PLoS ONE: Stool microbiome og metabolomet Forskelle mellem tyktarmskræft patienter og raske Adults

Abstrakt

I dette studie anvendte vi afføring profilering til at identificere tarmbakterier og metabolitter, der er forskelligt repræsenteret i mennesker med kolorektal cancer (CRC) sammenlignet med raske kontroller at identificere, hvordan mikrobielle funktioner kan påvirke CRC udvikling. Afføringsprøver blev indsamlet fra raske voksne (n = 10) og kolorektal cancer patienter (n = 11) forud for kolon resektion kirurgi ved University of Colorado Health-Poudre Valley Hospital i Fort Collins, CO. V4 region 16s rRNA-genet blev pyrosequenced og begge kortkædede fedtsyrer og globale afføring metabolitter blev ekstraheret og analyseret udnytte gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS). Der var ingen signifikante forskelle i den samlede mikrobielle samfund struktur forbundet med sygdomstilstanden, men flere bakteriel slægter, især butyrat-producerende arter, blev underrepræsenteret i CRC prøver, mens en mucin-nedbrydende arter,

Akkermansia muciniphila

, var omkring 4 gange højere i CRC (p 0,01). Proportionalt højere mængder af butyrat blev set i fæces fra raske individer, mens de relative koncentrationer af acetat var højere i afføringen af ​​CRC patienter. GC-MS profilering afslørede højere koncentrationer af aminosyrer i afføringsprøver fra CRC patienter og højere poly og monoumættede fedtsyrer og ursodeoxycholsyre, en konjugeret galdesyre i afføringsprøver fra raske voksne (p 0,01). Korrelative analyse mellem de kombinerede datasæt afslørede nogle potentielle relationer mellem fæces metabolitter og visse bakteriearter. Disse foreninger kan give indsigt i mikrobielle funktioner, der forekommer i en kræft miljø og vil bidrage til fremtidige direkte mekanistiske undersøgelser. Brug integrerede “omik” tilgange kan vise sig et nyttigt redskab til at identificere funktionelle grupper af gastrointestinale bakterier og deres tilknyttede metabolitter som nye terapeutiske og kemoforebyggende mål

Henvisning:. Weir TL, manter DK, Sheflin AM, Barnett BA, Heuberger AL, Ryan EP (2013) Stool microbiome og metabolomet Forskelle mellem tyktarmskræft patienter og raske voksne. PLoS ONE 8 (8): e70803. doi: 10,1371 /journal.pone.0070803

Redaktør: Bryan A. Hvidt, University of Illinois, USA

Modtaget: April 6, 2013; Accepteret: Juni 24, 2013; Udgivet: 6. august, 2013 |

Copyright: © 2013 Weir et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH NCI R03CA150070, Colorado Landbrug Experiment Station (CAES), og Shipley Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

en sund mave system er baseret på en afbalanceret kommensal biota til at regulere processer såsom kosten energi høst [1], metabolisme af mikrobiel og vært afledte kemikalier [2], og immune modulation [3]. Akkumulerende tyder på, at tilstedeværelsen af ​​mikrobielle patogener eller en ubalance i den indfødte bakteriel samfund bidrager til udviklingen af ​​visse gastrointestinale kræftformer. En kausal sammenhæng mellem mavekræft og

Helicobacter pylori

er etableret [4], der fører til den hypotese, at andre vært-associerede organismer er involveret i kræft ætiologi.

En association mellem kolorektal cancer ( CRC) og kommensale bakterier der er formodning i årtier. For eksempel,

Streptococcus infantarius

(tidligere

S. Bovis

) blev diagnostisk betydning efter at det blev anerkendt, at bakteriæmi på grund af denne organisme blev ofte forbundet med kolorektal neoplastisk sygdom [5], [6] . tidlige studier forbinder slægter af bakterier med risiko tyktarmskræft blev imidlertid begrænset til kultur-baserede metoder, som ikke afspejler kompleksiteten af ​​mave mikrobiota [7] – [9]. Udvikling af high-throughput sekventering har lettet detaljerede undersøgelser af tarmen mikrobiota, og en mere grundig og kompleks kolorektal cancer (CRC) associeret microbiome er ved at opstå. Sobhani et al. [10] fandt, at Bacteroides /

