PLoS ONE: miR-195 Hæmmer EMT ved målretning FGF2 i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Prostatakræft (PCA) er en af ​​de førende årsager til dødsfald i Amerika. Den største årsag til dødelighed kan tilskrives metastase. Cancermetastase involverer sekventielle og indbyrdes forbundne begivenheder. miRNA og epithelial-mesenchymal overgang (EMT) er impliceret i denne proces. MIR-195 nedreguleres i mange humane cancere. Men rollerne for miR-195 i PCa metastaser og EMT fortsat uklare. I denne undersøgelse, data fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) prostatakræft database blev re-analyseret for at opdage miR-195 udtryk og dens roller i PSA. MIR-195 blev derefter overudtrykt i kastrationsresistent PCA cellelinjer, DU-145 og PC-3. Rolle MIR-195 i migration og invasion in vitro blev også undersøgt, og fælles markører i EMT blev evalueret gennem Western blot analyse. En luciferase reporter assay blev udført for at bekræfte målgenet af MIR-195; blev valideret i PCA celler. I MSKCC data re-analyser, blev miR-195 dårligt udtrykt i metastatisk PCa; MIR-195 kunne anvendes til at diagnosticere metastatisk PCa ved måling af tilsvarende udtryk. Areal under Receiver Operating karakteristiske kurve (AUC-ROC) var 0,705 (P = 0,017). Lav miR-195-ekspression karakteriseret med en kortere tilbagefald overlevelse (RFS) tid. MIR-195 overekspression undertrykt cellemigrering, invasion og EMT. Fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2) blev bekræftet som et direkte mål for miR-195. FGF2 knockdown undertrykt også migration, invasion og EMT; derimod øget FGF2 delvist vendt undertrykkende effekt af miR-195. Og data fra ONCOMINE prostatakræft database viste, at PCA patienter med højt FGF2 udtryk viste kortere RFS tid (P = 0,046). Samlet set denne undersøgelse viste, at miR-195 undertrykte PCa celle metastase ved nedregulering FGF2. MIR-195 restaurering kan betragtes som ny terapeutisk metode til behandling af metastatisk PCa

Henvisning:. Liu C, Guan H, Wang Y, Chen M, Xu B, Zhang L, et al. (2015) miR-195 Hæmmer EMT ved målretning FGF2 i prostatacancerceller. PLoS ONE 10 (12): e0144073. doi: 10,1371 /journal.pone.0144073

Redaktør: Kapil Mehta, University of Texas MD Anderson Cancer Center, UNITED STATES

Modtaget: April 21, 2015; Accepteret: 14 oktober 2015; Udgivet: 9. december 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

data Tilgængelighed: Microarray datasæt for prostatakræft blev hentet fra ONCOMINE cancer Profilering Database (https://www.oncomine.org) at undersøge FGF2 udtryk i prostatakræft. Ekspression af miR-195 i prostata cancer cellelinjer blev hentet fra NCBI GEO-databasen (GSE21032, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21032).

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81370849, 81300472, og 81202034), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BL2013032 og BK2012336) og Nanjing City (201.201.053) og Southeast University (3290002402), Science Foundation of Undervisningsministeriet i Kina (20120092120071), grundforskning Midler til de centralasiatiske universiteter og videnskabelig forskning Innovation Project of University i Jiangsu-provinsen (KYLX_0203). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA), en af ​​de førende årsager til dødsfald i Amerika, var ansvarlig for 29,480 amerikanske dødsfald i 2014 [1]. Lokal primær tumor er sjældent fatalt. Den største årsag til dødelighed kan tilskrives metastase [2]. Ca. 90% af dødsfald på grund af faste tumorer er forårsaget af metastase [3]. PCa metastase findes i 5% af patienterne i den første diagnose. I kastrationsresistent PCa (CRPC) gruppe, 50% -70% af patienterne sandsynligvis udvikle knoglemetastasis [4]. Derfor mekanismen for PCa metastaser, især CRPC, bør undersøges til behandling af PSA.

