PLoS ONE: synergistiske virkning af CTLA-4 blokade og Cancer kemoterapi i Induktion af anti-tumor Immunity

Abstrakt

Flere kemoterapeutika udøve immunmodulerende effekter. En af disse er den nukleosidanalog gemcitabin, som er meget udbredt i patienter med lungecancer, ovariecancer, brystcancer, mesotheliom og flere andre typer af cancer, men med begrænset effekt. Vi antager, at de immunpotenserende virkninger af dette stof til dels influeres af den hæmmende T-celle molekyle CTLA-4 og dermed kunne øges ved at kombinere det med et blokerende antistof mod CTLA-4, som på eget for nylig har vist gavnlige kliniske effekter i behandling af patienter med metastatisk melanom. Her viser vi, ved hjælp af to ikke-immunogene murine tumormodeller, at behandling med gemcitabin kemoterapi i kombination med CTLA-4-blokade resulterer i induktion af en kraftig anti-tumor immunrespons. Depletion eksperimenter viste, at både CD4

+ og CD8

+ T-celler er nødvendige for optimal terapeutisk effekt. Mus behandlet med kombinationen udviste tumor-regression og langsigtet beskyttende immunitet. Derudover viser vi, at effektiviteten af ​​kombinationen modereres af timingen af ​​indgivelse af de to midler. Vores resultater viser, at immun checkpoint blokade og kemoterapi kan have en synergistisk virkning i behandlingen af ​​cancer. Disse resultater giver et grundlag for at forfølge kombinationsbehandlinger med anti-CTLA-4 og immunpotenserende kemoterapi og har stor betydning for fremtidige undersøgelser i kræftpatienter. Da begge lægemidler er godkendt til brug i patienter vores data umiddelbart kan omsættes til kliniske forsøg

Henvisning:. Lesterhuis WJ, Salmons J, Nowak AK, Rozali EN, Khong A, Dick IM, et al. (2013) synergistiske virkning af CTLA-4-blokade og kemoterapi mod kræft i induktionen af ​​anti-tumor immunitet. PLoS ONE 8 (4): e61895. doi: 10,1371 /journal.pone.0061895

Redaktør: Ramon Andrade de Mello, University of Porto, Portugal

Modtaget: December 20, 2012; Accepteret: 14. marts 2013; Udgivet 23. april, 2013 |

Copyright: © 2013 Lesterhuis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra National Health og Medical Research Council of Australia og forsikring Kommissionen Western Australia. WJL understøttes af en translationel forskning fællesskab af den hollandske Kræftens Bekæmpelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selv i fortiden, ortodokse klinisk praksis fastslået, at kemoterapi og immunterapi ikke kunne kombineres på grund af den myelosuppressive karakter af de fleste cytotoksiske stoffer, dette begreb er blevet udfordret i de seneste år med en stor mængde eksperimentelle data (revideret i [1], [2]). For eksempel behandling med anthracycliner og oxaliplatin resulterer i immunogen tumorcelledød og platinbaserede kemoterapeutika nedregulere inhiberende STAT6 /PD-L2-vejen og sensibilisere tumorceller for T-cellemedieret cytotoksicitet [3] – [5]. Vores gruppe har vist, at nukleosid analog gemcitabin kan forbedre tumorantigen cross-præsentation ved dendritiske celler og andre har vist, at denne behandling fører til opregulering af tumor MHC klasse I-ekspression og udtømning af både regulatoriske T-celler og myeloide-afledte suppressorceller [6 ] – [10]. Disse data giver et stærkt rationale for at udnytte immunpotentierende effekt af gemcitabin ved at kombinere det med andre immunterapeutiske tilgange.

Immunosuppressive netværk spiller en vigtig rolle i unddragelse af anti-tumor immunitet, og som sådan kunne begrænse immunpotentierende effekt af kemoterapi. En af de potentielt relevante fastholdende veje medieres af immunsystemet inhiberende molekyle cytotoksisk T-lymfocyt antigen 4 (CTLA-4). Ekspressionen af ​​CTLA-4 opreguleres efter T-celleaktivering og vejen er blevet vist at spille en vigtig immunomodulatorisk rolle i cancer. Terapeutisk blokade af CTLA-4 er blevet vist at være en effektiv behandling for melanom [11]. Den anti-CTLA-4 monoklonalt antistof Ipilimumab er nu registreret af FDA som den første behandling, der har vist en samlet overlevelse fordel i et randomiseret fase III studie i metastatisk melanom i kombination med dacarbazin kemoterapi [12], [13]. Men selv om nogle patienter opnåede komplet respons og andre gik på til langsigtet progressionsfri overlevelse, størstedelen af ​​patienterne oplevede sygdomsprogression.

