PLoS ONE: Analyse af Alpha-2 makroglobulin fra langlivede og kræft-Resistant Naked Mole-Rat og human Plasma

Abstrakt

Baggrund

Den nøgne muldvarp-rotte (NMR) er en langlivede og kræft resistente arter. Identifikation af potentielle anti-cancer og alder relaterede mekanismer er af stor interesse og gør denne art fremtrædende at undersøge anti-cancer strategier og forstå aldrende mekanismer. Da det er kendt, at NMR udtrykker højere lever-mRNA-niveauer af alfa-2-makroglobulin end mus, er intet kendt om dens struktur, funktionalitet eller ekspressionsniveauet i NMR sammenlignet med de menneskelige A2M.

Resultater

Her viser vi en omfattende analyse af NMR- og humant plasma-A2M, viser en anden forudsigelse i glycosyleringen af ​​NMR-A2M, hvilket resulterer i en højere molekylvægt sammenlignet med human A2M. Derudover fandt vi en højere koncentration af A2M (8,3 ± 0,44 mg /ml

vs

. Og 4,4 ± 0,20 mg /ml) og en lavere total plasma proteinindhold (38,7 ± 1,79 mg /ml

vs

. 61,7 ± 3,20 mg /ml) i NMR sammenlignet med human. NMR-A2M kan transformeres ved methylamin og trypsin resulterer i en konformationel ændring ligner humant A2M. NMR-A2M er påviseligt ved et polyklonalt antistof mod human A2M. Bestemmelse af tryptisk og anti-tryptiske aktivitet af NMR og humant plasma viste en højere anti-tryptisk aktivitet af NMR plasma. På den anden side blev mindre proteolytisk aktivitet, der findes i NMR plasma sammenlignet med humant plasma.

Konklusion

Vi fandt transformeret NMR-A2M binding til dens specifikke receptor LRP1. Vi kunne påvise lavere protein ekspression af LRP1 i NMR levervæv sammenlignet med human men højere ekspression af A2M. Dette var ledsaget af en højere EpCAM proteinekspression som central adhæsionsmolekyle i kræft progression. NMR-plasma var i stand til at forøge adhæsion i human fibroblast

in vitro

sandsynligvis ved at øge CD29-proteinekspression. Dette er den første rapport, der viser ligheder samt tydelige forskelle mellem A2M i NMR og humant plasma. Dette kan være direkte forbundet med den spændende fænotype af NMR og foreslår, at A2M formentlig kunne spille en vigtig rolle i anti-cancer og anti-aging mekanismer i NMR

Henvisning:. Thieme R, Kurz S, Kolb M, Debebe T, Holtze S, Morhart M, et al. (2015) Analyse af Alpha-2 makroglobulin fra langlivede og kræft-Resistant Naked Mole-Rat og humant plasma. PLoS ONE 10 (6): e0130470. doi: 10,1371 /journal.pone.0130470

Academic Redaktør: Klaus Roemer, University of Saarland Medical School, TYSKLAND

Modtaget: Marts 10, 2015; Accepteret: 20 maj 2015; Udgivet: 23 juni 2015

Copyright: © 2015 Thieme et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Europäischer Sozialfond – ESF www.esf.de (100098250) til GB.. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Leibniz Association (SAW 2012) www.leibniz-gemeinschaft.de/til MP

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Den nøgne muldvarp-rotte (

Heterocephalus glaber

) (NMR) bor i Østafrika er en eusocial koloni bygning pattedyr (O’Rianin et al. 2008 Økologi for Social Evolution). Derved eusociality meste ses med insekter som myrer, bier, hvepse og andre, NMR er et af de sjældne kendte eusocial pattedyr-navnlig beskrevet indtil videre kun i familien

Bathyergidae

. NMR har et par usædvanlige egenskaber i forhold til andre pattedyr. NMR er en meget langlivet gnavere, som har en levetid på over 30 år [1]. Dette tyder på specifikke aging mekanismer, som er ledsaget eller potentielt er forårsaget af kræft modstand. Hidtil blev ingen tumor nogensinde observeret i NMR [2]. Der er stærke beviser for, at levetiden af ​​NMR primært vedligeholdes af kræft modstand, fordi neoplasi er den primære dødsårsag i andre pattedyrarter som mus [3]. Der er en spirende interesse for at bringe på linje levetiden og kræft modstand ved at identificere de underliggende molekylære mekanismer til at forstå de mest fascinerende og ekstraordinære NMR fænotyper.