Kræft metastaser involverer sekventielle og indbyrdes forbundne begivenheder [5]. Epithelial-mesenchymal overgang (EMT), kendt for at vende epitelceller til mesenchymale celler, også udfører vigtige funktioner i cancermetastase [6]. Epitelceller få mesenkymale celle egenskaber, herunder erhvervelse af celle migration og invasion evner, gennem EMT [7]. Mekanismerne i EMT er komplekse. Mange faktorer, herunder miRNA [8], er forbundet med EMT. miRNA er små, ikke-kodende RNA af 20-22 nt at posttranscriptionally modulere genekspression ved binding til 3′-utranslaterede region (3′-UTR) af mRNA’er). Antallet af miRNA findes be afvigende expresaion i kræft og implicerer apoptose, proliferation, differentiering og metastase [9]. Det er kendt, at mange miRNA fremme eller inhibere metastatisk tumor progression ved at regulere EMT [10]. miR-29b og miR-30a undertrykt udtryk for mester transkriptionsfaktor Snail 1 i programe af EMT [11, 12]. Derfor kan øget MIR-29b-ekspression inhiberer EMT og mindske celleinvasion [11]. Desuden miR-200 familiemedlemmer og miR-205 undertrykke oversættelsen af ​​zink-finger E-box-bindinger (Zebs) 1 og 2; ZEB 1 og ZEB2 udtryk aktiveres tidligt i EMT [13]

MIR-195 tilhører miR-15/16/195-familien.; denne miRNA er lokaliseret kro kromosom 17p13.1. Aberrant MIR-195-ekspression er blevet observeret i mange typer af maligne cancere, såsom bryst, mave, colon, adrenokortikalt, blære og ovariecancere, hepatocellulært carcinom og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [14-21]. Desuden kan miR-195 også hæmme invasion og migration i NSCLC, colorectal cancer og osteosarkom [17, 18, 22]. MIR-195 blev også fundet at være lav ekspression i PCA væv [23]. Men denne undersøgelse analyseres én MIR-195-ekspression i prostatacancer, virkningerne af MIR-195 på PCa Patobiologi, især i metastase, er endnu ikke fastlagt. Så vi undersøger rolle miR-195 i EMT og metastase af PCa i t den aktuelle undersøgelse

I denne undersøgelse data fra Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) prostatakræft database blev re-analyseret.; Resultaterne viste, at miR-195 dårligt blev udtrykt i metastatisk PCa. Patienter med lavere miR-195-ekspression udstillet kortere tilbagefald overlevelse (RFS) tid. MIR-195 kan også anvendes til at diagnosticere metastatisk PCa ved at måle deres tilsvarende udtryk; areal under modtageren-drift karakteristik (AUC-ROC) var 0,705 (P = 0,017). In vitro fremgangsmåder blev anvendt til at undersøge rollen af ​​MIR-195 i EMT og metastase af PSA. Overudtrykt miR-195 i PCA celler hæmmes EMT og celle metastaser. Luciferase reporter assays og Western blot-analyse blev udført for at identificere MIR-195-mål; Resultaterne viste, at for fibroblastvækstfaktor 2 (FGF2) er et direkte mål. FGF2 blev derefter slået ned i PCA celler og virkninger ligner dem af miR-195 overekspression blev observeret. Endvidere er de gendannede FGF2 niveauer i celler, som overudtrykkes MIR-195 sandsynligvis inhiberede virkningerne af MIR-195. Og data fra ONCOMINE prostatakræft database viste PCA patienter med høj FGF2 udtryk viste kortere RFS tid (P = 0,046). Disse resultater antydede, at miR-195 spiller en vigtig rolle i PCa metastaser