Prevotella

gruppe var overrepræsenteret i både fæces og mucosa prøver fra personer med tyktarmskræft i forhold til deres kræft-fri modstykker. De fandt også, at

Bifidobacterium longum

,

Clostridium clostridioforme

, og

Ruminococcus bromii

blev underrepræsenteret i prøver fra disse personer, og konkluderede, at en manglende sammenhæng mellem tumor fase /størrelse med de overrepræsenterede befolkningsgrupper foreslog en medvirkende rolle bakterier i tumor udvikling. To yderligere undersøgelser, der blev offentliggjort samtidigt undersøgte mikrobiota stede i tumoren slimhinde og tilstødende sunde væv af personer med tyktarmskræft og begge undersøgelser viste en overrepræsentation af

Fusobacterium spp

[11], [12], mens andre har afslørede en overflod af

Coriobacteria

andre probiotiske arter [13], [14].

spørgsmålet er, om overrepræsentation af bestemte mikrobielle arter i afføring og slimhinder prøver er tegn på en medvirkende rolle i udviklingen af ​​CRC eller en konsekvens af tumoren miljø. Selv om en kausal rolle intestinal biota i CRC udvikling ikke er blevet påvist, at der er tegn på, at induktion af pro-inflammatoriske reaktioner fra kommensale bidrager til tumor initiering og udvikling [10], [14]. Produktion af genotoxins og DNA skade superoxid radikaler er også mekanismer, som kommensale kan bidrage til CRC udvikling [15]. Alternativt er det blevet en hypotese, at visse probiotiske bakterier fungere som tumor finsnittere, at drage fordel af en økologisk niche skabt af de fysiologiske og metaboliske ændringer i tumor mikromiljø [14].

For at præcisere, hvilken rolle tarm biota i udviklingen af ​​CRC, vil det være nødvendigt at gå videre end taksonomisk overrepræsentation og undersøge ændringer i CRC tilhørende microbiome i en mere funktionel sammenhæng. En vigtig funktionel parameter er, hvor kommensale organismer bidrager til flux af metabolitter og fordelingen af ​​kosten komponenter. Således metabonomics, studiet af globale ændringer i metabolitter som reaktion på biologiske stimuli [16], der anvendes til at identificere og karakterisere den funktionelle microbiome der driver metaboliske ændringer i forbindelse med forskellige diæter, genotyper og sygdomstilstande [17] – [19 ]. Skammel metabolit profiler er blevet valideret som et middel til at vurdere tarmen mikrobielle aktivitet [20], og den aktuelle undersøgelse bidrager til den voksende liste af gut mikrober i CRC microbiome, men udnytter også en metabonomics tilgang til at identificere potentielle microbiome-metabolomet interaktioner.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle individer forudsat skriftligt informeret samtykke før du deltager i undersøgelsen. Alle undersøgelsens protokoller blev godkendt af Colorado State University (Protokol numre 10-1670H og 9-1520H) og Poudre Valley Hospital-University of Colorado Health Systems Institutional Review Boards (Protokol nummer 10-1038 og 10-1006).

Prøvetagning og DNA-ekstraktion

Stool prøver blev indsamlet fra raske individer (n = 11) og for nylig diagnosticeret tyktarmskræft patienter (n = 10) forud for operation for colon resektion (tabel 1-note: ikke alle prøver blev underkastet alle analyser. se tabel 1 fodnote). Eksklusionskriterier for alle deltagere omfattede brug af antibiotika inden for to måneder studier deltagelse, og regelmæssig brug af NSAID, statiner, eller probiotika. Personer, der indberettede kroniske tarmsygdomme eller fødevareallergi /kosten restriktioner blev også udelukket fra undersøgelsen. Yderligere udelukkelse for CRC patienter inkluderet kemoterapi eller strålebehandling behandlinger forud for operationen. Afføringsprøver blev fastsatte analyser før indgivelse af eventuelle præ-operative antibiotika eller forberedelse tarm. Prøverne blev transporteret til laboratoriet senest 24 timer efter indsamlingen af ​​undersøgelsens deltagere. Afføringsprøver blev homogeniseret, og tre delprøver blev indsamlet med sterile vatpinde. DNA blev ekstraheret fra alle prøver ved hjælp MoBio Powersoil DNA-ekstraktion kits (MoBio, Carlsbad, CA) i henhold til producentens anvisninger og opbevaret ved -20 ° C før amplifikationstrinnene.