Tidligere havde en håndfuld artikler offentliggjort, hvilket giver hints og forsøg at forklare disse mekanismer i NMR [4-8]. Derved sociale og biologiske /biokemiske funktioner er adduceret. Fra et socialt synspunkt eusocial tilstand af livet med en kooperativ pleje af afkommet og mellem generationerne udbredelse af færdigheder [2] samt at leve i en gruppe er almindeligt forbundet med en længere levetid [9]. En anden sundhed understøttende virkning er forbundet med det underjordiske liv. De dyr beskyttes mod ekstreme klimaforhold og rovdyr, som begunstiger levetiden og en lavere dødelighed [2, 10]. På det cellulære og biokemiske niveau NMR udviser flere unikke anti-tumor funktioner som langsom cellulær vækst, effektiv kontakt hæmning, dannelse af høj-molekylære-mass hyaluronan og optimeret proteinsyntese [11].

Alpha-2 makroglobulin ( A2M) er et stort ekstracellulært protein i blodet. For nylig blev A2M transkriptniveauer vist at forøges i NMR leveren sammenlignet med mus ved 140-fold [12]. Hidtil er NMR-A2M proteinet ikke yderligere karakteriseret. Dens menneskelige modstykke er en homotetramere protein på 720 kDa spille en rolle i at opretholde homøostase af cytokiner og vækstfaktorer [13]. Funktionen af ​​A2M hos mennesker er delvist anderledes i forhold til gnavere (fx mus, rotter og kaniner), hvor A2M er en stor akutfaseprotein [14]. Generelt er A2Ms fra forskellige arter meget godt beskrevet og kort kendetegnet ved en gennemgang af Sottrup-Jensen [15]. Human A2M er i stand til at binde en meget bred vifte af cytokiner, vækstfaktorer, især TGF-SS1, TNF-alfa og IL-1SS og hormoner [16-18]. En anden vigtig funktion er evnen til at inaktivere et stort udvalg af proteinaser, som trypsin, chymotrypsin, elastase eller metalloproteinaser. Ved binding af proteinaser, A2M gennemgår en gennemgribende konformationel ændring, som resulterer i ekspression af tidligere skjulte receptor bindingssteder på dens overflade. Dette muliggør den såkaldte “transformeret A2M” (A2M *) til at binde til dens specifikke receptor, opkaldt LRP1 (CD91) [19, 20]. Ligering af LRP1 inducerer receptormedieret hurtig clearance af A2M-proteinase-komplekser fra blod og væv [21]. Andre proteiner, såsom vækstfaktorer og cytokiner er bundet reversibelt til A2M. Derved A2M opfylder vigtige funktioner med hensyn til vævshomeostase af de molekyler [22, 23].

A2M foreslås at spille en vigtig rolle i cancer og aldring [24, 25]. A2M koncentrationen humant blod er negativt korreleret med alder, faldende fra ca. 4 mg /ml ved fødslen til 1,5 mg /ml i den ældre [26]. Derfor dens funktion i blod homeostase og aldersrelaterede sygdomme er af stor klinisk og geriatriske interesse. Vigtige faktorer er ansvarlige for malignitet involverer også sammenvoksninger molekyler. Da det er kendt, at NMR er kræft resistente, de er af skadelig interesse og en dybere analyse af adhæsionsmolekyleekspression og funktion i NMR er berettiget. For eksempel blev fundet udskrift niveau epitelial adhæsionsmolekyle EpCAM øges i NMR leveren ved 290fold forhold til mus, som giver stærke beviser, at celle sammenhæng og integritet påvirkes af ekspression af adhæsionsmolekyler [12].

i den foreliggende undersøgelse, analyserede vi plasma A2M fra NMR i forhold til dens humane homolog. For første gang kunne vi vise en forhøjet plasmaprotein niveau af NMR-A2M og ligheder samt tydelige forskelle i den molekylære struktur og funktion i forhold til humant A2M. Endvidere har vi overraskende fundet NMR plasma at øge celleadhæsion i humane fibroblaster. Derudover har vi beskrevet og kommenteret i NMR-A2M herom til den menneske-A2M protein med post-translationelle modifikationer og kunne identificere ligheder og forskelle, som kunne spille en rolle i NMR-relaterede særheder.

