmetoder omfatter kirurgi, strålebehandling og kemoterapi, enten som monoterapi eller i multimodal tilgang [8]. Rolle kosten i human cancer har fået betydelig opmærksomhed i de sidste par årtier, og har resulteret i et paradigmeskift i vores forståelse af forebyggelse og behandling af kræft. Der er spirende tegn på, at kost, fysisk aktivitet og kropsvægt ofte betegnes energi balance faktorer er vigtige faktorer i modificering af kræft progression, og kan være forbundet med øget risiko for kræft tilbagefald [9]. På nuværende tidspunkt er forsøg, der gennemføres for at øge vores forståelse af forholdet mellem kost og prostatacancer. Optimal ernæring kan reducere forekomsten af ​​prostatacancer og kan medvirke til at reducere risikoen for dens progression. Herunder farverige, plante-baserede fødevarer og opretholde en sund vægt er blevet foreslået som vigtige ernæring strategier for prostata kræft overlevende [10]. En nylig undersøgelse viste, at prostata koncentration af lycopen lav er knyttet til udviklingen af ​​prostatakræft hos patienter med høj kvalitet prostata intraepitelialneoplasi [11]. Overholdelse af Middelhavet kost bestående af rigelige frugt, grøntsager, bælgfrugter, nødder, uraffinerede korn, olivenolie og moderate mængder fisk var forbundet med lav samlet dødelighed efter diagnosen af ​​ikke-metastatisk prostatacancer [12].

Maytenus royleanus tilhører familien Benved-familien, en stor familie, der består af cirka 100 slægter og 1300 arter, vidt udbredt i verden. Flere arter af Maytenus har været anvendt i traditionel medicin til behandling af gastrointestinale lidelser, feber, arthritis etc. [13, 14]. De biologiske aktiviteter af Maytenus arter tilskrevet tilstedeværelsen af ​​forskellige klasser af sekundære metabolitter, såsom phenoliske glucosider, flavonoider og triterpener [15]. I vores tidligere undersøgelser, viste vi, at methanol ekstrakt af Maytenus royleanus (MEM) blade og dens afledte fraktioner besad signifikant antioxidant aktivitet med terapeutisk potentiale mod frie radikaler tilknyttede skader [15]. Her har vi undersøgt virkningen af ​​MEM på prostatacancer celleproliferation og demonstrerer, at MEM hæmmer væksten og levedygtigheden af ​​både androgen følsomme og androgenuafhængig prostatacancerceller og udøver kraftig inhiberende virkning på AR /PSA signalering både i in vitro cellekulturer og i vivo tumorxenoplantater.

Materialer og metoder

Materialer

Antistoffer mod cdk2, cdk4, cdk6, cyklin B1, cyklin D1, cyclin D2, cyklin E, p27, p21, PSA, Poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bcl-2, Bax, Bak, Bcl-XL og AR blev opnået fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-muse og anti-kanin sekundært antistof peberrod per-oxidase konjugat blev opnået fra Amersham Pharmacia Life Sciences. Bio-Rad DC Protein Assay Kit blev indkøbt fra Bio-Rad, CA. Novex færdigstøbte Tris-glycin-geler blev opnået fra Invitrogen. Annexin-V-FLUOS Farvning Kit blev indkøbt fra Roche.

Fremstilling af planteekstrakt

Tørrede blade af MEM blev først pulveriseret efterfulgt af to ekstraktioner med 95% methanol. Filtreret MEM blev spraytørret og suspenderet i 50 ml destilleret vand, og fraktioner blev fremstillet i 200 ml opløsningsmidler med stigende polaritet dvs. n-hexan, ethylacetat og n-butanol. Hvert lag blev separeret under kraftig omrystning og den opløselige efterladenskaber blev anvendt som tilbageværende vandige fraktion.

phytochemical screening

[A] Væskekromatografisk massespektrometrisk analyse.