Vi satte os for at afgøre, om CTLA-4 checkpoint begrænser potentielle terapeutiske aktivitet af gemcitabin ved at kombinere det med et CTLA-4 blokerende antistof. I denne undersøgelse viser vi for første gang, at CTLA-4-blokade og immunpotenserende kemoterapi i en terapeutisk dosis have en synergistisk virkning, hvilket resulterer i induktionen af ​​en potent anti-tumor immunrespons og langsigtet beskyttende immunitet. Desuden viser vi, at den samlede effekt af kombinationen i mus er afhængig af timingen af ​​administrationen af ​​de enkelte komponenter.

Materialer og metoder

Mus

BALB /C (H-2

d) og C57BL /6 (H-2

b) mus blev opnået fra Animal Resources Centre (Canning Vale, Australien) og blev holdt under standardbetingelser (M-Block Animal Facility, dronning Elizabeth II Medical Centre, The University of Western Australia). Alle mus, der anvendes i disse undersøgelser var mellem 8-12 ugers alderen.

Etik Statement

blev udført Alle eksperimenter dyr ifølge The University of Western Australia Animal Ethics udvalgets godkendelser (protokol RA /3 /100/1016) og adfærdskodeksen for National Health og Medical Research Council of Australia. Den vestlige Australien Animal Ethics Committee specifikt godkendt denne undersøgelse.

cellelinier

MHC klasse I-positive, klasse II-negative, meget tumorigen og dårligt immunogen BALB /C-afledt asbest-induceret muse mesotheliom cellelinie AB1, transficeret med influenza HA-genet (AB1-HA), er blevet beskrevet før [6], [7]. For revurdering forsøg blev ikke-HA-transfekterede AB1 celler anvendes. Den dårligt immunogene og stærkt tumorigene Lewis Lung Cancer (LLC) cellelinje blev opnået fra CellBank Australien (Westmead NSW, Australien), hvor identitet cellelinjen blev valideret. Cellelinier blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Mulgrave, Australien) suppleret med 20 mM HEPES, 0,05 mM 2-mercaptoethanol, 100 enheder /ml penicillin (CSL, Melbourne, Australien), 50 ug /ml gentamicin (David Bull Labs, Kewdale , Australien), og 10% FCS (Invitrogen). AB1-HA-celler blev opretholdt i medier indeholdende neomycin-analogen geneticin (Invitrogen) i en slutkoncentration på 400 ug /ml. Alle cellelinjer blev regelmæssigt testet og forblev negativ for Mycoplasma spp.

Tumor Challenge og forsøgsprotokol

ABI-HA tumorceller (1 × 10

6) eller LLC (2,5 × 10

5) i 100 pi PBS blev inokuleret sc i nederste højre flanke af modtagende mus. Standard kemoterapi påbegyndt 9 dage senere for AB1-HA og 6 dage senere for LLC når en håndgribelig tumor på ca. 10 mm

2 var klart. Mus blev injiceret i.p. med gemcitabin 120 ug /g legemsvægt hver tredje dag i fem doser (Q3Dx5), et regime tidligere er fastsat som en maksimal tolereret dosis for BALB /C-mus (figurer S1, S2 og S3) [6], [7]. Alternativt blev mus behandlet med en enkelt dosis cisplatin 6 ug /g på dag 9 for AB1-HA eller dag 6 for LLC, som vi fandt den maksimalt tolererede dosis i denne model baseret på titreringsforsøg (data ikke vist). Kontrolmus modtog 100 pi PBS alene. Anti-CTLA-4 blev administreret i.p. hver tredje dag i fire doser (q3dx4). Oprindeligt brugte vi 100 ug per dosis, men efterfølgende dosistitrering undersøgelser viste, at med 75 mg per dosis blev opnået lige resultater og derfor tog vi denne dosis i de efterfølgende eksperimenter (Figur S4). I kombination eksperimenter ved hjælp AB1-HA med cisplatin, brugte vi en enkelt dosis på 200 pg anti-CTLA-4 på dag 9, baseret på en nylig rapport viser gennemførligheden og styrken af ​​denne tidsplan [14], og baseret på vores egne data viser ækvivalens med 75 ug q3dx4 tidsplan (data ikke vist). Tumorstørrelse blev målt ved anvendelse mikro-kalibre mindst tre gange om ugen under behandlingen og efterfølgende indtil tumorstørrelsen nåede 100 mm

2, på hvilket tidspunkt mus blev aflivet efter regionale dyreetiske retningslinjer. Under behandling mus vægte blev overvåget og aflives hvis signifikant vægttab ( 15%). Eller toksicitet blev observeret

I nogle eksperimenter mus, der havde vist fuldstændig regression af tumorer blev de igen fik ikke-HA-transficerede AB1 mesotheliom celler i nederste venstre flanke (fig S5). Hvis mindst to måneder efter genbehandling ingen tumorer var håndgribelig blev musene anset for at være immune. Tumor-drænende lymfeknuder blev derefter opsamlet og farvet for memory T-celle-markører (se nedenfor). Ikke-tumor-bærende naive mus blev anvendt som kontroller.