Materialer og metoder

Data mining og bioinformatik analyse

Microarray datasæt for prostatakræft blev hentet fra ONCOMINE. Kræft Profilering Database (https://www.oncomine.org/resource/main.html#a%3A1878%3Bd%3A34%3Bdso%3AdatasetName%3Bdt%3ApredefinedClass%3Bec%3A%5B2%5D%3Bepv%3A150001.151078%2C3508%3Bet%3Anone%3Bp%3A200001310%3Bpg%3A1%3Bpvf%3A59119%3Bscr%3Adatasets%3Bss%3Aanalysis%3Bv%3A18 og https://www.oncomine.org/resource/main.html#a%3A8158%3Bd%3A156636663%3Bdso%3AdatasetName%3Bdt%3ApredefinedClass%3Bec%3A%5B2%2C1%2C3%2C5%5D%3Bepv%3A150001%3Bet%3Anone%3Bp%3A200011396%3Bpg%3A1%3Bpvf%3A800075355%2C800075356%3Bscr%3Adatasets%3Bss%3Aanalysis%3Bv%3A18) at undersøge FGF2-ekspression i prostatacancer. Ekspression af miR-195 i prostata cancer cellelinjer blev hentet fra databasen (GSE21032, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE21032) [24]. MIR-195-ekspression mellem lokaliseret PCa og metastatisk PCa og den tilsvarende biokemiske attakfri tid efter radikal prostatektomi blev undersøgt igen i databasen. ROC-kurver blev genereret, og AUC blev anset for at evaluere følsomheden og specificiteten af ​​anvendelsen af ​​MIR-195-ekspression til at diagnosticere metastatisk PSA. FGF2-ekspression og den tilsvarende biokemiske attakfri tid efter radikal prostatektomi i prostatacancer blev undersøgt i Cancer Profiling Database.

Cellekultur

LNCaP-cellelinje blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) , DU-145 og PC-3 cellelinier blev købt fra Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences. LNCaP og DU-145-celler blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, HyClone, Beijing, Kina) suppleret med 10% føtalt bovint (HyClone, Gaithersburg, Maryland, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ( HyClone, Beijing, Kina). PC-3-celler blev dyrket i DMEM /F12-medium (HyClone, Beijing, Kina) suppleret med 10% føtalt bovint (HyClone, Gaithersburg, Maryland, USA), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (HyClone, Beijing, Kina). Cellekulturer blev inkuberet i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2 ved 37 ° C.

oligonukleotider og celletransfektion

miRNA mimic oligonucleotidduplexer og lille interfererende RNA ( siRNA) blev kemisk syntetiseret af GenePharma (Shanghai, Kina). Sense- og antisense-sekvenser for de HSA-MIR-195 efterligner var: 5′-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3 ‘og 5’CAAUAUUUCUGUGCUGCUAUU-3’. RNA med ingen homologi til nogen human genomisk sekvens blev anvendt som negativ kontrol (NC): 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘(sense) og 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′ (anti-sense). Sekvensen af ​​MIR-195 siRNA var 5’-GCCAAUAUUUCUGUGCUGCUA-3 ‘og kontrolsekvensen var 5’CAGUACUUUUGUGUAGUACAA 3’. Sense- og antisense-sekvenser af FGF2 siRNA var 5′-GGAGUGUGUGCUAACCGUUtt-3 ‘og 5’AACGGUUAGCACACACUCCtt-3’. I celle transfektion blev celler udsået i seks-brønds plader og dyrket indtil 50% til 70% sammenflydning blev nået i 1 d. Transfektion blev udført med lipofectamin 2000 (Invitrogen, Carlsbad, New Mexico, USA) ifølge producentens anvisninger. Transfektionsblandingen blev erstattet med et medium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) efter 6 timer til 8 timer. Salg

cellemigrering og invasion assays

cellemigration og invasion assays blev evalueret ved anvendelse af en Transwell kammer (Millipore, Billerica, MA, USA). Celler blev høstet ved 48 timer efter transfektion, og 5 × 10

4-celler med 200 pi serumfrit medium blev podet i det øvre kammer. Det nedre kammer blev fyldt med medium suppleret med 10% FBS. I invasion assays blev de øvre kamre pre-coatet med Matrigel (BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA) før cellepodning blev udført. Celler tilbage på øverste membran blev fjernet efter 24 timer for invasive celler, og 12 timer for migrerende celler. Migrerende og invasive celler på den nedre overflade blev fikseret i 90% alkohol og farvet med 0,1% krystalviolet. Fem tilfældige felter fra hver membran blev talt. Eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt.