MEM blev analyseret ved LC-MS for at generere et fingeraftryk af fytokemikalier findes i planten. Tørrede prøve af MEM og dens forskellige fraktioner blev opløst i 15 mg /ml methanol. Uopløste partikler blev fjernet og 10 pi af prøven blev underkastet HILIC chromatografi i negativ ionisering og omvendt fase (RP), både i positive og negative ionisering modes at målrette flavonoider og phenoliske syrer. For HILIC adskillelse blev prøver kromatografisk løst med Phenomenex Luna HILIC, 3 um, 2x150mm kolonne på Agilent 1200 HPLC (Agilent, CA) med en auto-sampler holdt ved 5 ° C, ved hjælp af lineær gradient på 10 mM ammoniumformiat (pH = 4,5) i vand og 1 mM ammoniumformiat (pH = 4.5) i 99% acetonitril i løbet af 45 minutter. For positiv RP separation blev prøver kromatografisk løst med Agilent ZORBAX 300SB-C18, 1.8μm, 2.1x50mm kolonne på en Agilent 1200 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA) med en auto-sampler holdt ved 5 ° C, ved hjælp af lineær gradient af 0,1% myresyre i vand og 0,1% myresyre i acetonitril i løbet af 60 min. For negative RP separation blev lignende instrument setup for positiv modus anvendes som ovenfor under ændring den mobile fase til en lineær gradient af 10 mM ammoniumformiat (pH 6,5) i vand og 1 mM ammoniumformiat (pH 6,5) i 99% acetonitril i løbet af 45 minutter. Strømningshastigheden for både separations- tilstande var 250 pl /min.

[B] Højtryksvæskekromatografi (HPLC) af planteekstrakt.

250 mg af vegetabilsk pulver blev ekstraheret med 10 ml 25% HCI og 25 ml chloroform. Ekstrakten blev filtreret og fortyndet til 100 ml. 10 pi af filtrerede prøver blev injiceret i Agilent 1200 HPLC-system. Adskillelse blev udført gennem en C18-kolonne udstyret med en UV-VIS Spectra-Focus detektor, injektor og auto sampler). Trifluoreddikesyre og acetonitril blev anvendt som mobile faser med strømningshastighed på 1 ml /min. Koffeinsyre og quercetin 3-rhamnosid blev brugt som interne standarder for sammenlignende detektion indenfor MEM fraktioner. Kalibreringskurverne blev genereret for både standard forbindelser i intervallet prøvemængde (0,02-0,5 mg). Alle kørsler blev udført tre gange.

Behandling af celler

C

4-2 og CWR22Rν1 humane næsegrus carcinomaceller blev indkøbt fra ATCC (American Type Culture Collection). Begge cellelinier blev dyrket i RPMI 1640 (Life Technologies, NY) suppleret med 10% FBS og 1% penicillin /streptomycin, med 5% CO

2, ved 37 ° C. MEM opløst i DMSO blev anvendt til behandling af celler. Celler ved en konfluens på ~ 70% blev behandlet med MEM på 10-100 /ml i 24 timer i komplet celle medium, hvor den endelige koncentration af DMSO anvendt til hver behandling var mindre end 0,1% (v /v).

Cellelevedygtighed assay

3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl tetrazoliumbromide (MTT) assay blev anvendt til at undersøge virkningen af ​​MEM på levedygtigheden af ​​C

4-2, PC3, DU145 og CWR22Rν1cell linjer. Cellerne blev udpladet (1 x 10

4 celler pr brønd) i 1 ml komplet dyrkningsmedium indeholdende 10-200μg /ml koncentrationer af MEM i 24-brønds mikrotiterplader. Efter inkubation i en befugtet inkubator i 24 timer ved 37 ° C, 200 pi MTT (5 mg /ml: 1XPBS) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i to timer, hvorefter 200 pi DMSO blev tilsat. Pladerne blev derefter centrifugeret (1800 x g i 5 min ved 4 ° C). Absorbansen ved 540 nm blev registreret på en mikropladelæser. Effekten af ​​MEM på vækstinhibering blev beregnet som levedygtighed% celle, hvor DMSO-behandlede celler blev sat til 100% kontrol.

