PLoS ONE: Fænotypisk og Transkriptionel Fidelity af Patient-afledte Colon Cancer Xenografter i Immun-Mangelfuld Mice

Abstrakt

Xenografter af human kolorektal cancer (CRC) i immun-mangel mus har et stort potentiale for at fremskynde undersøgelsen af tumorbiologi og terapi. Vi evaluerede xenografter etableret i NOD /SCID /IL2Rγ-null mus fra de primære eller metastatiske tumorer i 27 patienter med CRC at estimere deres evne til at udvide tumorceller for

in vitro

undersøgelser og at vurdere, hvor trofast de opsummerede den transskriptionsprofilen af ​​deres parentale tumorer. RNA-seq analyse af parentale humane CRC tumorer og deres afledte xenotransplantater viste, at reproducerbare transkriptionelle ændringer karakterisere human tumor til murine xenograft overgang. I de fleste men ikke alle tilfælde blev de menneskelige stroma, kar og hæmatopoietiske elementer systematisk erstattet af murine analoger mens karcinom komponent vedholdende. Når de er etableret som xenografter, human CRC celler, der kunne formeres ved seriel transplantation forblev transkriptionelt stabil. Tre histologisk atypiske xenografter, etablerede fra patienter med peritoneale metastaser, indeholdt rigelige menneskelige stromale elementer og blodkar i tillæg til humane tumorceller. De transcriptomes af disse blandede tumor /stromale xenografter ikke ligner de af deres forældre tumorer, og forsøg på at udbrede sådanne xenografter ved seriel transplantation var forgæves. Stabil udtryk for mange gener, der tidligere er identificeret som højt prioriterede mål for immunterapi blev observeret i de fleste xenograft slægter. Afvigende ekspression i CRC celler af humane gener, som normalt kun udtrykkes i hæmatopoietiske celler blev også observeret. Vores resultater tyder på, at menneskelige CRC celler ekspanderet i murine implanteret har stor anvendelighed til studier af tumor immunbiologi og målrettede behandlingsformer såsom immunterapi, men også identificere potentielle begrænsninger

Henvisning:. Chou J, Fitzgibbon MP, Mortales C-LL, Towlerton AMH, Upton MP, Yeung RS, et al. (2013) Fænotypisk og Transkriptionel Fidelity af Patient-afledte Colon Cancer Xenografter i Immun-defekte mus. PLoS ONE 8 (11): e79874. doi: 10,1371 /journal.pone.0079874

Redaktør: Siu Tim Cheung, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget den 22. april 2013; Accepteret: September 26, 2013; Udgivet: 20. november 2013 |

Copyright: © 2013 Chou et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en postdoc stipendium i kræft immunologi fra Irvington Institut for cancer Research Institute (JC) (www.cancerresearch.org), J. Orin Edson fond for Immunterapi, en klinisk Scientist Award i Translational Research (# 1.007.475) fra Burroughs Wellcome Fund (EHW) (www.bwfund.org), et tilskud fra Department of Defense (W81XWH-12-0349) (MPF og MWM) (cdmrp.army.mil), og tilskud fra NCI /NIH: SAIC kontrakt # HHSN261200800001E (MPF og MWM), U01 CA176270 (MWM og EHW), og P30 DK56465 (til B. Torok-Storb) (www.nih.gov). De finansieringskilder havde ingen rolle i undersøgelsen design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Frisk resektion primære og metastatiske kolorektal kræft (CRC) [1], [2], ligesom mange andre typer humant hæmatologisk og faste tumorer, kan etableres som xenotransplantater i immun-deficiente mus, såsom NOD /

scid

/IL2Rγ – /- (NSG) stammen og opformeret langsigtet via seriel transplantation. CRC xenotransplantater tilvejebringe et attraktivt modelsystem til at studere tumor biologi og terapi. I modsætning til CRC cellelinjer etableret fra friske kirurgiske væv ofte mister vigtige karakteristika for deres forældres humane tumorer, når de har tilpasset sig, og er blevet opformeret i,