Plasmidkonstruktion og luciferase assay

FGF2 3′-UTR-luciferase reporter vektorer blev skabt ved ligering af FGF2 3′-UTR PCR-produkter ind i Xhol og Notl restriktion stederne i psiCHECK-2 ™ Vector (Promega, Madison, Wisconsin, USA). Mutant 3′-UTR-regioner blev kemisk syntetiseret og ligeret ind psiCHECK-2 ™ vektoren. Celler blev dyrket i 24-brønds plader, og hver brønd blev transficeret med 250 ng af vektorer med 50 nM MIR-195 eller NC. Efter 48 timers co-transfektion blev luciferaseaktivitet bestemmes målt under anvendelse af en dual-luciferase reporter assaysystem (Promega, Madison, Wisconsin, USA) ifølge producentens anvisninger.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret ved RIPA buffer (Beyotime, Shanghai, Kina) suppleret med proteasehæmmere. Proteinprøverne blev elektroforeret i 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler. Elektroforesebehandlede proteiner blev overført til en polyvinylidenfluoridmembran (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) og blokeret i 1 time med 5% skummetmælk ved stuetemperatur. Efter proteinerne blev inkuberet med primære antistoffer ved 4 ° C natten over blev blottene vasket, inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -mærket sekundært antistof ved 37 ° C i 1 time og visualiseret gennem forøget kemiluminescens. Proteinniveauer blev bestemt ved at normalisere mod glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH). De relaterede antistoffer var kanin-anti-GAPDH (1: 500, Xianzhi Biotechnology, Hangzhou, Kina), anti-vimentin (1: 1000, Proteintech, Chicago, USA), anti-N-cadherin (1: 200, Proteintech, Chicago, USA), anti-E-cadherin (1: 500, Proteintech, Chicago, USA), muse-anti-FGF2 (1: 500, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, USA), HRP-mærket gede-anti-kanin sekundært antistof (1: 3000, Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing, Kina) og HRP-mærket gede anti-mus sekundært antistof (1: 3000, Zhongshan Goldenbridge Biotechnology, Beijing, Kina).

Statistisk analyse

miR-195 udtryk og klinisk patientdata blev hentet fra MSKCC database (https://www.mskcc.org). FGF2 udtryk og data kliniske patientdata blev hentet fra ONCOMINE Cancer profilering Database (www.oncomine.org). Alle eksperimenter ovenfor blev gentaget tre gange. Alle data i denne undersøgelse blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistiske beregninger blev udført under anvendelse af SPSS 16.0. Forskelle mellem grupper blev beregnet ved

t

-tests eller envejs ANOVA. Log-cox test blev valgt til at udføre overlevelse analyse. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

miR-195 udtryk og dens virkning på diagnose og resultatet af patienter med PCa

Vi re-analyseret RNA sekventering data PCa database (GSE21032). Ekspressionen af ​​MIR-195 mellem lokaliseret og metastatisk PCAS blev beregnet ved t-tests. Resultatet viste, at miR-195 i metastatisk PCa var væsentligt lavere end i lokaliseret PCa (9,92 ± 0,56 vs. 11,27 ± 0,07, P 0,0001, figur 1A). Desuden ROC-analyse viste, at miR-195 kunne skelne mellem metastatisk kræft og primær PCa (AUC = 0,705, P = 0,017, Fig 1B). Derfor undersøgte vi effekten af ​​lav miR-195 ekspression på RFS i lokaliseret PCa. Patienterne blev inddelt i lave og høje ekspressionsniveauer grupper ved hjælp af nummer placeret i 30% af alle tal, 11,05 som en afskæring af MIR-195-ekspression. RFS-analyse blev udført i 98 lokaliserede PCA sager med opfølgende data. Kaplan-Meier kurver af RFS viste, at PCA patienter med lav miR-195-ekspression viste kortere RFS tid (P = 0,047, Fig 1C). Derfor kan miR-195 spille vigtige funktioner i PCa metastaser

A) data i re-analyseret MSKCC prostatakræft database viste, at miR-195 udtrykkes dårligt metastatisk PCa (metastatisk PCa vs. lokaliseret PCa:. 9,92 ± 0,56 vs. 11,27 ± 0,07, P 0,0001). B) ROC-analyse ved hjælp af ekspressionsniveauer af miR-195 i metastatisk PCa og lokaliseret PCa (AUC = 0,705, P = 0,017). C) Kaplan-Meier-kurver af RFS af patienter med PCa stratificeret efter væv af MIR-195 niveauer. Patienter med lave miR-195 niveauer udstillet kortere RFS end dem med høje niveauer (P 0,05) * P 0.05.