klongenicitetsassayet

Virkningen af ​​behandlingen på klonogen overlevelse prostatacancerceller blev bestemt under anvendelse kolonidannelse assayet. Både CWR22Rν1 og C

4-2 celler blev behandlet med stigende koncentrationer (20, 40 60 ug /ml) af MEM i RPMI-1640 komplet medium. Efter behandling blev cellerne genudpladet i tre eksemplarer på en 6-brønds vævsdyrkningsplade med 5000 celler /brønd og dyrket i 5% CO2 ved 37 ° C i 8 dage med vækstmedium bliver erstattet med /uden MEM hver 2 dage. Cellerne blev derefter farvet med 0,5% krystalviolet (i methanol: H

2O; 1: 1) og billeder blev taget med et digitalt kamera. Billederne blev forbedret ved hjælp af Adobe Photoshop for lysstyrke, kontrast, og skærpet for ensartethed af udseende.

Cell cyklus analyse /apoptose ved flowcytometri

CWR22Rν1 og C

4-2 celler behandlet med MEM (20-60μM: 24h) i komplet medium blev trypsinbehandlet og fikseret i 1% paraformaldehyd: 1XPBS i en time og vasket to gange med kold PBS og centrifugeret. Pelleten blev suspenderet i afkølet 70% ethanol og opbevaret natten over. Derefter blev cellerne centrifugeret i 5 min ved 1000 rpm, og den opnåede pellet blev vasket to gange med kold PBS til fjernelse af ethanol. Cellerne blev mærket med FITC og propidiumiodid under anvendelse af Apo-Direct Kit (BD Pharmagen, CA) ifølge fabrikantens protokol. Analyse blev udført med en FACScan (Becton Dickinson, NJ). Ca. 10.000 celler pr prøve blev indsamlet og DNA histogrammer blev analyseret med ModFitLT software (Sandelig Software House, ME).

Protein ekstraktion og Western blot-analyse

Efter behandling med MEM iskold lyse puffer blev tilsat til cellerne (50 nmol /liter Tris-HCI, 150 mmol /liter NaCl, 1 mmol /liter EGTA, 1 mmol /liter EDTA, 20 mmol /liter NaF, 100 mmol /liter Na3VO4, 0,5% Nonidet P-40, 1% Triton X-100, 1 mmol /liter PMSF, pH 7,4) med proteaseinhibitorer (Calbiochem, Tyskland) inkuberet over is i 20 min. Til Western blotting 8-12% poly acrylamidgeler blev anvendt til at løse 40 pg af protein, overføres til en nitrocellulosemembran, probet med passende monoklonale primære antistoffer, og påvises ved kemiluminescens autoradiografi efter inkubation med specifikke sekundære antistoffer.

genekspressionsanalyse

Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af en kommerciel RNeasy kit (Qiagen, CA) RNA-koncentrationen blev målt spektrofotometrisk ved 260 nm og cDNA blev fremstillet, ved at følge fabrikantens protokol. Reaktionsblandingen blev fremstillet indeholdende 10 gl FastStart Universal SYBR green Master (Roche, Tyskland), 6 um reverse primere, og 10 ug cDNA, med RNAase frit vand tilsat til et totalvolumen på 20 pi. Forstærkningen og real time analyse blev udført i 40 cykler med følgende faktorer; 95 ° C (10 min) for at aktivere af Fast Start Taq DNA-polymerase; 60 ° C (1 min) til amplifikation og tidstro analyse. Genekspressionen blev bestemt under anvendelse af 2

-ΔΔCT. Anvendte primersekvens var; AR Sense 5′-CTGGACACGACAACAACCAG-3 ‘; AR Antisense 5’CAGATCAGGGGCGAAGTAGA-3 ‘; GAPDH Sense 5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3; GAPDH Antisense 5’-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 ‘.