Resultater

i silico sekvens analyser

Søgning efter NMR-A2M sekvenser i de relevante databaser resulterede i to tilgængelige mRNA sekvenser. Den første (Ref.Seq .: NM_001279851.1; UniProt: E3VX34_HETGA) blev beskrevet af Szafranski et al. (Database entry) og en anden var forudsagt ved genomisk sekventering af NMR-genomet (GenBank: JH171302.1; UniProt: G5BPM1_HETGA) [27]. Kun udskrift af NMR-A2M var blevet kontrolleret og beskrevet hidtil. Eksistensen af ​​NMR-A2M protein blev kun forudsagt. Sekvensen af ​​NMR-A2M gav 1475 (UniProt: E3VX34_HETGA) og 1595 [27] aminosyrer, hvilket resulterer i en beregnet molekylmasse på 162,519 kDa og 175,364 kDa. Sammenligning af disse resultater med den humane A2M sekvens, NMR-sekvensen beskrevet af Szafranski et al. (2010) er mere ens end Kim et al. (2011). Derfor blev alle følgende analyser udført med den mere ligner NMR-A2M sekvens sammenlignet med det humane on (UniProt: E3VX34). (Tabel 1)

NMR-A2M har en samlet mRNA identitet på 85% og en lighed for proteinsekvensen af ​​98% til humant A2M. Fylogenetisk analyse ved ClustalW2 resulterede i et tæt forhold af NMR-A2M til Ansells mol rotte og marsvin A2M (figur 1).

Den humane A2M samt NMR-A2M har en signalering peptidsekvens (AA position 1-23) ved N-terminalen, som blev kommenteret af lighed. Lokkemaden region, som er kendetegnende for A2M i alle arter, er placeret i NMR i position 688 til 738. Den indeholder tre trypsin spaltningssteder ved arginin er 703, 711 og 729 (tabel 2). Analysen af ​​N-glycosyleringssteder resulterede i 10 potentielle N-glycosylerede aminosyrer i position 55, 70, 263, 396, 410, 870, 992, 1078, 1367 og 1427. Derved NMR-A2M aktier 7 N -glycosylation sites med den menneskelige A2M, som har otte forudsagt N-glycosyleringssteder. Den N-glycosyleringssted ved position 247 af den humane A2M ikke er til stede i NMR-A2M. Alle disulfidbroer i den menneskelige A2M er identificeret i NMR-A2M af lighed (tabel 2). Den potentielle iso-glutamyl lysin isopeptide tværbinder i position 693 i den humane A2M kunne findes i NMR-A2M i den respektive position 694 (tabel 2). Den Cys972 og Gln975 ansvarlig for thiolester bindende i menneskets A2M er placeret ved position Cys973 og Gln976 i NMR-A2M

fylogenetisk analyse af A2M proteinsekvenser blev udført ved hjælp af ClustalW2 onlinetool (https:. //Www .ebi.ac.uk /Værktøj /fylogeni /clustalw2phylogeny). De sammenlignede A2M proteinsekvenser var udlæsning fra UniProt databasen.

Plasma sammensætning

Forskellige variationer af polyacrylamid gel elektroforese (PAGE) blev udført for at undersøge protein fordeling af NMR plasma i almindelighed og tilstedeværelsen af ​​karakteristiske træk ved NMR-A2M i særdeleshed.

Native polyacrylamid gradient-gelelektroforese (nativ PAGE) viste NMR-A2M at køre ved en position vises at have en lavere elektrisk mobilitet end A2M i humant plasma og renset human A2M, hvilket kunne tyde på en højere molekylmasse (fig 2A). Nativ human A2M er en tetramer med en molekylmasse på 720 kDa. Brug SDS-gradient PAGE (4-20%) under ikke-reducerede betingelser NMR-A2M flytter som en dimer med en omtrentlig molekylmasse ligner humant A2M (360 kDa) (Fig 2B). Under reducerede betingelser NMR-A2M spaltes til monomerer af 180 kDa svarende til human A2M (Fig 2C). Endvidere blev den samlede NMR plasmaproteinkoncentration sig at være lavere end i menneskelig (38,7 ± 1,79 mg /ml