in vitro

kultur, patient-afledte CRC implanteret reproducere mange af de fænotypiske og genotypiske egenskaber af de parentale tumorer, hvorfra de er afledt [1] – [17]. Analyse af patient-afledt CRC xenografter har dybt avancerede vores forståelse af tumor arkitektur, heterogenitet, og andre kritiske aspekter af tumor biologi. CRC implanteret har også fremragende potentiale til brug som modelsystemer i at udforske behandling med kemoterapeutiske stoffer [9] – [13], [17] samt nye former for målrettet CRC behandling såsom immunterapi [11], [17], [18]. Derudover kan evnen til at propagere human CRC i immun-deficiente mus potentielt give en vedvarende forsyning af CRC-celler til anvendelse i

in vitro

undersøgelser. Salg

Forskelle mellem humane CRC tumorer og deres derivat xenotransplantater dog eksisterer. Mest markant er den konsekvente observation, at CRC implanteret understøttes af murine, snarere end menneske, stroma [7], [9], [15], [16]. Derfor CRC implanteret en mulighed for at vurdere transkriptomet af humane carcinomaceller adskilt fra deres støtte menneskelig stroma. Deep transkriptionel analyse af CRC xenografter kan derfor hjælpe med fortolkningen af ​​offentliggjorte transkriptionelle analyser af frisk resektion humane CRC tumorer, som repræsenterer en blanding af både menneskers stroma og karcinom [19], [20]. I hvilket omfang interaktion med murint stroma og vaskulatur påvirkninger den transkriptionelle profil af de humane tumorceller i xenograft er ikke undersøgt til dato med metoder, der tillader utvetydig diskriminering mellem humane transkripter afledt af tumorceller og murine transkripter afledt fra stroma og kar. Vi foretog derfor en omfattende undersøgelse af morfologien og transkriptionelle profiler af et panel af xenotransplantater etableret i NSG mus fra frisk resektion primære og metastatiske humane coloncancere, at evaluere fidelity, hvormed xenotransplantater opsummerede de transskriptionelle profiler og unikke molekylære karakteristika ved den parentale humane tumorer, hvorfra de blev afledt. Den transkriptionelle analyse blev udført med RNA-seq, som muliggør bestemmelse af human eller murin oprindelse af transkripter med en høj grad af sikkerhed. For at vurdere stabiliteten af ​​disse funktioner via seriel transplantation, udførte vi også detaljeret transkriptionel analyse af en xenograft afstamning, som blev etableret fra et enkelt primært human colon tumor og er efterfølgende blevet opformeret gennem ti generationer af NSG modtagere. Vi bestemt, at xenotransplantation af humane colon tumorer er kendetegnet ved reproducerbar biologisk og transkriptionelle ændringer, der karakteriserer den menneskelige til murine overgang, som i de fleste tilfælde vælge en transkriptionelt stabil tumor befolkning understøttes af murine stroma og kar. Desuden har vi identificeret gen sæt selektivt udtrykt i epitel (carcinom) eller stromale komponenter af CRC implanteret.

Materialer og metoder

Etik Statement

Kirurgiske prøver af primær eller metastatisk colorectal cancer blev indhentet fra de-identificerede donorer gennem Cooperative humant væv Network (CHTN, Vanderbilt University, Nashville, TN), eller fra forsøgspersoner, der behandles ved University of Washington (UW) Medical center (Seattle, WA), som gav skriftligt informeret samtykke i henhold til en protokol godkendt af Institutional Review Board af UW /Fred Hutchinson Cancer Research center (FHCRC) Cancer Consortium. Undersøgelse af humane prøver blev gennemført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for den pleje og anvendelse af forsøgsdyr, 8

th Edition (National Research Council, National Academies Press). Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg FHCRC. Alle operation blev udført under tribromethanol anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Transport og behandling af vævsprøver