Imunofluorescence mikroskopi

C

4-2 og CWR22Rν1 celler blev podet på en to-kammer glas vævskultur slides og behandles med 40 pg /ml MEM ved 70% konfluens i 24 timer. Efter vask med PBS blev cellerne fikseret med 2% paraformaldehyd efterfulgt af permeabilisering med methanol og blokering med 2% serum. Inkubation med primære antistoffer natten over blev efterfulgt af inkubation med passende fluorofor mærkede sekundære antistoffer. Antifade DAPI (Invitrogen, NY) blev anvendt som montering og kontrafarvning medium. Til analyse blev Bio-Rad Radiance 2100 MP Rainbow system til biologisk afbildning anvendes. For at detektere apoptotiske og nekrotiske celler Annexin-V-Fluos Farvning Kit (Roche, Schweiz) blev anvendt ifølge producentens protokol. Zeiss LSM 410 konfokal mikroskopi blev anvendt til at målt fluorescens. De celler farvet med Annexin-V og ufarvede celler i et udvalgt felt blev talt at vurdere omfanget af apoptose og nekrose.

PSA ELISA

Til kvantitativ bestemmelse af PSA niveauer i C

4-2 og CWR22Rν1 celler human PSA ELISA-kit (Anogen, Ontario, Canada) blev anvendt ifølge producentens protokol.

Etisk erklæring for dyreforsøg

athymiske nøgne mus blev udført ifølge til de institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr og blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg, School of Medicine og folkesundhed, University of Wisconsin-Madison.

In vivo tumor xenograftmodel

athymiske (nu /nu) mandlige nøgne mus opnået fra NxGen Biosciences (San Diego, CA) blev huset under patogenfrie betingelser (12 timer lys /12 timer mørke skema) og fodret med en autoklaveret diæt ad libitum. Vi valgte CWR22Rν1 celler til bestemmelse af in vivo virkninger af MEM som disse celler danner hurtige og reproducerbare tumorer i nøgne mus. Implantation af CWR22Rν1 celler er også ansvarlig for sekretionen af ​​betydelige mængder af PSA i blodet strøm af værten. Tumorxenografter i mus blev etableret ved subkutan injektion af CWR22Rν1 celler (1 x 10

6) blandet med Matrigel (Collaborative Biomedical Products, MA) i et forhold på 1: 1. Atten dyr blev udvalgt tilfældigt i tre grupper bestående af seks dyr hver. Den første gruppe af dyr, der tjener som Kontrolgruppen modtog DMSO intraperitonealt (i.p.). Dyrene i gruppe 2 og 3 modtog i.p. injektion af MEM, 1,25 mg og 2,5 mg per dyr henholdsvis to gange ugentligt og i hele undersøgelsen legemsvægt, diæt, og vandforbrug blev registreret. Tumorvolumen blev beregnet ved formlen 0,5238 × L1 × L2 × H (L1 = lang diameter, L2 = korte diameter, og H = højde af tumoren) og tumorstørrelser blev målt to gange ugentligt. Dyrene blev aflivet med CO2 inhalation metode efter ARAC retningslinjer, når tumor volumen nået til ~ 1200mm

3. Blodprøver blev opsamlet ved mandibular bløder og serum separeres fra fuldblodet blev opbevaret ved -20 ° C. Serum PSA niveauer blev analyseret ved PSA ELISA kittet beskrevet ovenfor. H 0,05 blev betragtet som signifikante

Resultater

fytokemiske analyse af MEM

MEM sammen med n-hexan, butanol, ethylacetat og resterende vandige fraktioner blev adskilt ved LC-MS-analyse. Denne teknik blev primært anvendt til at danne et fingeraftryk af fytokemiske sammensætning af MEM. Ekstrakten synes at være en kompleks blanding af ukendte fytokemikalier som set i basistoppen kromatogrammet af HILIC (-ve) kromatogram (Fig. 1). Den HILIC kørsel af MEM viste tilstedeværelse af 164 forbindelser baseret på uædle toppe genereret fra molær masse og retentionstid af forbindelser (Fig 1a;. Data knyttet som S1_Dataset). Forlængede den samme dataanalyse til de andre fraktioner i HILIC (-ve) tilstand, n-butanol fraktion indeholdt 79 forbindelser, medens ethylacetat og n-hexan fraktioner viste 69 og 40 forbindelser hhv. C18 RP (-ve) kromatogram af tilbageværende vandige fraktion viste tilstedeværelsen af ​​84 forbindelser mens HILIC (-ve) viste 83 forbindelser. Baseret på den foreløbige beviser opnået fra LC-MS-data, ovenfor (fig. 1A) er skitseret, blev yderligere analyse udført for at kategorisere de indgående forbindelser med MEM, ved anvendelse af UV-diode array detektorer. Koffeinsyre og quercetin-3-rhamnosid blev identificeret ved sammenligning af deres UV og MS spektre til de tilsvarende interne standarder. UV spektre af n-hexan, ethylacetat og n-butanol fraktioner afslørede tilstedeværelsen af ​​kaffesyre og quercetin-3-rhamnosid i forskellige koncentrationer indikerer, at MEM har et højt indhold af flavonoider med kendt anti-cancer-aktivitet (figur 1B. S1 Fig ).