vs

61,7 ± 3,20 mg /ml;. N = 5) (Fig 2D). Humant plasma synes at indeholde et højere indhold af immunoglobuliner (figur 2a og 2b) og den overordnede protein mønster synes at være anderledes, også. NMR i modsætning til humant plasma viser forskellige proteinbånd (afstanden mellem Alb og IgG) i ikke-reduceret SDS-PAGE (mellem markør 43 kDa og 212 kDa). I det mindste i humant plasma, haptoglobin- og Gc-gruppe protein genetiske varianter flytte ved denne position. Ikke desto mindre en samlet analyse af de tre forskellige typer af elektroforese viste stærkere båndintensiteter af A2M i NMR plasma sammenlignet med humant plasma, hvilket indikerer et højere A2M indhold i NMR.

NMR, humant plasma (30 ug) og renset human A2M (2,5 ug) blev separeret ved nativ PAGE (4-20%) (A) og SDS-PAGE (4-20%) under ikke-reducerende (B) og reducerende betingelser (C). Proteinkoncentrationen af ​​NMR og humant plasma blev bestemt ifølge Bradford (** – p 0,01) (D). Proteinekstrakter fra human og NMR leveren (20 ug hver) blev separeret ved SDS-PAGE (4-20%) (E) og underkastet western blot-analyse under anvendelse af et polyklonalt kanin-anti-humant A2M antistof (5 ug /ml) og en monoklonalt muse ß-underenhed specifikt anti-human LRP1 antistof (10 ug /ml) (F). (A2M -alfa-2 makroglobulin, Alb-albumin, IgG-immunglobulin, TRF-transferrin).

Den mest udbredte protein i NMR plasma er albumin ligesom i humant plasma. Transferrin med en molekylmasse på 80 kDa i mennesker var mindre vandrende i NMR, der angiver forskellige molære masser eller variationer i glycosylering.

Protein og immunoblotanalyse af lever ekstrakter fra NMR og mennesker afslørede et stort antal lav molekylmasse proteiner til begge arter. En bemærkelsesværdig forskel er fremkomsten af ​​en højmolekylære proteinarter i NMR lever (fig 2E). Dette proteinbånd viste sig at reagere med antistoffer mod human A2M ved Western blot (Fig 2F), der viser en højere A2M proteinmængden i NMR leverekstrakt end hos mennesker. I modsætning hertil blev en mindre mængde immunoreaktiv LRP1 påvist i NMR leveren ekstrakt sammenlignet med human (Fig 2E).

A2M aktivering

A2M vides at forekomme i to forskellige konformationelle tilstande. Binding af proteinaser, resulterer i en konformationel ændring i retning af en mere kompakt struktur af proteinet.

In vitro

, sådan konformationel overgang A2M kan også opnås ved behandling af A2M med methylamin, som vides at spalte A2M s thioesterbinding og dermed udløser en større konformationsændring ligner proteinase behandling. Den konformationelle ændring kan fremkaldes ved såkaldt rate PAGE (Fig 3A). Denne metode giver diskrimination af de to forskellige former for A2M, den langsom (native form) og den hurtige migrerende (aktiveret form med det spaltede thioesterbinding) formen, som siges at være forårsaget på grund af ændringer i globularity [28]. Binding af trypsin samt omsætning med methylamin udviste tilsvarende bevægende mønster, afhængigt af, at det konformationsændring, i begge, NMR og humant plasma. Generelt blev A2M fra NMR vist sig at være reaktiv over for methylamin og trypsin hvilket viser samme funktionelle egenskaber som dens humane analog. den konformationelle konvertibilitet synes dog at være mere kompleks i NMR-A2M angivet ved fremkomsten af ​​proteinbånd mellem positionerne af de langsomme og hurtige former for menneskelig A2M.

RATE elektroforese blev udført under anvendelse af 50 ug nativt NMR og humant plasma og 50 ug methylamin og trypsin behandlede plasma hhv. Isoleret humant A2M tjente som kontrol. Methylamin samt trypsin shift menneske og NMR-A2M fra langsom til hurtig bevægelse formular. At visualisere de respektive proteinbånd blev gelen farvet med Commassie (A). Oprenset LRP1 (100-500 ng) blev spottet til en nitrocellulosemembran og inkuberet med enten 10 ug /ml human eller NMR-plasma. BSA tjente som negativ kontrol. A2M binding til LRP1 blev påvist ved et polyklonalt kanin-anti-humant A2M antistof (5 ug /ml) (B). Til at blokere bindingen af ​​A2M at LRP1 den plettede LRP1 blev præinkuberet med 1,5 uM RAP i 30 min før tilsætning af humant eller NMR-plasma (C). (☐ – native /langsom form for A2M, ◆ transformerede /hurtig form for A2M).