Frisk resektion metastatisk tumor og /eller primær tumor kolorektal cancer prøver fås fra CHTN (23 unikke patienter, 24 prøver) eller lokalt (27 unikke patienter, 33 prøver) blev anbragt i et transportmedium bestående af DMEM /F12-medium (Hyclone) suppleret med 10 ug /ml ciprofloxacin (Bayer), 1% penicillin /streptomycin ( 10.000 U /ml penicillin, 10 mg /ml streptomycin) (Invitrogen), og 0,5 ug /ml amphotericin B (Invitrogen). De blev afsendt natten over på is for behandling den følgende dag (CHTN tumorer) eller transporteres inden for en time til forarbejdning på samme dag (UW tumorer). Små portioner af hver tumor blev lynfrosset eller anbragt i RNAlater (Life Technologies) og også anbragt i formalin. Den resterende del af hver tumor blev skyllet med phosphatbufret saltvand (Invitrogen), reduceres derefter til en enkelt cellesuspension via mekanisk sprængning og enzymatisk fordøjelse over 1-2 timer i DMEM /F12-baseret transport medium suppleret med 4,66 ug /ml heparin natrium (Sigma), 2% B27 supplement (Invitrogen), og 5% KnockOut Serum udskiftning (Invitrogen), 1 mg /ml Collagenase I (Sigma), 0,1 mg /ml Hyaluronidase, og 0,1 mg /ml DNase I (Worthington Biochemical) . Fordøjede celler blev vasket med enzym-frit medium og resuspenderet i 30-50 pi Matrigel (BD Biosciences) før injektion.

Primære xenotransplantater blev etableret ved injektion af enkeltcellesuspensioner (1 × 10

4-2 × 10

6 celler) fremstillet af kolorektal cancer prøver enten under nyrekapslen [21] (fra n = 14 unikke patienter) og /eller subkutant i flankerne (n = 46 patienter) af 6-12 uger gammel mand eller kvindelige subletalt γ-bestrålede (250 cGy 20 cGy /min) NSG mus rejst på Fred Hutchinson Cancer Research center. Intervallet mellem kirurgisk resektion og mus injektion var 24-30 timer for tyktarmstumorer opnået fra CHTN og 3-6 timer for tumorer opnået lokalt. Fem fordøjede tumorprøver blev beriget for CD133

+ -celler før injektion, anvendelse af magnetiske perler konjugeret til anti-CD133-antistof (Miltenyi Biotec) i henhold til fabrikantens anvisninger. Mus med gradvis forstørrelsesapparater tumorer fik lov at overleve indtil tumorerne nåede en diameter på 2 cm, de manifesterede nogen tegn på lidelse eller de opretholdt 20% vægttab, på hvilket tidspunkt de blev aflivet for tumor høst. Stykker af høstet xenograft blev straks lynfrosset eller anbragt i RNAlater, som er tilføjet i formalin til efterfølgende histologi, og anbragt i et transportmedium og forarbejdet i en måde identisk med den oprindelige human tumor for seriel transplantation i en anden NSG vært.

immunhistokemi og mikroskopi

formalinfikserede, paraffinindlejrede vævssnit fra resektion coloncancer prøver eller xenotransplantater blev fremstillet til mikroskopi ved farvning med hæmatoxylin og eosin eller med antistoffer mod human leukocyt antigen (HLA) klasse i (MBL Corporation), carcinoembryonisk antigen (CEA) (Novus), cytokeratin 20 (CK20) (Dako), Ki-67 (Dako), CD31 (Dako), epitelial celleadhæsionsmolekyle (EPCAM) (Novus), E-cadherin (Cell Marque ), programmeret Død-1 (PD1) (Cell Marque), vimentin (Dako), fibronektin (Dako), CD4 (Novacastra), CD8 (Novacastra), og CD3 (Novacastra) som pr fabrikantens anvisninger. Positive og negative kontroller blev udført for hvert antistof. Slides blev set på et Nikon E800 Eclipse mikroskop, og billeder blev erhvervet med et Olympus Magnafire SP kamera og Magnafire software (Optronics).

flowcytometri

En enkelt celle suspension fremstillet af en xenograft afledt fra D61540.T2 blev farvet med Qdot 525 nanokrystal (Invitrogen) for levende og døde celledifferentiering, fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret anti-PD-1-antistof (BD Biosciences), og phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-CTLA-4 antistof (BD Biosciences). Data blev erhvervet på et FACSCanto II flowcytometer (BD Biosciences) og analyseret med Kaluza software (Beckman Coulter).