Pyrosequencing Analyse

Amplifikation af V4-regionen i det bakterielle 16S rRNA-genet blev udført i tredobbelte anvendelse af primere 515F og 806R mærket med 12-bp fejlrettende Golay stregkoder [21]. Tyve pi reaktioner indeholdende 5 Prime Hot Master Mix (5 Prime, Inc., Gaithersburg, MD) blev amplificeret ved 94 ° C i 5 minutter efterfulgt af 35 cyklusser ved 94 ° C i 1 min, 63 ° C i 1 min og 72 ° C i 1 min efterfulgt af en endelig ekstension ved 72 ° C i 10 minutter. Replikere PCR-reaktioner fra hver prøve blev kombineret og geloprenset under anvendelse af GenElute Gel Extraction kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), efterfulgt af yderligere oprensning med AMpure perler (Beckman Coulter, Indianapolis, IN) og kvantificeret med PicoGreen DNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) forud for biblioteket pooling. Pyrosequencing blev udført på kontrakt af University of South Carolinas Engencore Sequencing Facility ved hjælp af en 454 Life Sciences GS FLX System med standard kemi.

Alle sekvens læse redigering og behandling blev udført med Mothur Ver. 1.25 [22] ved hjælp af standardindstillingerne, medmindre andet er angivet. Kort fortalt sekvens læser var (i) trimmet (bdiff = 0, PDIFF = 0, qaverage = 25, MINLENGTH = 100, maxambig = 0, maxhomop = 10); (Ii) tilpasset til bakterielle-delmængde SILVA justering findes på Mothur hjemmeside (https://www.mothur.org); (Iii) filtreret for at fjerne lodrette mellemrum; (Iv) screening for potentielle kimærer under anvendelse af uchime metode; (V) klassificeret ved hjælp af den Grønne Gener database (https://www.mothur.org) og naive Baysianske klassificeringen [23] indlejret i Mothur. Alle sekvenser identificeret som chloroplast blev fjernet; (Vi) sekvenser blev screenet (optimere = MINLENGTH-ende, kriterier = 95) og filtreret (lodret = T, trumf =.), Således at alle sekvenser omfattede samme genetiske rum; og (vii) alle sekvenser blev præ-klynger (diff = 2) for at fjerne potentielle pyrosekventering støj og grupperet (beregnet = onegap, coutends = F, metode = nærmeste) i Otus [24]. For at fjerne effekten af ​​stikprøvestørrelsen på community sammensætning målinger, lyder sub-prøver af 1250 blev tilfældigt udvalgt fra hver afføringsprøve. Efter clustering sekvens læser ind Otus (dvs. nærmeste-naboer på 3% genetiske afstand) eller phylotypes (dvs. sekvenser matcher en fælles slægt i Grønne Genes Database) blev replikere delprøver gennemsnit at give et enkelt samfund profil for hver prøve. Sample size uafhængige værdier for alfa mangfoldighed community beskrivelser som observerede artsrigdom (

S

obs

), Chao1 skøn over den samlede rigdom arter (

S

Chao

), Shannon mangfoldighed (

H ‘

) og jævnhed (

E

H

), og Simpson mangfoldighed (1-D) og jævnhed (E

D) blev bestemt ved at montere en 3- parameter eksponentiel kurve [

y

=

y0

+

en

(1-e

-bx

)] til forfinede parametre over et interval af 100-1250 sekvens læser, hvor den asymptotiske maksima er lig med summen af ​​

y0

en

. Effektiv antal arter blev beregnet som S

H = exp (H) til Shannon indeks og S

D = 1 /D for Simpsons. Alle sekvens data er offentligt tilgængelige via Sequence Læs Archive (SRA) under undersøgelse tiltrædelse nummer ERP002217, der er tilgængelig på følgende link: https://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/ERP002217.