Antistoffer og kemoterapi

Gemcitabin (Gemzar, Eli Lilly) blev leveret af apoteket afdeling af Sir Charles Gairdner Hospital. Anti-CTLA-4 (klon 9H10) monoklonalt antistof blev fremstillet og oprenset på det monoklonale antistof Facility, WAIMR (Perth, Australien). Den CTLA-4 hybridom var en slags gave fra Prof. JP Allison (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA)

For udtynding eksperimenter blev følgende antistoffer anvendes:. Anti-NK1.1 (klon PK136), anti-CD4 (klon GK1.5) og anti-CD8 (klon YTS169.4), alle fra det monoklonale antistof Facility, WAIMR (Perth, Australien). Anti-CD4 og CD8 blev administreret 150 ug i.v., en dag før gemcitabin /anti-CTLA4, efterfulgt af 100 ug i.p. hver 3. dag, sidste dosis på dag 27. Anti-NK1.1 blev administreret 200 ug ip på dag 6, 9 og 12. Udtømning blev bekræftet ved flowcytometri af perifert blod fra halen blødninger (fig S6).

følgende antistoffer blev anvendt til flowcytometri: CD3 FITC, CD4-PECy7, CD4 Pac Blå, CD8 PerCpCy5.5, CD3 PE og ICOS APC, CD44-PE, CD49b FITC, CD62L-FITC, (alle Biolegend), Ki67 AF488 , Ki 67 PE og CD4 APCH7 (alle BD Bioscience), CD3 PeCy7 foxp3-PerCPCy5.5 og CD8 PECy7, CD8 ef780 (eBioscience).

Cell Farvning og flowcytometrianalyse

Perifert blod prøveudtagning blev udført via hale blødninger på dag 29. et volumen på 100 pi blod blev opsamlet i en heparin rør. Antistof-cocktails af overfladen pletter (CD3, CD4, CD8 og ICOS) blev fremstillet og 20 pi tilsat til 30 pi blod i 1 time. Prøver blev lyseret (BD FACS lyserende opløsning) og permeabiliseret (eBioscience Fiksering /Perm buffer), antistoffet til intracellulær farvning (Ki-67) blev fremstillet og 20 pi tilsat i 45 minutter. Prøverne blev resuspenderes i 200 pi stabiliserende fiksativ (BD) og 50000 lymfocyt gated hændelser blev erhvervet på FACS Canto II flowcytometer (BD Biosciences) og data blev analyseret ved hjælp FlowJo software.

For nogle eksperimenter, der involverer mus, der var blevet kureret med behandling og efterfølgende modstand en genbelastning af tumorceller på den kontralaterale flanke, tumor-drænende lymfeknuder (TDLN) blev høstet (se ovenfor) til analyse af T hukommelse celledelmængder. Lymfeknuder fra begge flanker blev høstet og samlet og farvet for CD4, CD8, CD44 og CD62L, ifølge den samme protokol som flowcytometrianalyse af perifert blod (se ovenfor og figur S5).

Til analyse af T-celle responser i tumoren, TDLN (ipsilaterale armhulen og lysken noder) og milt blev mus aflivet på dag 15 og organerne blev høstet. Dag 15 blev valgt som tidspunkt siden fra ca. dag 12 vækstkurverne mellem grupperne begyndte at dele sig, så tilstrækkelig vurdering af T-celle responser. Milte og LN blev mashed mellem glasplader, resuspenderet i lyse af røde blodlegemer opløsning (eBioscience) og filtreres gennem et 40 um filter (BD) og farvet med de relevante antistoffer. Tumorer blev hakket fint og overført til fordøjelse opløsning bestående af RPMI /2% FCS med 10 mg /ml Collagenase og 1 mg /ml DNAse I (Sigma-Aldrich) og inkuberet i 1 time på en rulle bank. I løbet af de sidste 10 minutter blev EDTA tilsat til en endelig opløsning på 5 mM. Prøver blev vasket med RPMI /2% FCS og filtreret gennem et 40 um filter og farvet med de relevante antistoffer.