RNA-seq Prøveforberedelse og sekventering

RNA blev ekstraheret fra prøver ved hjælp af RNeasy Plus Mini eller AllPrep RNA /DNA kits (QIAGEN). Kvaliteten af ​​RNA blev vurderet på en Agilent 2100 Bioanalyzer. Prøver med RNA integritet nummer (RIN) på over 7 blev fortyndet til 50 ng /pi til sekventering bibliotek forberedelse med TruSeq Sample Preparation Kit (Illumina). Startende med ca. 1 ug totalt RNA blev mRNA isoleret med oligo-dT capture perler, så fragmenterede og omdannes til cDNA med tilfældig hexamer-primet revers transkription og anden-streng syntese. Resulterende cDNA’er blev fragmenteret ved lydbehandling og størrelsesselekteret for molekyler af ~300 bp. Ligering af stregkodede sekventering adaptere blev derefter udført ifølge producentens anbefalinger. CDNA prøver undergik multiplex-sekventering, med en til fire prøver pr bane, på Illumina HiSeq 2000 til udbytte 50 bp parret endesekvenser. Denne proces gav mellem 54,6 M og 367,0 M sekvenser passerer standard Illumina kvalitetskontrol filtre.

Kvantitativ PCR

Kryopræserverede celler fra P2726.Ov blev behandlet med en Dead Cell Removal Kit (Miltenyi Biotec) og derefter sorteret i EPCAM

– og EPCAM

+ fraktioner med magnetiske perler konjugeret til menneskelig EPCAM-specifikt antistof (Miltenyi Biotec). RNA blev ekstraheret fra hver fraktion, og cDNA blev fremstillet under anvendelse af oligo-dT og vilkårlige hexamere primere fra den første streng cDNA-syntese kit (Roche). De 5 ‘og 3’ primere til kvantitativ PCR (qPCR) blev konstrueret under anvendelse af enten qPrimerDepot [22] eller Primer-BLAST [23] (tabel S1 i File S4). Standard SYBR Green (Roche) qPCR udført på en ABI Prism 7900HT blev anvendt til at detektere gentranskripter. De fluorescens blev analyseret i LinRegPCR [24], og den anslåede startkoncentration (N

0) af hvert gen blev normaliseret mod denne af husholdning gen

GAPDH

. Den menneskelige oprindelse af PCR amplikoner fra xenografter blev bekræftet ved dissociation kurve analyse.

RNA-seq Dataanalyse

For hver prøve alle parret læser passerer de kvalitetskrav filtre blev behandlet med TopHat splice- klar korte læse aligner [25]. For xenograft prøver, vi ansat en simpel konservativ filtrering strategi at adskille menneske læser, som følge af de indpodede humane tumorceller, fra læser forventes mus der skal udtages prøver fra at støtte murine væv. I denne strategi blev TopHat brugt til at tilpasse læser for både human (hg19) og mus (MM9) henvisning genom forsamlinger. Læser, der matchede det menneskelige genom med højere fidelity (færre mismatching baser) blev bevaret som menneske læser. De, der matchede musen genom med højere troskab blev bevaret som murine. Reads matcher begge genomer med lige troskab blev placeret i en tredje klasse “tvetydige” og ikke yderligere. For at tillade nyttig sammenligning mellem humane tumor prøver (gratis ved opførelsen i at forurene muse-sekvenser) og deraf afledte xenotransplantater, vi behandlede de humane prøver gennem samme filtrering pipeline. Færre end 0,2% af læser fra disse udelukkende humane prøver blev fejlagtigt markeret som har oprindelse i mus, hvilket tyder på, at vores filtrering strategi har en lav misklassifikation sats. Tabel 1 opsummerer sekventering udbytte, der spænder fra mindst 5 GB til over 30 GB per prøve, sammen med den procentdel af læser i hver prøve er klassificeret som mennesker, mus, eller tvetydige. er sekventering data tilgængelige i NCBI Sequence Læs Arkiv (tiltrædelse #: SRP028952).