Receptor binding af A2M fra NMR og humant plasma

Menneskelig A2M * (forvandlet A2M ) vides at binde specifikt til opløselig eller immobiliseret LRP1. For at oprenset human LRP1 blev spottet til en nitrocellulosemembran og inkuberes med humant eller NMR-plasma, (fig 3B). Som det ses, A2M * fra begge arter binder til det immobiliserede receptor indikerer tilstedeværelsen af ​​receptor-bindende domæner i NMR-A2M. I modsætning hertil ingen binding blev observeret til immobiliseret albumin der bekræfter specificitet interaktion. Receptor associeret protein-RAP vides at blokere binding af forskellige ligander til LRP1. Faktisk RAP fandtes at formindske interaktionen af ​​NMR-A2M * til LRP1 (fig 3C). Resultaterne indikerer, at A2M fra NMR indeholder konserverede region ved C-terminale domæne kan binde til human LRP1.

A2M kvantificering og immunologisk påvisning

A 7% SDS-PAGE blev anvendt til at evaluere koncentrationen af ​​A2M i plasma fra NMR og menneske. Oprenset human A2M tjente som intern standard. De Coommassie blå farvede geler blev scannet og analyseret under anvendelse ImageJ software. 30 ug NMR og humant plasmaprotein henholdsvis blev fyldt til gelerne. Generering af en standardkurve med oprenset humant A2M, koncentrationen beregnes A2M i NMR og humant plasma var 8,3 ± 0,44 mg /ml og 4,4 ± 0,20 mg /mL (n = 5). Tilsvarende A2M betegner 6,9 ± 0,37% af det samlede plasmaprotein hos mennesker og 15,3 ± 0,70% af det samlede plasmaprotein i NMR (Fig 4A). Desuden blev immunreaktiviteten af ​​NMR-A2M kontrolleres med en konformation specifikt monoklonalt muse-anti-humant A2M antistof (a-1), kendt for at genkende en rumlig C-terminal epitop kun udsættes i transformerede A2M (Fig 4B) og et polyklonalt kanin anti-humant A2M antistof (fig 4C). Til afprøvning af monoklonalt antistof, blev prøverne kørt obligatorisk i native gradientgeler før blotting, fordi SDS er kendt for at modificere den rumlige struktur A2M. Som det ses, det monoklonale antistof detekteret transformerede humane A2M (A2M *), men ingen reaktivitet blev observeret mod NMR-A2M (Fig 4B). På den anden side, det polyklonale kanin-antistof forventeligt detekteret menneskelige såvel NMR-A2M (Fig 4C), sidstnævnte med naturligvis lavere reaktivitet fordi tilnærmelsesvis 3fold mængden af ​​NMR-A2M fra plasma er nødvendig for at få en sammenlignelig immunologisk signalintensitet som med human A2M (fig 4C). Disse resultater bekræfter de opnåede data ved densitometrisk analyse af farvede proteinbånd (Fig 4A).

Bestemmelsen af ​​A2M i plasmaprøver blev udført ved elektroforese i 7% SDS-gel under anvendelse af NMR og humant plasma, 30 ug hver og renset humant A2M (1-2,5 ug). A2M blev kvantificeret ved Commassie-farvning under anvendelse af isoleret human A2M til fremstilling af en kalibreringskurve (A). Western blot-analyser under anvendelse af en nativ gradient PAGE (4-20%) blev påført for at detektere den transformerede form af A2M under anvendelse af alfa-1-antistof (B) og en 7% ikke-reducerende SDS-PAGE til påvisning A2M med et polyklonalt antistof ved hjælp af 9 og 3 ug NMR eller 3 ug humant plasma og 250 ng isoleret humant A2M (C).