EMT hæmning af miR-195 i PCA celler

For at undersøge om miR-195 påvirker PCa celleinvasion og migration, vi transficeret miR-195-hæmmer eller kontrol inhibitor i LNCaP celler og miR-195 efterligner eller kontrol miRNA i DU-145 og PC-3 celler og analyseret celle migration og invasion evne ved hjælp af Transwell. Resultaterne viste, at MIR-195 efterligner gruppe indeholdt færre antal af celler, der migrerede ind i det nedre kammer i Transwell filteret, end MIR-NC-gruppe i Du-145 og PC-3-celler (fig 2A). Invasion evne var også signifikant nedreguleret i miR-195-transficeret DU-145 og PC-3 celler (Fig 2B). Imidlertid blev der ikke observeret nogen signifikant forskel mellem LNCaP celler transficeret miR-195-hæmmer og kontrol inhibitor i invasion og migration assays (S1 Fig). Så vi valgte Du-145 og PC-3 for de næste eksperimenter. EMT kan ændre celleinvasion og migration evne. At identificere, om miR-195 kan påvirke EMT, vi evalueret nogle fælles EMT markører gennem Western blot analyse. En nedsat ekspression af vimentin og N-cadherin proteiner blev observeret i celler transficeret med MIR-195 efterligner sammenlignet med i celler transficeret med kontrol miRNA. E-cadherin-ekspression forhøjet i celler transfekteret med MIR-195 efterligner (fig 2C). Disse resultater antydede, at miR-195 kan hindre celle invasion og migration ved at hæmme EMT.

A) Tvunget udtryk for miR-195 hæmmede migration i PCA-cellelinjer. B) Tvunget udtryk for miR-195 hæmmede invasion i PCA-cellelinjer. C) Fælles EMT markører udtryk efter transfektion miR-195. * P 0,05. Original forstørrelse × 200.

FGF2 var et direkte mål for miR-195

Bioinformatik analyser blev udført ved hjælp af DIANA microT v5.0 og TargetScanHuman 6.2 at identificere de mål gener af miR- 195. FGF2 blev valgt som potentielt mål gen, fordi det blev forudsagt i begge databaser og havde den højeste samlede kontekst score i TargetScanHuman 6.2. 3′-UTR’er af FGF2 blev forudsagt at indeholde fem bindingssteder for MIR-195. Vi analyserede rækkefølgen af ​​bindingssteder og fandt, at de steder, der ligger fra 1053 til 1059 nukleotider og 1113 til 1119 nukleotider var en del af andre tre bindingssteder (tabel 1). Derfor er det kun de steder, hvor 5065 til 5072, 5598 til 5605, 5639 til 5646, samt mutation sites, blev klonet ind luciferase reporter plasmider (fig 3A). Reporter plasmider blev co-transficeret med MIR-195 efterligner eller NC i PC-3-celler. Luciferaseaktivitet assay viste, at MIR-195 efterligner undertrykte signifikant luciferaseaktiviteten af ​​reporterplasmidet indeholder bindingssteder sammenlignet med NC af vildtype-reporter, men ikke af den mutante ene (Fig 3B). miR-195 overekspression bemærkelsesværdigt hæmmet FGF2 udtryk i DU-145 og PC-3-celler (fig 3C). Disse resultater antydede, at FGF2 er en direkte målgen af ​​MIR-195.