Gene-niveau læste tællinger blev genereret fra mennesker og mus på linie læser ved hjælp af HTSeq pakken (http: //www- huber.embl.de/users/anders/HTSeq). Læs tællinger blev genereret med htseq-count script for hver mennesker og mus gen locus i en union af RefSeq og UCSC KnownGenes kollektioner forbundet med den menneskelige hg19 og MM9 forsamlinger. Læser fuldstændig indeholdt i enhver exon af et gen model blev tilskrevet dette gen. De læste tæller for hvert gen blev normaliseret ved at dividere dem med det samlede antal af læser, i millioner, opnået for at prøve.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført i R miljø for statistisk computing og Microsoft Excel. Uovervåget hierarkisk klyngeanalyse af genekspression data blev udført under anvendelse af R miljø for statistisk databehandling. Pakken edger 3.0.2 [26] blev anvendt til at identificere gener, der blev differentielt udtrykt i to eller flere prøver. Tagwise dispersioner blev beregnet for hvert gen under anvendelse af generaliseret lineær model metode, og sandsynligheden kvotientkriteriet blev beregnet mellem par af prøvesæt. Gener med falske opdagelse satser 0,05 efter Benjamini-Hochberg justering [27] for flere sammenligninger blev defineret som differentielt udtrykt. Over- eller underrepræsenterede gen sæt blandt differentielt udtrykte gener blev identificeret ved hjælp af R-pakken goseq 1.10.0 [28], med den kanoniske sti og kemiske og genetiske forstyrrelser gen sæt fra Molecular signaturer Database (MSigDB) v3.0 [29] . Wallenius ikke-central hypergeometriske fordeling blev anvendt til at tilnærme fordelingen af ​​gensæt medlemmer blandt de differentielt udtrykte gener.

tumorvækst blev fittet til ligning med fordoblingstid defineret som og goodness of fit målt ved determinantkoefficient R

2. De to-tailed Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligninger af kategoriske data mellem to grupper, mens to-tailed t-test blev anvendt til sammenligninger af kvantitative data mellem to grupper.

Resultater

Experience med Generering og plantemateriale CRC Xenografter

en fordel ved xenotransplantation er, at det potentielt giver en metode til at udbrede CRC celler på ubestemt tid og trofast replikerer den oprindelige forældrenes menneskelige tumor. Vi søgte at udvikle en protokol, mest effektivt vil opnå dette mål. Subletalt bestrålede NSG mus blev injiceret med enkeltcellesuspensioner fremstillet ud fra tumor prøver uden langvarig mellemliggende

in vitro

kultur, der potentielt kan vælge for tilpasninger ikke er til stede i den oprindelige menneskelige tumor. I alt 33 af 57 kirurgiske prøver opnået fra 27 ud af 50 individuelle patienter med enten locoregional og /eller metastaserende CRC (tabel S2 i File S4) blev etableret med succes som xenotransplantater.

Oprindeligt injektion af CRC tumorceller beriget før implantering for celler, der udtrykker det formodede CRC stamcelle markør CD133

+ blev sammenlignet med injektion af bulk, usorterede tumorceller for etablering xenotransplantater fordi førstnævnte er blevet forbundet med en højere sandsynlighed for indpodning [1], [2] . Når det er muligt, det maksimale antal CD133

+ – sorteret celler eller bulk, usorterede celler opnåelige fra en tumor blev injiceret, i en dosis på op til 2 × 10

6 celler. Selvom injektion af 1 x 10

4 CD133

+ – sorterede celler var i nogle tilfælde tilstrækkeligt til at etablere en xenograft (tabel S2 og S3 i File S4), den samlede hyppighed af transplantation for CD133

+ – sorteres celler var ikke signifikant bedre end for bulk, usorterede celler (2/5 vs. 25/45, henholdsvis). Eftersom både CD133