a. Tabel viser samlede antal forbindelser, der findes i MEM og dens forskellige fraktioner med HILIC og C18 RP-kromatografi, baseret på opholdstid og molær masse; Total ion kromatogrammer af forskellige fraktioner: ethylacetat fraktion (-ve HILIC); n-butanol fraktion (-ve HILIC); n-hexan fraktion (-ve HILIC); vandige fraktion (-ve HILIC); vandige fraktion (-ve C18 RP). b. UV kromatogrammer af ethylacetat n-hexan og n-butanol fraktioner af MEM, ved 280, 320 370 nm, med koffeinsyre og quercetin 3-rhamnosid interne standarder.

MEM hæmmer væksten og levedygtigheden af ​​prostatacancerceller

Da begge disse forbindelser er kendt for at have anti-cancer aktiviteter vi spurgte, om ekstraktet selv ville være mere effektiv til inhibering af væksten og levedygtigheden af ​​prostatacancerceller. For at undersøge anti-proliferative potentiale af MEM, udførte vi 3- (4, 5-dimethythiazol-2-yl) -2, 5-diphenyl tetrazoliumbromid (MTT) assay mod androgen-sensitive (C

4-2 og CWR22Rν1) og androgen-uafhængig (PC3 og DU-145) prostata kræftceller. Vi observerede, MEM behandling (10-180μg /ml i 24 timer og 48 timer) til prostatacancerceller forårsagede inhibering af cellevækst på en dosis-afhængig måde. Tidsforløb analyse afslørede, at der fandtes kun en beskeden forskel mellem faldet i cellelevedygtighed af celler ved 24 timer og 48 timer, hvilket antyder, at prostatacancerceller svare MEM behandling indenfor 24 timer. Som vist i (. Figur 2A), IC

50 værdier af MEM-behandlede CWR22Rν1 var 47,4 42 pg /ml; for C

4-2, 52,8 44,4 ug /ml; for PC3, 61,8 36 ug /ml; og for DU145, 90,6 88.2 mg /ml for 24 og 48 timer hhv. Dataene antydede, at androgen-sensitive C

4-2 og CWR22Rν1 celler viste lidt bedre følsomhed over MEM behandling end DU145 og PC3cells (fig. 2A). Klonogen assay yderligere valideret disse resultater, hvor CWR22Rν1 og C

4-2 celler behandlet i syv dage med MEM ved 20, 40 60 ug /ml viste en signifikant dosisafhængig inhibering af kolonidannelse i forhold til ubehandlede kontroller (Fig. 2B). De forskellige fraktioner af MEM adskilles på basis af polariteten i forskellige opløsningsmidler, såsom n-hexan, ethylacetat, n-butanol og vand blev også undersøgt for deres vækstinhiberende virkning på CWR22Rν1 celler. N-hexan og vandige fraktioner viste sig at være mere potent inhibering af proliferation af CWR22Rν1 celler (20 36μg /ml) sammenlignet med butanol og ethylacetat fraktioner (39,6 66.8μg /ml). (. Figur 2C)

a. Prostatacancerceller blev behandlet med MEM i 24 /48h, og cellelevedygtigheden blev bestemt ved MTT-assayet. Tabellen viser IC