Nontargeted metabolit profilering og Databeskyttelse Metoder

Et hundrede milligram frysetørret afføringsprøve ekstraheres to gange med 1 ml 03:02:02 isopropanol: acetonitril: vand centrifugeret ved 14.000 rpm i 5 minutter og supernatanterne blev kombineret. Ekstrakten blev tørret under anvendelse af en speedvac, resuspenderet i 50 pi pyridin indeholdende 15 mg /ml methoxyaminhydrochlorid, inkuberet ved 60 ° C i 45 minutter, sonikeret i 10 min, og inkuberet i yderligere 45 minutter ved 60 ° C. Dernæst blev 50 pi N-methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide med 1% trimethylchlorsilan (MSTFA + 1% TMCS, Thermo Scientific) tilsat, og prøverne blev inkuberet ved 60 ° C i 30 minutter, centrifugeres ved 3000 x g i 5 minutter, afkølet til stuetemperatur, og 80 pi af supernatanten blev overført til en 150 pi glasindsats i et GC-MS autoprøveudtagningshætteglas. Metabolitter blev påvist ved hjælp af en Trace GC Ultra koblet til en Thermo DSQ II (Thermo Scientific). Prøver blev injiceret i en 1:10 delingsforholdet to gange i diskrete randomiserede blokke. Separation opstod anvendelse af en 30 m TG-5MS søjle (Thermo Scientific, 0,25 mm id, 0,25 um filmtykkelse) med en 1,2 ml /min helium gasstrømningshastigheden, og programmet bestod af 80 ° C i 30 sekunder, en rampe på 15 ° C pr min til 330 ° C, og en 8 minutters pause. Masser mellem 50-650

m /z

blev scannet på 5 scanninger /sek efter elektron indvirkning ionisering. For hver prøve en matrix af molekylære funktioner som defineret af retentionstid og masse (

m /z

) blev dannet ved anvendelse XCMS software [25]. Funktioner blev normaliseret til totalt ionstrøm, og den relative mængde af hver molekylær funktion blev bestemt ved det gennemsnitlige areal af det kromatografiske top blandt gentagne injektioner (n = 2). Molekylære træk blev dannet i peak grupper ved hjælp AMDIS software [26], og spektre blev screenet i det nationale institut for teknologi standarder (www.nist.gov) og Golm (https://gmd.mpimp-golm.mpg.de/) metabolit databaser for identifikationer.

SCFA beslutsomhed.

taburet prøver blev udvundet til kortkædede fedtsyrer ved at blande 1 g frosne afføring med syrnet vand (pH 2,5) og sonikeret i 10 min. Prøverne blev centrifugeret og filtreret gennem 0,45 um nylonfiltre og opbevaret ved -80 ° C inden analyse. Prøverne blev analyseret ved anvendelse af en Trace GC Ultra koblet til en Thermo DSQ II scanning fra

m /z

50-300 med en hastighed på 5 scanninger /sekund i electron impact mode. Prøver blev injiceret ved en 10:01 split-forhold, og indløbet blev holdt ved 22 ° C og overførsel linje blev holdt ved 230 ° C. Separation blev opnået på en 30 m TG-WAX-A søjle (Thermo Scientific, 0,25 mm ID, 0,25 um filmtykkelse) med en temperaturprogrammering på 100 ° C i 1 min, ramped ved 8 ° C pr minut til 180 ° C, holdt ved 180 ° C i et minut, ramped til 200 ° C ved 20 ° C /minut og holdt ved 200 ° C i 5 minutter. Helium carrier flow blev holdt på 1,2 ml pr minut. Peak områder blev integreret ved Thermo Quan software ved hjælp af udvalgte ioner for hver af de kortkædede fedtsyrer, og områder blev normaliseret til total signal.