– og CD133

+ celler fra metastatiske CRC tumorer har potentiale til at etablere xenografter [6], og, for at fange den heterogenitet af den oprindelige menneskelige tumor så meget som muligt, at beslutningen var gjort til at bruge usorterede CRC tumorceller for xenotransplantation i alle efterfølgende eksperimenter. Vi sammenlignede også implantation af tumorceller under nyrekapslen med subkutan implantation i betragtning af offentliggjorte rapporter om høj indpodning af CRC-celler efter infra-renale kapsel injektion [1]. Når samtidige injektioner af et lige stort antal CRC celler fra den samme tumor blev foretaget i flanken og under nyrekapslen af ​​3 forskellige mus, de resulterende subkutane tumorer var langt større end dem, der er udviklet i nyrerne. Desuden blev subkutan injektion af celler i flanken forbundet med en højere sats for xenograft etablering end subkapsulær injektion (3/14 vs. 26/45,

p

= 0.03 ved tosidet Fishers eksakte test) (tabel S2 og S3 i File S4), og var forbundet med mindre sygelighed og tidlig mortalitet, med tidlige dødsfald på ≤1 uge forekommer i 14 ud af 30 mus, som modtog subkapsulære injektioner og 6 af 208 mus, der modtog subkutane implantater alene (

s

= 0,0001).

Baseret på disse indledende bemærkninger, subkutan injektion af bulk, usorterede CRC celler i flanken blev anvendt i alle efterfølgende eksperimenter for at etablere CRC xenografter. De xenografter etableret i denne måde blev retrospektivt analyseret for egenskaber, der kan være forbundet med foretrukne engraftment. Der var ingen signifikant korrelation mellem inkorporering succes og kliniske karakteristika for de patienter, hos hvem blev opnået tumorer (tabel S4 i File S4). Mand patient køn var forbundet med en tendens til overlegen engraftment (

s

= 0,06). Det gennemsnitlige antal celler injiceret i vellykket og mislykkedes engraftment forsøg var signifikant forskellig -1,2 × 10

6 (interval: 2 × 10

5-2 × 10

6) celler i succesfulde injektioner vs. 8,8 × 10

5 (interval: 1 × 10

4-2 × 10

6) i mislykkede forsøg (

s

= 0,04)

Serial xenografter blev etableret fra. 18 af 26 første generation, 11 af 14 anden generation, og 8 ud af 8 tredje generation xenografter. Nogle xenotransplantater blev ikke overført på grund af lille størrelse (≤1 mm i diameter), uventede mus død før tumor høst, eller den manglende adgang til modtagerens NSG mus. Af de 26 første generation xenografter forsøgt seriel passage for hvilke der, dem, der havde vist eksponentiel vækst viste en højere engraftment i anden generation end dem, der ikke gjorde (16/20 vs. 2/6 henholdsvis

s

= 0,05), og ingen af ​​de xenotransplantater, der ikke viste eksponentielle vækst kan med held passeret forbi den anden generation. Alle de xenograft linjer, der blev passeret over den anden generation gav betydelige tumorer 5 mm, og kunne vokse til den maksimalt tilladte tumorstørrelse på 2 cm. En primær colon tumor (D55949) og en metastatisk tumor (P2726) var begge serielt transplanteret gennem 10 generationer. Amplifikationen i human tumor celle nummer muliggjort af xenografting var i de fleste tilfælde mindst 50 gange fra den oprindelige celle dosis for hver generation, hvilket muliggør effektiv og hurtig udvidelse af CRC-celler.