50

CWR

22Rν1, C

4-2, PC-3 og DU 145 ved 24 og 48 timer. Middelværdi ± SD af eksperimenter udført i triplikat er vist. b. Dosisafhængig effekt af MEM på clonogenecity af

CWR

22Rν1 og C

4-2 celler som påvist af kolonidannelse assay. Detaljer er beskrevet i materielle metoder. c. Virkningen af ​​forskellige fraktioner (n-hexan, ethylacetat, n-butanol og vandige) på levedygtighed

CWR

22R ν1 celler, bestemt ved MTT-assayet. * P 0,05 og ** p. 0,01 blev betragtet som statistisk signifikant

MEM inducerer G2 fase anholdelse af prostatacancerceller

For at vurdere cellecyklus profil MEM-behandlede prostata cancerceller udførte vi flowcytometrisk analyse og observerede virkningen af ​​MEM på cellecyklusfordeling. En signifikant dosis-afhængig stigning i cellepopulationen i G2-fasen af ​​cellens cyklus blev observeret som et resultat af MEM behandling i CWR22Rν1 og C

4-2 celler. G2 fase cellecyklusfordeling for C

4-2 var 25,7%, 44.61%, 59,52% og for CWR22Rν1was 38,6%, 47.72%, og 57.72% ved 20, 40 og 60 um koncentrationer af MEM (fig 3A.; S2 fig). Stigningen i G2 fase cellepopulation blev ledsaget af en samtidig reduktion i G0 /G1 og S-fase cellepopulation. Vi undersøgte dernæst virkningen af ​​MEM på cellecyklusregulerende molekyler operative i G2-fasen af ​​cellens cyklus. Immunoblotanalyse viste, at MEM behandling til C

4-2 og CWR22Rν1 resulterede i nedsat protein udtryk for cdk’er 2, 4 6 og cycliner B1, D1, D2 E sammenlignet med de ubehandlede kontroller (Fig 3A og 3B;. S3 Fig). Dette var forbundet med mærkbar induktion af p21 og p27 i MEM behandlede celler (Fig 3D;. S3 figur).

a.

CWR

22Rν1 og C

4-2 celler behandlet med MEM i 24 timer blev farvet med propidiumiodid og analyseret ved flowcytometri. Procentdel af cellepopulationen i G2-fase af cellecyklussen, er vist i kassen af ​​hvert histogram. Middelværdi ± SD af eksperimenter udført i triplikat er vist. b-d. Effekt af MEM behandling på cellecyklus regulerende proteiner: Hele cellelysater af

CWR

22Rν1 og C

4-2 celler med /uden MEM (20-60 mg /ml: 24) blev udsat for SDS- polyacrylamidgelelektroforese. Lige belastning blev bekræftet ved Fornyet probing med GAPDH. De viste immunoblots er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

MEM inducerer apoptose gennem aktivering af indre og ydre vej

For at undersøge, om den observerede fald i cellelevedygtighed er knyttet til induktion af apoptose udførte vi Annexin farvning af MEM behandlede prostatacancerceller. Vi anvendte Annexin V tagget til FITC, der har en stærk og specifik affinitet for phosphatidylserin, overvåge dens translokation til plasmamembranen. MEM behandlede celler viste en betydelig stigning i grøn fluorescens i modsætning til ubehandlede kontroller indikerer, at behandling med MEM induceret apoptose i prostatacancerceller (S4 Fig). Flowcytometrisk analyse blev derefter udført for at kvantificere antallet af celler, som undergår apoptose som et resultat af MEM behandling. En signifikant dosis-afhængig stigning i populationen af ​​apoptotiske celler blev observeret i begge cellelinier, et resultat af MEM behandling (figur 4A;. S4 Fig). Immunoblotanalyse blev anvendt siden undersøge ekspressionen af ​​proteiner involveret i cellulær apoptose. Caspase-3, et medlem af caspase familien af ​​aspartat-specifikke cysteinproteaser spiller en central rolle i gennemførelsen af ​​den apoptotiske program. PARP-1 er en af ​​flere kendte cellulære substrater af caspaser og spaltning af PARP-1 ved Caspaser betragtes som et kendetegn for apoptose [16]. MEM behandlede celler viste forøget ekspression af aktiveret caspase-3; forbundet med PARP-spaltning (Fig 4B;. S5 Fig) endvidere validere, at apoptose er den primære mekanisme af MEM-induceret celledød. For at undersøge om MEM induceret apoptose medieres gennem aktivering af indre eller ydre reaktionsveje vi næste undersøgt ekspressionen af ​​caspaser -8 og -9 i MEM behandlede celler. Vi fandt en induktion af spaltet Caspase-8 i celler behandlet med 20, 40 og 60 ug /ml MEM (figur 4C;. S5 Fig). Samtidig fald i pro-form af Caspase-9 og Bid i CWR22Rν1 og C