Statistisk analyse

Forskelle i bakterielle phylotypes og globale metabolitter mellem prøver fra raske individer og tyktarmskræft patienter blev bestemt ved anvendelse AMOVA og Students t-test med et signifikansniveau cutoff af 0,01. Phylotypes og metabolitter, der var signifikant forskellig mellem grupperne blev yderligere forfinet ved at fjerne markører, der havde færre end 25 i alt læser (bakterier) eller grænsetilfælde baggrund signaler (metabolitter), eller at var til stede i færre end 3 individuelle prøver. Kortkædede fedtsyreradikaler koncentrationer blev bestemt i to separate kromatografiske kørsler, så et vægtet middelværdi blev beregnet for hver kvantificeret forbindelse og statistiske forskelle mellem afføringsprøver fra raske individer og patienter med tyktarmskræft blev bestemt under anvendelse af et blandet model ANOVA med eksperiment repræsenterer en tilfældig effekt og status sygdom som en fast effekt (XLSTAT 2011,1, Addinsoft Corp, Paris, Frankrig). Korrelationer mellem metabolitter og bakterier blev bestemt ved hjælp af Pearsons r med en moderat korrelation der forsynes med et r≥0.50 og en stærk korrelation der forsynes med et r≥0.70.

Resultater og Diskussion

Alfa og Beta Mangfoldighed i Stool Biota

Typiske community deskriptorer af alfa mangfoldighed molekylære mikrobielle data omfatter faktiske og skønnede OTU rigdom, og indekser for befolkningens mangfoldighed og jævnhed. I systemer, hvor patogener indført (fx

Helicobacter pylori)

er der markante fald i estimater af mangfoldighed og jævnhed [27] tyder på, at disse indeks kan være nyttige indikatorer for infektion. Vi undersøgte disse parametre i afføringsprøver fra raske individer og dem med CRC at se om de kunne bruges som indikatorer for sygdom state.We observeret nogen signifikante forskelle på 3% genetiske afstand i den gennemsnitlige mangfoldighed eller jævnhed af afføring mikrobielle samfund fra raske individer sammenlignet med dem med CRC (tabel S1). Den gennemsnitlige dækning opnået fra 1250 læser per prøve var 84% og 86% hos raske og tyktarmskræft prøver hhv. Den gennemsnitlige effektive diversitet for hver gruppe foreslog en tendens til højere bakteriel mangfoldighed i afføringsprøver fra raske individer (S

H = 63

, S

D = 20) sammenlignet med dem fra CRC patienter (S

H = 46

, S

D = 15); Men den inter-individuelle variation var for stor til at opnå statistisk signifikans. Baseret på disse data, foreslår vi, at alpha mangfoldighed deskriptorer for afføring mikrobiota er ikke udtryk for sygdomstilstanden i CRC; selv om en begrænsning af denne undersøgelse er, at kun afføringsprøver og ikke væv mucosa blev analyseret. Trods iboende forskelle i afføringen og slimhinder mikrobielle samfund vores resultater er i overensstemmelse med andre offentliggjorte rapporter om samlede bakteriel mangfoldighed og jævnhed skøn mellem CRC og sund afføring og væv /mucosasamples [10].

Dette inter-individuel variation var også tydelig i skøn over beta mangfoldighed, hvor der blev observeret en svag grad af lighed i den samlede mikrobielle samfund sammensætning mellem individer, som bestemt ved hjælp af den uvægtede Jaccard afstand (J

klasse) til at sammenligne samfund medlemskab (figur 1A) og Yue og Claytons [28] indeks (Θ

YC) at sammenligne samfundsstrukturer (Figur 1B). På grund af denne variation, blev der ikke mønstre i den samlede samfund sammensætning bemærket mellem afføringsprøver fra CRC patienter og raske personer.

Taxonomiske Forskelle mellem CRC og Sund afføringsprøver

Status sygdom studier deltagere ikke køre overordnede samfunds struktur af afføring mikrobiota, og sammensætningen og relative forekomst af de store phyla var ens, selv om der var en ikke-signifikant tendens til højere Verrucomicrobia i prøver fra patienter med tyktarmskræft (figur 2). Der var også højere niveauer af Synergetes i kræft gruppe, men dette blev drevet af en enkelt person med en ekstremt høj andel af denne phyla og var ikke repræsentative for hele sekventeret kræft befolkning. Men på slægten /artsniveau, var der en række OTU s der var betydeligt underrepræsenteret i afføringen af ​​patienter tyktarmskræft sammenlignet med raske individer (tabel 2). Disse omfatter flere gramnegative

Bacteroides

Prevotella spp

. som tidligere er blevet isoleret fra human fæces, men er ikke godt karakteriseret med hensyn til deres rolle i tarmens funktion eller generel sundhed. To af de

Prevotella

arter identificeret var ikke kun underrepræsenteret, men var helt fraværende fra tyktarmskræft analyserede prøver.