Histologi af CRC tumorer og deres afledte xenografter

de fleste første generation xenografter viste variabelt glandulær morfologi med veldefinerede epitel og stromale komponenter, der ligner forældrenes humane tumorer (PHTs), hvorfra de blev afledt (figur 1 og figur S1 fig S2). Homogen ekspression af human klasse I større histokompatibilitetskompleks (MHC) molekyler blev observeret i alle CRC kirurgiske prøver evalueret i denne undersøgelse, uanset deres afledning fra primære tumorer eller af tilbagevendende /metastatiske læsioner. Ekspression af humane klasse I-MHC i første generation xenotransplantater udviste imidlertid to separate mønstre. Alle første generation xenotransplantater afledt af primære colontumorer og alle undtagen tre af sådanne afledt af tilbagevendende /metastatiske læsioner viste homogen ekspression af human klasse I MHC i de epiteliale komponenter, men fravær af ekspression i de stromale komponenter (figurerne 1 og fig S1 Fig S2 ), hvilket antyder, at stroma i disse xenotransplantater var af murin oprindelse, som er tidligere blevet beskrevet [7], [9]. Disse xenotransplantater vil blive omtalt som carcinom xenotransplantater (CXS). Derimod første generation xenotransplantater afledt fra tre forskellige patienter (P2726, P2750, og P2825) var overvejende stromal i morfologi og påviste ekspression af humane klasse I MHC i både deres epitel og stromale komponenter, hvilket viser, at stroma i disse xenotransplantater var på det mindste delvist består af humane celler (figur 1 og figur S3). Alle tre af disse patienter havde peritoneal spredning af deres sygdom. Disse stromale xenotransplantater (SxS) blev afledt fra de peritoneale metastaser af patienter P2750 og P2825 og fra den maligne ascitesvæske af patientens P2726, fra hvis æggestokkene metastase flere CX afstamninger med den typiske human tumor /murine stroma sammensætningen også blev dannet. Immunhistokemisk farvning med antistoffer specifikke for humant vimentin, en stromal protein, bekræftede tilstedeværelsen af ​​rigelige menneskelige vimentin i de tre SxS, mens farvning med humane E-cadherin-specifikke antistoffer viste, at epiteliale tumorceller omfattede en lille brøkdel af celler i disse SxS ( figur 1 og figur S3)

Hver række i (a) -. (C) omfatter mikrografier af vævssnit fra en enkelt parental human tumor eller murine xenograft. (A) Venstre kolonne: vævssnit farvet med hematoxylin og eosin (H + E). Efterfølgende søjler, fra venstre mod højre: vævssnit farvet for human leukocyt antigen klasse I (HLA-ABC), epithelial markør E-cadherin, mesenchymal markør vimentin, endotel markør PECAM1, og T-celle-markør CD3. Rækkerne, fra top til bund, viser de histologiske træk af forældrenes humane tumorer fra D61540, P2726, og P2750, parret med deres første generation xenografter. Histologi stroma-domineret xenotransplantat udviklet fra P2726 ascitesvæske er også vist i den femte række; den hvide pil i E-cadherin mikrografi i denne række angiver en lille fokus for tumorceller. Pilehoveder i PECAM1 mikrograf for P2750.Tu.X1 xenograft indikerer områder med PECAM-1-immunreaktive celler. Alle billeder blev opnået ved 200x forstørrelse. Hvid skala bar i øverste venstre mikrografi repræsenterer 200 um.

Immunhistokemi (IHC) viste også, at vaskulaturerne af CX og SxS, som med deres stromale elementer, var af divergerende oprindelse. En undergruppe af parentale humane tumorer parret med deres første generation xenotransplantater blev undersøgt for ekspression af human blodplade endotelial celle adhæsion molekyle (PECAM-1, CD31), som udtrykkes selektivt i humane endotelceller og undergrupper af hæmatopoietiske celler. Immunoreaktivitet for human PECAM-1 blev observeret i alle de PHTs, som forventet, men ikke i deres afledte CX. Begge SxS imidlertid demonstreret udtryk for menneskelig PECAM-1, selv om distribution af humane PECAM-1-immunoreaktive celler i SxS var noget uregelmæssig og ikke perfekt rekapitulere fordelingen af ​​sådanne celler, der typisk blev observeret i de PHTs ( figur 1 og figur S3). Tilstedeværelsen af ​​menneskelige stroma i SxS men dens fravær fra CX blev afspejlet af et lignende mønster af menneskelig CD3 udtryk. IHC afslørede, at CX ikke generelt indeholder celler, farvet med antistoffer mod humant CD3 og CD8, i overensstemmelse med de tab af menneskeliv infiltrere CD3