Anti-proteolytisk og proteolytiske aktivitet af humant og NMR plasma

plasma af alle pattedyr og sandsynligvis NMR indeholder forskellige proteinaseinhibitorer og proteolytiske enzymer involveret i specifikke veje som blod koagulation /fibrinolyse og komplementsystemet eller tjener generelle funktioner. Det vides, at A2M binder og inaktiverer proteinaser i alle klasser og særlige. Derfor var det af interesse at analysere anti-proteolytiske aktivitet af hel plasma ved anvendelse af trypsin som reference enzym. Den trypsin-inhiberende kapacitet blev målt ved at beregne mængden af ​​plasma i stand til at inhibere 0,05 ug trypsin. Som vist i figur 5, den inhibitoriske kapacitet ved lavere proteinindhold (2,5-20 ug) var højere i human end i NMR plasma, repræsenteret ved IC

50 af 17.08 ug til menneskeføde og 25,11 ug til NMR plasma. Men ved højere koncentrationer plasma protein blev observeret en højere samlet inhiberende aktivitet i NMR plasma sammenlignet med humant plasma. Der var mindre tilbageværende tryptisk aktivitet i NMR plasma (8,06%) sammenlignet med humant plasma (17,22%) ved anvendelse af 100 ug plasmaprotein at inhibere 0,05 ug trypsin (Fig 5A og 5B).

inaktivering af 0,05 ug trypsin blev titreret med stigende mængder af humane (A) eller NMR (B) plasma svarende til 1-100 ug protein og måles ved omdannelsen af ​​BAPNA til p-nitroanilin ved 405 nm. Den iboende tryptiske aktivitet af NMR og humant plasma blev bestemt ved måling af omdannelsen af ​​BAPNA til p-nitroanilin induceret af 1-100 ug plasmaprotein (C). (* -p 0,05)

iboende proteolytiske aktivitet af menneskelige og NMR-plasma blev bestemt ved spaltning af BAPNA til p-nitroanilin. NMR plasma har en betydelig lavere endogen proteolytisk aktivitet end humant plasma (Fig 5C). Afspejler 100 ug NMR plasma mindre proteolytisk aktive (ca. 40%) end tilsvarende mængde humant plasma. Dette kan forklares ved den højere koncentration af de vigtigste proteinase inhibitor A2M.

Adhæsionsmolekyler under NMR-A2M behandling

Næste generation sequencing data, der allerede er angivet høj ekspression af adhæsionsmolekyler i NMR leveren [12 ]. Vi kunne bekræfte disse resultater på proteinniveau og fundet højere ekspression af EpCAM-protein i NMR leverekstrakt sammenlignet med human (Fig 6A). Næste vi den hypotese, at komponenter af NMR plasma kan modulere ekspressionen af ​​celleadhæsionsmolekyler og derved celleadhæsion. Derfor analyserede vi den klæbende egenskab af dyrkede humane fibroblaster i et såkaldt trypsination-adhæsion assay. Dyrkningsmedium af humane fibroblaster blev suppleret med 0,3 eller 1% NMR plasma. Tilskud med PBS eller 1% humant plasma tjente som kontroller. En betydelig stigning i celleadhæsion blev observeret efter supplering med 1% NMR plasma (figur 6B). For at målrette det spørgsmål, som adhæsionsmolekyler kunne være ansvarlig for den øgede vedhæftning, vi analyserede CD29, CD44 og EpCAM ved western blot analyse i kontrollen og i 0,3 og 1% NMR plasma behandlet humane fibroblaster. Vi observerede en stigning i CD29-protein beløb, når de fibroblaster blev behandlet med 0,3 og 1% NMR plasma. På den anden side, havde CD44-niveauer ikke ændre under samme behandling. EpCAM blev udtrykt på et meget lavt beløb i fibroblaster, men faldet yderligere under NMR plasma behandling (Fig 6C).

Bestemmelsen af ​​EpCAM protein i NMR og menneskelige leverprøver blev analyseret ved elektroforese i 10% SDS- under anvendelse af 20 ug protein i forbindelse med immunoblotting under anvendelse af et monoklonalt muse-anti-humant EpCAM-antistof (a). Humane fibroblaster blev dyrket i medium suppleret med 0,3 eller 1% NMR plasma i 24 timer og, kontroller blev suppleret med PBS (CTR) eller 1% human (hu) plasma), hhv. Cellerne blev behandlet med trypsin /EDTA-opløsning i nøjagtigt 1 min, vasket, og de resterende adhærerende celler blev farvet med Gentiana opløsning. Absorbansen af ​​det frigivne farvestof er direkte proportional med antallet af adhærente celler (B) (** – p 0,01; * – 0,05). Western blot-analyse for CD29, CD44, EpCAM og GAPDH blev udført ved elektroforese i 8% SDS-gel under anvendelse af 10-25 ug protein efter 0,3 eller 1% NMR plasma tilskud i 24 timer. CD29, CD44, EpCAM og GAPDH blev påvist med respektive monoklonale antistoffer (C).