Prevotella

var en dominerende slægter rapporteret i afføring fra børn i et landligt samfund i Burkina Faso, men fraværende fra en kohorte af italienske børn, og undersøgelsens forfattere hypotese, at

Prevotella

hjalp maksimere energi høst fra en plantebaseret kost [29]. Derfor er det muligt, at de højere niveauer af

Prevotella

i den sunde kohorten kan afspejle forskelle i indtag af fiber og andre plante forbindelser sammenlignet med personer med tyktarmskræft. På slægten niveau, Shen et al [30] fandt

Bacteroides spp.

At blive beriget i colon væv fra raske personer i forhold til adenom væv. Lachnospiracae og medlemmer af slægterne

DOREA

Ruminococcus

også previosly rapporteret som dominerende phylotypes kørsel forskelle mellem sunde og kræft vævsprøver [13]. Den anden Otus at vi identificerede som

Dialister spp.

Og

Megamonas spp

. er ikke tidligere blevet rapporteret i forbindelse med coloncancer; dog faldt populationer af

Dialister invisus

er blevet rapporteret i Crohns sygdom [31].

H prøve angiver prøver fra raske voksne, mens C betegnelsen betyder prøver fra patienter med tyktarmskræft.

der var færre identificerbare bakterier, der var overrepræsenteret i tyktarmskræft befolkningen (tabel 3). Mest bemærkelsesværdigt, observerede vi, at mucin-nedbrydende bakterier,

Akkermansia muciniphila

, som udgjorde en forholdsvis stor procentdel af de samlede sekvenser, var til stede i en væsentlig større andel i fæces hos patienter med tyktarmskræft. Denne bakterie er en almindelig medlem af tyktarmens mikroflora og blev for nylig vist at blive reduceret i irritabel tarmsyndrom og Crohns sygdom [32]; men en nyere rapport viste forøget

A. muciniphila

i colitis ulcerosa-associeret pouchitis [33]. To typer af muciner, MUC1and MUC5AC er reportedely overudtrykt i tyktarmskræft [34], hvilket tyder på, at vores observeret CRC-relaterede stigninger i

A. muciniphila

populationer kan skyldes øget substrattilgængelighed.

Citrobacter farmeri

, som kan udnytte citrat som eneste kulstofkilde var også højere i prøver fra patienter med tyktarmskræft, men repræsenterede en langt mindre andel af de samlede bakterielle sekvenser.

Citrobacter farmeri

er blandt en gruppe af tarmbakterier, der omfatter flere patogene arter som

Salmonella

Shigella,

og som har arylamin

N

-acetyltransferase aktivitet, der kan være involveret i aktivering af kræftfremkaldende stoffer og miljøfremmede metabolisme [35].

Alder og BMI repræsentere andre faktorer, der spiller en rolle i udformningen af ​​den intestinale mikrobielle samfund. Adskillige rapporter har påvist en sammenhæng mellem forholdet mellem Bacteroidetes til Firmicutes og fedme [1]. Vi har udført lineære regressioner mellem den relative forekomst af hver af de taxa, der væsentligt afveg mellem CRC og sunde afføring (se tabel 2 og 3) og BMI og så ingen signifikante korrelationer (tabel S2). Derudover har aldring været forbundet med et fald i beskyttende kommensale anaerobe, såsom