4-2 celler, post MEM behandling foreslået aktivering af både ydre og indre veje for apoptose. Vi vurderede virkningen af ​​ekstrakten på Bcl-2-familien af ​​proteiner, der er involveret i apoptose. MEM behandlede celler viste en stigning i ekspressionen af ​​pro-apoptotisk Bax og Bak og et fald i ekspressionen af ​​anti-apoptotiske Bcl-2 og Bcl-X

L-proteiner (figur 4D;. S5 figur).

a.

CWR

22Rν1 og C

4-2 celler behandlet med MEM (20-60 ug /ml: 24) blev mærket med FITC og analyseres ved flowcytometri. Procentdel af apoptotiske celler med den tilsvarende dosis af MEM er vist i hvert histogram. Middelværdi ± SD af eksperimenter udført i triplikat er vist. b-d. Hele cellelysater af

CWR

22Rν1 og C

4-2 celler med /uden MEM (20-60 ug /ml: 24h) behandling blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Virkning af MEM behandling på proteiner involveret i apoptoseveje. Lige belastning blev bekræftet ved Fornyet probing med GAPDH. De viste immunoblots er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater.

aftager MEM AR og PSA-ekspression i prostatacancerceller

Androgener spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​prostatacancer og PSA, en velkendt androgen-responsive gen er i øjeblikket den mest accepterede markør for vurdering af prostatakræft progression hos mennesker [17]. Virkningen af ​​MEM behandling på AR og PSA-ekspression blev undersøgt i CWR22Rν1and C

4-2 cellelinier anvender immunoblotting og RT-PCR. Et signifikant fald i AR protein ekspression blev observeret med MEM behandling (fig 5A og 5B;. S6 Fig). Immunofluorescens-farvning af CWR22Rν1 C

4-2 celler viste fald kernelokalisering af AR i MEM-behandlede celler sammenlignet med kontrol (fig. 5B) .Den CWR22Rν1 og C

4-2 prostatacancerceller udviser høj proteinniveauer af intracellulær PSA, som fremgår af en 34-kDa PSA-båndet (fig. 5A). Den dosisafhængige virkning af MEM på CWR22Rν1 og C

4-2 celler resulterede i et signifikant fald i PSA-proteinniveauer ved 20, 40 og 60 ug /ml koncentrationer (figur 5A;. S6 Fig). Faldet i proteinekspression blev ledsaget af reduceret transkriptniveauer af AR i MEM behandlede celler (Fig 5C;. S6 Fig). Vi yderligere fastlagt de secernerede PSA niveauer i CWR22Rν1 og C

4-2 cellelinjer, beskæftiger den kvantitative sandwich ELISA-teknik. En betydelig reduktion i PSA niveauer blev bemærket i begge cellelinier med MEM (40 ug /ml) behandling (fig. 5D).

a. Hele cellelysater af

CWR

22Rν1 og C

4-2 celler med /uden MEM (20-60 ug /ml: 24) blev underkastet SDS-polyacrylamidgelelektroforese. Lige belastning blev bekræftet ved Fornyet probing med GAPDH. De viste immunoblots er repræsentative for tre uafhængige forsøg med lignende resultater. b. c. d. e. b. c. d. b. b.