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi udført en sammenlignende analyse af plasma komponenter fra det langlivede gnaver NMR med det fra mennesker. På grund af flere særlige forhold i NMR, som kræft modstand og holdbarhed disse undersøgelser er af høj videnskabelig interesse. Fra vores resultater foreslår vi, at nogle kendetegn i hvert fald delvis kunne forklare de usædvanlige egenskaber af NMR.

Nyt genekspression analyse i leveren af ​​NMR og mus demonstrerer 660 gener betydeligt 5fold overeksprimeres [12]. Mest fremtrædende ekspression var relateret til plasma proteinase inhibitor A2M og proteiner involveret i celle-celle interaktion og ROS forsvarsmekanisme. For at belyse resistente mekanismer kræft vi sammenlignet to langlivede arter, den NMR og mennesker, for at illustrere potentielle anti-cancer mekanismer for menneskelig velvære.

I en tidligere undersøgelse, vi har vist, at aldring er ledsaget med en betydelig tilbagegang af A2M i blod [26]. På nuværende tidspunkt talrige undersøgelser beskriver udestående funktion af A2M i regulering af celle- og vævs homeostase. Dette protein er enestående, da det inhiberer proteinaser i alle klasser, er involveret i metabolismen af ​​sygdomsrelaterede vækstfaktorer og cytokiner og i patogenesen af ​​forskellige sygdomme, såsom cancer, Alzheimer`s sygdom, infektion og inflammation [24, 29-31] .

Disse resultater fik os til at fokusere på analyse af strukturelle og funktionelle egenskaber af A2M fra begge arter baseret på den hypotese, at NMR-data kan give væsentlige bidrag til at identificere anti-cancer strategier hos mennesker.

Forskellige funktioner A2M medieres gennem binding til dets receptor, LRP1. Denne enorme transmembrane protein (600 kDa) er involveret i patogenesen af ​​aterosklerose, cancer cell migration og invasion, lipidmetabolisme samt clearance af Alzheimer-peptid amyloide ß [32-35]. LRP1 binder mere end 30 forskellige ligander og viser den hurtigste og mest effektive clearance system til protein-ligander fra blod og væv. For nylig blev det vist, at leptin danner komplekser med A2M og ryddes fra blodet ved receptor-medieret endocytose gennem LRP1. Computersimulering af denne ternære interaktion afslørede, at den stationære koncentration af plasma leptin kraftigt påvirkes af niveauet af A2M [36]. Dette er vigtigt, fordi andre vækstfaktorer såsom TGF-SS1 og VEGF kausalt involveret i tumorudvikling også binde til A2M og klares ved den samme mekanisme. Desuden LRP1 fungerer som co-receptor for mange signal-receptorer, der involverer i wnt /ß-catenin vej, uPA /uPAR-system og andre [37]. Som en vigtig inhibitor af tumorassocieret metalloproteinaser og regulator af urokinase-plasminogenaktivator (uPA) system cancer, A2M kontrollerer tumorcellemigration og invasion [38]. Disse få eksempler kan vise betydningen af ​​A2M-LRP1 akse i regulering af væv og blod homeostase.