Feacalibacterium prausnitzii,

og en stigning i

E. coli

[

36

]. Vi fandt en negativ sammenhæng mellem alder af deltagere og

DOREA formicagens

(R

2 = 0,354; p = 0,041) og

Ruminococcus obeum

(R

2 = 0,434 ; p = 0,020), begge medlemmer af Clostridium XIVa gruppen, hvilket tyder på, at forskelle mellem kohorter med hensyn til disse to arter kan være et resultat af forskelle i den gennemsnitlige alder af deltagere i hver gruppe i stedet for CRC sygdomsstatus. Til vores viden, et fald i bestanden af ​​gruppemedlemmer Clostridium XIVa ikke tidligere har været forbundet med aldring, men er blevet forbundet med dysbiosis relateret til intestinale inflammatoriske tilstande, såsom Crohns sygdom [37]. Ingen af ​​de andre bakterielle taxa identificeret blev korreleret med alderen (tabel S3). Derfor konkluderer vi, at størstedelen af ​​taxa, der væsentligt afveg i afføringsprøver mellem sunde og CRC kohorter var et resultat af sygdomsstatus og ikke af forskelle i alder eller BMI.

Short Chain Fatty Acid Analysis

kortkædede fedtsyrer (SCFA), navnlig butyrat, er almindeligt studerede mikrobielle metabolitter rapporteret at have anti-tumorfremkaldende virkninger [38]. SCFA er let absorberes og udnyttes i værtsvæv så påvisning i afføring anses typisk en indikation af produktion, der overstiger det, der kan udnyttes af værten [29]. Vi og andre [10], [13] har observeret, at arter af butyrat producerende bakterier, såsom

Ruminococcus spp

. og

Pseudobutyrivibrio ruminis

, var lavere i afføringsprøver fra CRC patienter sammenlignet med raske kontrolpersoner. Derfor har vi kvantificeret flere kortkædede fedtsyrer fra frosne afføringsprøver. De tre store SCFA’er fremstillet som mikrobielle metabolitter, acetat, propionat og butyrat, blev alle påvist som var valerianesyre, isosmørsyre, isovalerianesyre, capronsyre, og heptansyre syrer. Blandt disse, eddikesyre og valeriansyrer syrer var signifikant højere i afføringsprøver fra CRC patienter (p 0,0001 og p = 0,024 henholdsvis) mens smørsyre var signifikant højere i fæces fra raske individer (p lt; 0,0001, figur 3). Der blev ikke påvist forskelle i propionsyre mellem de to grupper. Butyrat betragtes som en af ​​de vigtigste næringsstoffer for normale colonocyter, og alene eller i kombination med propionat det har vist sig at reducere proliferation og inducere apoptose i humane coloncarcinomer [39]. Selvom acetat er et vigtigt SCFA for opretholdelse colon helbred og som forstadium molekyle for endogen cholesterol produktion, har forhøjede niveauer af denne metabolit tidligere blevet forbundet med CRC i mennesker [40]. Acetat kan anvendes til fremstilling af butyrat og proportionale forskelle i disse metabolitter mellem CRC og sunde prøver kan afspejle en udtømning af colon mikrober, der kan udføre denne reaktion i CRC prøver eller det kan være et resultat af nedbrydning af butyrat til acetat under lav colon pH forbundet med CRC. Vi har også observeret signifikant højere relative koncentrationer af isosmørsyre (p 0,0001) og isovalerianesyre (p = 0,002) i prøver fra individer med CRC (figur 3). Disse to SCFA resultat fra bakteriel metabolisme af forgrenede aminosyrer valin og leucin, som var også højere i CRC afføringsprøver (tabel 4), og kan forklare de betydelige stigninger observeret i disse to SCFA’er i CRC befolkning.

Eddikesyre, valerianesyre, isosmørsyre, og isovalerianesyre koncentrationerne var forholdsmæssigt højere, mens den antiproliferative SCFA, smørsyre var signifikant lavere.