A) Sekvensalignment af human MIR-195 med 3’UTR af FGF2 forudsagt af DIANA LAB. B) Dual-luciferase assay resultater for PC-3-celler viste, at MIR-195 opregulering faldt luciferaseaktivitet. C) FGF2 proteinekspression i PCA cellelinjer blev bestemt ved Western blot-analyse ved 72 h efter transfektion. GAPDH blev anvendt som kontrol. * P. 0,05

FGF2 knockdown fremkaldte lignende virkninger på PCA celler med overudtrykte miR-195

FGF2 blev slået ned i PCA celler ved at indføre siRNA at afgøre, om virkninger af miR-195 kan delvis forklares ved målretning af FGF2. FGF2-ekspression reduceres ved 72 timer efter transfektion, som påvist ved Western blot-analyse (Fig 4C). Antallet af migrerede celler var signifikant lavere i DU-145 og PC-3-celler transficeret med FGF2 siRNA end transficeret med kontrol siRNA (Fig 4A). Antallet af invaderede celler blev også reduceret (figur 4B). I overensstemmelse med MIR-195 transfektion inhibering af FGF2-ekspression i PCA-celler faldt vimentin og N-cadherin ekspression og forøget E-cadherin ekspression (Fig 4C).

A og B) Lav ekspression af FGF2 inhiberede migration og invasion i PCA-cellelinjer. C) FGF2 og fælles EMT markører ekspression efter siFGF2 blev transficeret. * P 0.05.

miR-195 hæmmede EMT i en FGF2 afhængig måde

For yderligere at bekræfte, om FGF2 var nødvendig for miR-195 medieret EMT, vi behandlede cellerne med rekombinant humant FGF2 protein (Sino Biological Inc., Beijing, Kina) efter transfektion blev udført. Antallet af migrerede og invaderede celler væsentligt forøget efter behandling blev administreret (fig 5A og 5B). Vimentin og N-cadherinekspression steget, mens E-cadherinekspression faldt efter 48 timers behandling (Fig 5C). Disse resultater viste, at MIR-195 inhiberede EMT af PCA-celler i en FGF2-afhængig måde.

PCA cellelinier blev behandlet med rekombinant humant FGF2-protein efter transfektion med MIR-195 blev udført. A) Antallet af migrerede celler steg efter behandling. B) Antallet af invaderede celler steg efter behandling. C) Fælles EMT markører udtryk efter 48 timers behandling.

FGF2 udtryk og dens virkning på resultatet af patienter med PCa

ONCOMINE prostatakræft database er den mest berømte database i verden med flere af høj kvalitet datasæt. I Lapointe prostatakræft datasæt, FGF2 udtryk havde ingen statistisk signifikant mellem metastatisk kræft og primære PCA væv (-,91190 ± 0.62090 vs. 0.57764 ± 0,35019, P = 0 0,174). Primære PCA patienter blev opdelt i lave og høje ekspressionsniveauer grupper ved hjælp af medianen nummer som en afskæring på FGF2-ekspression. Kaplan-Meier kurver af RFS indikerede, at PCA patienter med højt FGF2 udtryk viste kortere RFS tid (P = 0,046, Fig 6).

Kaplan-Meier kurver af RFS af patienter med PCa stratificeret af væv af FGF2 niveauer . I Lapointe undersøgelses- patienter med høje FGF2 niveauer udstillet kortere RFS end dem med høje niveauer (P 0,05).

Diskussion

miRNA er unormalt udtrykt i PCa og ændringer i miRNA udtryk påvirke debut, udvikling og metastase af PSA. For eksempel MIR-146a undertrykker tumorvækst og progression i CRPC [25]. miR-29b, miR-200 familien og miR-205 indflydelse PCa metastaser ved at regulere EMT [11, 13]. Endvidere kan miRNA ekspression anvendes til diagnosticering, stadieinddeling og prognose analyse [26]. I denne undersøgelse, re-analyse af de opnåede data fra MSKCC viste, at miR-195 dårligt blev udtrykt i metastatisk PCa. ROC-analyse viste, at miR-195 kan skelne metastatisk kræft fra primær PCa; lav MIR-195 ekspression udviste kortere RFS tid. Disse resultater viste, at MIR-195 kan være impliceret i PCa metastase; MIR-195 kan anvendes som en biomarkør for diagnose og prognose analyse.