For første gang vi identificeret A2M i NMR ved direkte sammenligning med human A2M og ved immunologiske metoder. Vi fandt, at NMR plasma indeholder cirka to til tre gange højere A2M sammenlignet med human plasma. Afprøvning krydsreaktivitet af NMR-A2M med et panel af anti-humane A2M monoklonale antistoffer vi kunne ikke se nogen reaktivitet. Selv receptorbindende-domæne (RBD) specifikt antistof, alfa-1, kendt for at reagere kun med transformeret A2M, udviste ingen binding. Vi har for nylig fundet, at dette antistof genkender konsensus peptidsekvenser, S1349-R-S1351 … D1330-E-P-K1333, to adskilte epitoper omfatter en konformationel epitop inden for RBD af human A2M [39]. Fraværet af binding til NMR-A2M var sandsynligvis på grund af aminosyreudskiftninger i split epitop til N1350-R-P1352 … D1331-GP-K1334 i NMR, erstatter 3 af 7 aminosyrer i positionerne 1, 3 og 5 i epitop. I modsætning hertil bindingen af ​​NMR-A2M til dens specifikke receptor (LRP1) som eksperimentelt bevist kunne forventes, fordi de to væsentlige lysinrester i position 1395 og 1402 (NMR: Lys1393 og Lys1400) og lup stabiliserende Cys1355 og Cys1471 af human A2M (NMR: Cys1353 og Cys1368) er til stede i NMR-A2M [40]. Den forudsagte otte beta-sheets og et alpha-helix kan findes ved lighed i NMR-A2M [20]. De fleste strukturer, som findes i den humane A2M var også til stede i NMR (disulfidbroer, N-glycosylering, lokkemad-område, trypsinlignende bindingssteder). Imidlertid forudsigelse af N-glycosyleringssteder i NMR-A2M afslørede to yderligere steder (tabel 2). Mens den menneskelige A2M har 8 N-glycosyleringssteder, NMR-proteinet har 10. Dette kunne være en forklaring på den højere molekylvægt af NMR-A2M set i det native PAGE (Fig 1A), eftersom dette ikke kunne alene beror på NMR-A2M aminosyresammensætning. Men også andre ændringer, som O-glycosylering kan bidrage til dette fænomen, da O-glycosyleringer er de meste forekommende og mest komplekse modifikationer i eukaryoter med en artsspecifik måde.

En mulig mekanisme ansvarlig for den ekstreme cancer resistens i NMR blev tidligere vist [5]. En høj-molekylær-mass hyaluronan (HA) blev identificeret, som udskilles ved NMR fibroblaster, men ikke af fibroblaster fra mennesker eller mus. Så længe disse celler produceret HA de blev forhindret i malignitet. Banker ned af HA syntetiserende enzym (HAS2) eller overekspression af nedbrydende enzym (HYAL2) resulterede i forøget malignitet af NMR fibroblaster. Teksturen, sammensætning og stabilitet af den ekstracellulære matrix er afgørende kendetegnende i malignitet. Den største receptor for HA i mennesker og mus er CD44. Blokering CD44 forårsagede dyrkede NMR celler til at vokse hurtigere [5]. For nylig blev det vist, at LRP1 binder til CD44 og således regulerer de klæbende egenskaber af tumorceller [41]. Vores resultater som NMR-A2M binder til LRP1 og at denne binding blev forstyrret af RAP kan kaste lys over den mulige rolle A2M i dette samspil. Dyrkning humane fibroblaster med 1% NMR plasma viste en stigning i adhæsion af disse celler i sammenligning med tilsætningen af ​​humant plasma. En Western blot-analyse viste CD29 øges under NMR plasma tilskud (figur 6C). Vi kunne ikke observere ændringer i CD44-ekspression i humane fibroblaster upon NMR-plasma behandling, der ville forklare den observerede stigning i celleadhæsion. En årsag kan være, at andre celleadhæsionsmolekyler såsom integrin CD29. Den primære funktion af integrin familiemedlemmer er at mediere celle-celle og celle-matrix adhæsion. NMR-plasma forøget ekspression af CD29, som derfor kunne stabilisere disse interaktioner rendering fibroblast mindre følsom over for trypsination. EpCAM (CD326) er udtrykt ved epitel af raske personer, men overudtrykt i de fleste karcinomer. I de fleste tumorer høj EpCAM ekspression var forbundet med metastase og dårlig prognose. Men for forskellige tumortyper er blevet rapporteret, modstridende resultater [42]. Alligevel er det blevet rapporteret, at ß-catenin aktivering induceret EpCAM transkription via binding af TCF /Lef transkriptionsfaktor til EpCAM promotoren [43]. Dette er af interesse som vi for nylig kunne vise, at A2M hæmmer wnt /ß-catenin vej i tumorceller [24]. Dette kunne forklare den hæmmende effekt af A2M på EpCAM udtryk (figur 6C).

Derfor har vi udledt, at en vigtig faktor er ansvarlig for den øgede celleadhæsion på NMR plasma eksponering af humane fibroblaster kunne være A2M.