+ og CD8

+ celler fra deres afledte xenografter. Noget overraskende begge SxS imidlertid indeholdt celler, som udtrykte human CD3 og CD8 og var mest sandsynlige resterende humane T-celler, der var blevet co-injiceret med tumorcellen inokulum, fastholdt de SxS, og infiltreret xenotransplantater mere udførligt end tIL-fra PHT (figur 1 og figur S3, og data ikke vist).

de histologiske karakteristika sekundære og efterfølgende generation CX var generelt helt svarer til de af de foregående generation CX, hvorfra de blev afledt . Epitel komponent i de fleste CX slægter opretholdt robust ekspression af både EpCAM og CEA via seriel transplantation, og antallet og fordelingen af ​​celler, der udtrykker Ki-67 ligeledes forblev stabil (fig S2A). Stromaet og kar af disse CX afstamninger var konsekvent negative for ekspression af human klasse I MHC (fig S2A), hvilket antyder, at de blev stabilt understøttet af murine stroma og blodkar.

Global transkriptionelle Analyse af colorektal tumorer og xenotransplantater

RNA-seq blev anvendt til at definere den humane og for xenotransplantater, murine transkriptionelle profiler af 4 coloncancer prøver -2 primære tumorer og 2 metastatiske tumorer, 11 xenotransplantater etableret fra disse tumorprøver, og en prøve af normal kolon støder op til en af ​​de metastatiske tumorer (P2750) (Filer S1 og S2). For at vurdere reproducerbarheden af ​​RNA-seq analyse af coloncancer prøver og deres afledte xenotransplantater, sammenlignede vi transskriptionelle profiler af de to halvdele af en gennemskåret primær colon tumor fra patient D61540. Denne analyse afslørede stram korrelation (Pearson koefficient r = 0,985) mellem ekspressionsniveauerne af alle humane gener i de to halvdele af prøven (figur 2A). Der blev observeret en tilsvarende stram korrelation (r = 0,975) mellem de transkriptionelle profiler af de synkront resektion, men ikke-sammenhængende æggestokkene og oment metastaser fra patient P2726 (figur 2A).

Scatter plots viser de normaliserede udskrift tæller (i tællinger per million) for individuelle menneskelige gener i de to prøver, der er angivet på

x

– og

y

-axes. Røde kors angiver konsensus husholdning gener [50]. Ikke-husholdningsgener er angivet med violet cirkler eller gule trekanter: violette cirkler repræsenterer gener udtrykt på et eller andet niveau i begge prøver, og gule trekanter langs akserne repræsenterer gener udtrykt i en enkelt prøve, men ikke den anden. Den Pearson korrelationskoefficient på tværs af alle gener for hver parvise sammenligning er angivet i sort over det øverste venstre hjørne af hver parcel; korrelationen for undergruppen af ​​housekeeping-gener er indikeret med rødt. Den diagonale linje er de punkter, for hvilke x = y. (A) Sammenligninger af ekspressionsniveauet af humane gener i de to halvdele af gennemskåret colorektal tumor fra D61540 (venstre felt) og i ovarie- og oment metastaser fra P2726 (højre panel). (B) Sammenligninger af udtrykket niveau af menneskelige gener i tre forældre humane tumorer (D61540.T2, P2726.Ov, og P2750.Tu, fra venstre til højre) og i deres første generation xenografter (D61540.T2.X1, P2726 .Ov.X1, og P2750.Tu.X1). (C) Sammenligning af de humane gen ekspressionsniveauerne i atypiske stroma-fremherskende xenograft etableret fra P2750 og i sin første generation xenograft. (D) Mean vækst kinetik CX (n = 5) afledt af æggestokkene og oment metastaser af P2726 (P2726.Mets.X1) er angivet med sorte diamanter forbundet med den fede linie, sammenlignet med væksten kinetik SX afledt ascitesvæsken af ​​P2726 (P2726.As.X1) angivet ved de grå firkanter forbundet med den grå linje. Alle xenotransplantater blev oprettet ved injektion 2 × 10

6 celler i flanken af ​​en NSG mus. Tabel S1. Tabel S2. Tabel S3. Tabel S4. Tabel S5.