Globale taburet metabolitter

afføringsprøver muliggør evaluering af bakterier, der er bosiddende i tarmlumen, og derfor er afføring små molekyler anses for at føre fra co-metabolisme eller metabolisk udveksling mellem mikrober og værtsceller [13]. Global metabolit profilering udført heri på frysetørrede afføringsprøver forudsat indsigt i forholdet mellem mikrobielle populationer og metabolitter, og udlåne til identifikation af nye CRC metaboliske biomarkører. Den overvågede multivariat analyse teknik, retvinklede projektion til Latent Structures-diskriminantanalyse (OPLS-DA), hvilket letter fortolkningen ved separat modellering prædiktiv og ortogonale (ikke-forudsigelige) variabler, blev anvendt til at bestemme, om ikke-målrettet GC-MS Profiler var prædiktive af sygdomstilstanden hos donoren. Den OPLS-DA demonstreret tilfredsstillende modellering og prædiktive kapaciteter for dette datasæt (R2Y = 0,986; QY2 = 0,927), afslører en tydelig adskillelse mellem afføring metaboliske funktioner i de to grupper (figur 4), hvilket antyder, at tilstedeværelsen eller fraværet af CRC er en vigtig faktor kørsel variabiliteten i fæces metabolitter.

i forhold til raske kontrolpersoner, afføring metabolomet analyse viste 11 aminosyrer, der viste en stigning i afføringsprøver af enkeltpersoner 41-80% med CRC (tabel 4). Årsager, der kunne tegne sig for denne CRC-associeret stigning i aminosyre koncentrationer kan omfatte, men ikke være begrænset til forskelle i protein forbrugsmønstre, betændelse-induceret reduktion i næringsstoffer, og øget autofagi forbundet med tumorceller resulterer i ophobning af frie aminosyrer pools [41]. Mikrobiel nedbrydning af kosten proteiner i den distale colon er en putreficative proces, der resulterer i produktion af toksiske aminer, og kan forklare den forøgede frie aminosyrer vi observerede i CRC afføringsprøver. En forøget koncentration af alle aminosyrer undtagen glutamin blev tidligere rapporteret i mave og tyktarm tumorvæv sammenlignet med sundt væv [42]. Forfatterne antaget, at tumorceller kan udvise forøget glutaminaseaktivitet resulterer i glutamin konvertering til glutamat. I overensstemmelse med disse resultater, vi så også en stor stigning, ca. 76%, i glutamat uden en tilsvarende stigning i glutamin i afføringsprøver fra patienter med tyktarmskræft. En anden nylig undersøgelse anvendelse af NMR for at identificere og registrere nedbrydningsprodukter fra afføring vand ekstrakter fra sunde og CRC prøver viste, at CRC-prøver havde ca. 1,5 gange højere niveauer af cystein, prolin, og leucin [43]. De øgede koncentrationer af prolin, serin, og threonin, der blev observeret i CRC prøver kunne også være resultatet mod nedbrydning af intestinale muciner, som primært består af glycoproteiner rige på disse aminosyrer [44]. Dette er i overensstemmelse med berigelsen af ​​

Akkermansia muciniphila

, en mucin-nedbrydende bakterier, observeret i CRC afføringsprøver; selv om vi så ingen stærke sammenhænge mellem den relative andel af disse bakterier og specifikke aminosyre koncentrationer.

Der var højere niveauer af glycerol samt flere umættede fedtsyrer detekteret i afføringen prøver af raske individer. Humane cancerceller har en kendt transportsystem til optagelse af glycerol, hvilket tyder afføring glycerol kan være lavere i CRC, fordi det bliver taget op af tumorcellerne. Alternativt kan bakterielle lipaser til stede i raske individer lette metabolismen af ​​kosten og endogent producerede triacylglyceroler, hvilket resulterer i de endelige nedbrydningsprodukter af glycerol og frie fedtsyrer. Udover glycerol, fedtsyrer bedst matchende metabolomiske signaturer til linolsyre og stereoisomerer af oliesyre var også højere i kontrol (tabel 4). Endelig ursodeoxycholsyre (UDCA), en sekundær galdesyre produceres af tarmbakterier var ca. 63% højere hos raske individer sammenlignet med CRC. Mens flere galdesyrer såsom lithicolic syre og deoxycholsyre er blevet forbundet med tumorigenese, er UDCA vist kemoforebyggende effekt i prækliniske og dyremodeller af CRC [45].

Korrelation analyse af microbiome og metabolomet data viste stærke associationer mellem nogle medlemmer af afføring mikrobiota og kandidat metabolitter.