Metastatisk sygdom er ansvarlig for hovedparten af ​​cancer-relaterede dødsfald. Omdannelsen af ​​primær tumor til metastatisk cancer er en flertrinsproces. EMT er en vigtig proces under metastase. Derfor er det rimeligt at forvente, at miRNA kan styre metastaser ved at regulere EMT. En stor antal miRNA findes play integrerende roller i modulering EMT [10], MIR-195 er også korreleret med lymfeknudemetastaser og dårlig prognose i colorektal cancer [27]. Men forskriftsproceduren af ​​miR-195 i PCa fortsat uklar. I vores undersøgelse blev virkningerne af miR-195 om regulering af EMT og metastase af PCa undersøgt. Induktion af miR-195 udtryk hæmmede EMT og invasivitet af PCA celler.

miRNA udføre biologiske funktioner ved direkte binding til 3′-UTR af mRNA’er og ved at ændre proteintranslation. Som sådan blev gener reguleret af MIR-195. CARMA3 og Bd-2 er direkte mål for miR-195 i kolorektal cancer [18, 28]. IGF1R og HDGF er direkte mål for miR-195 i NSCLC [14, 17] .I denne undersøgelse FGF2 blev bekræftet som et direkte mål gen af ​​miR-195 gennem luciferaseanalyse og Western blot-analyse. Ud over, at høj FGF2 udtryk udstillet kortere RFS tid i PCA-patienter. FGF2, som tilhører den 23-medlem FGF-familien, blev først fundet i 1974 [29]. FGF2 betragtes som en prototypisk vækstfaktor [30]. FGF2 også overudtrykt i et stort antal humane carcinomer, herunder PCa, og impliceret i onkogene adfærd, herunder invasion og migration [31-34]. FGF2 udtryk er reguleret af mange miRNA. FGF2 er også et mål for miR-503 i hepatocellulære karcinomer [35]. miR-646 kan nedregulere FGF2 og undertrykke osteosarkom celle metastaser [36]. I NSCLC, FGF2 er et mål for miR-152 [37]. FGF2 inducerer også EMT i mange typer af celler, såsom Hertwig s epitel rod kappe (hendes) celler, renale tubulære celler, colon cancerceller og PCA-celler [38-41]. FGF2 inducerer EMT gennem en alvorlig af signalveje [38, 41, 42]. I Hers celler, TGF-β1 og FGF2 inducere EMT gennem en MAPK /ERK-afhængige signalvej [38]. I PC-3-celler, AKT /GSK-3β-signalvejen påvirker EMT, der fremmes af FGF2, ved at kontrollere stabiliteten, lokalisering og transkription af Snail [41]. FGF2 fremmer også EMT gennem PI 3-kinase signalvej [42]. I denne undersøgelse viste vores data, at knockdown af FGF2 fremkaldte lignende virkninger på PCA celler med overudtrykt MIR-195 ved at inhibere EMT og invasionsevne. Efter MIR-195 blev transficeret, de behandlede celler med rekombinant humant FGF2-protein ophævet virkningerne af MIR-195.

Som konklusion MIR-195 inhiberede PCa celle metastase og EMT ved at målrette FGF2. miR-195 restaurering kan tilvejebringe nye terapeutiske metoder til behandling af metastatisk PCa.

Støtte Information

S1 Fig. . Effekten af ​​miR-195-hæmmer i LNCaP

Transficerede miR-195-hæmmer i LNCaP celler påvirkede ikke migrationen og invasion evner

doi:. 10,1371 /journal.pone.0144073.s001

(TIF )

S1 fil. Kliniske studier Tjekliste

doi:. 10,1371 /journal.pone.0144073.s002

(DOCX)

Tak

Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81.370.849 , 81300472, og 81202034), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (BL2013032 og BK2012336) og Nanjing City (201.201.053) og Southeast University (3290002402), Science Foundation of Undervisningsministeriets Kina (20120092120071), grundlæggende forskningsmidler for de centralasiatiske universiteter og videnskabelig forskning Innovation Project of University i Jiangsu-provinsen (KYLX_0203). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.