Statistiske analyser

Data blev analyseret ved anvendelse af Prism 4.0 (GraphPad Software, Inc.) . data tumorvækst blev analyseret under anvendelse af PASW statistikker udgave 18 MIXED procedure (IBM SPSS, Chicago IL). Sammenligninger mellem behandlingsgrupper ved hvert tidspunkt blev justeret for multipel sammenligning ved Sidak metoden. Data for tumor overlevelse blev analyseret i henhold til de Kaplan Meier-metoden og overlevelse andele blev sammenlignet mellem grupper ved hjælp af en log rank test. Data fra T-celle delmængder blev sammenlignet med Students t-test. Forskelle blev betragtet som signifikante, når P-værdi var. 0,05

Resultater

Anti-CTLA-4 og Gemcitabin Kombiner i en Terapeutisk synergistisk måde

Med udgangspunkt i tidligere data, der viser gemcitabin som en immunogen cytotoksisk stof [7], vi hypotese, at den terapeutiske virkning af gemcitabin kunne forbedres yderligere ved at kombinere det med et blokerende antistof mod CTLA-4. AB1-HA-inokuleret BALB /C-mus blev behandlet med anti-CTLA-4 i kombination med gemcitabin (figur S1 og figur 1). Behandling med gemcitabin alene resulterede i god kontrol med tumorudvækst når lægemidlet blev administreret, som tidligere rapporteret, men tumor skred på ophør af behandling i de fleste mus [15]. Behandling med anti-CTLA-4 alene reducerede antallet af tumorvækst, men var mindre effektivt end gemcitabin som monoterapi (figur 1A). Men når anti-CTLA-4 og gemcitabin blev kombineret, blev der observeret en klar additiv effekt af begge behandlinger med en væsentlig forsinkelse af tumorudvækst. Antallet af dyr, der opnåede fuldstændig regression var superadditiv (-60% i kombinationen versus ~13% for anti-CTLA-4 og ~8% for gemcitabin alene i AB1-HA-model, fig. 1A og B). Vi fandt også forbedret tumor kontrol i LLC-model, men effekten var mindre udtalt (fig S7). Dette stemmer overens med humane undersøgelser ved hjælp af immun checkpoint blokerende antistoffer, viser store forskelle i effekten mellem forskellige typer kræft [16]. Interessant, da vi behandlede mus med den ikke-immunogene kemoterapeutisk lægemiddel cisplatin [17], var der ingen klar synergistisk virkning i enten model (figur 1C og D og figur S7).

(A) Tumor overflade i mm

2 (middel ± SD) af AB1-HA tumorer, der blev injiceret på dag 0, mus (n = 87) blev behandlet på dag 9/12/15/18 med 75 ug anti-CTLA-4 og med 120 ug /g gemcitabin på dag 9/12/15/18/21, eller med PBS (samlede data af 5 separate forsøg er vist). (B) Kaplan-Meier overlevelse plot af det samme forsøg. (C) Tumor overflade i mm

2 (middel ± SD) af AB1-HA tumorer, der blev injiceret på dag 0, mus (n = 65) blev behandlet på dag 9 med 200 ug anti-CTLA-4 og 6 ug /g cisplatin, eller med PBS (samlede data fra 3 separate eksperimenter er vist). (D) Kaplan-Meier overlevelse plot af det samme forsøg.

Tidligere studier i cancerpatienter og dyr har antydet, at ICOS

+ T-celler spiller en vigtig rolle i virkningen af ​​anti-CTLA -4, samt have prognostisk betydning [18], [19]. Vi analyserede ICOS ekspression og proliferativ status af cirkulerende T-celler i mus og fandt, at mus, der blev behandlet med kombinationsterapien viste en betydelig stigning i CD4

+ ICOS

+ T-celler i perifert blod, samt en klar stigning i CD4

+ proliferative T-celler som bestemt ved Ki-67-farvning (figur 2A-D, s 0,001).

En sammenligning er vist af perifert blod aktiverings- og spredning T-celle markører på dagen 29 efter podning for de forskellige behandlingsgrupper (* p ≤ 0,05; ** p 0,01 *** p 0,001). ICOS

+ /CD4

+ Th-celler (A); Ki-67

+ /CD4

+ Th-celler (B); CD8

+ /ICOS

+ CTL’er (C) og CD8

+ /Ki-67

+ CTL’er (D). (E og F) Flowcytometrisk analyse af prolifererende CD8

+ T-celler og Treg i tumor, tumor-drænende lymfeknude og milt på dag 15. Afbildet er procentdelen af ​​Ki-67

+ CD8

+ af CD3

+ celler og Foxp3

+ CD4

+ af CD3

+ celler (F). Seks mus pr gruppe blev testet for kontrol og anti-CTLA-4, 12 mus pr gruppe for gemcitabin-holdige regimer poolede pr 2 mus på grund af den lille tumorstørrelse i disse grupper. Midler med SEMs er vist (n = 36). (G) Kaplan-Meier overlevelse plot af AB1-HA tumorer, der blev injiceret på dag 0, mus (n = 57) blev behandlet med anti-CTLA-4 og /eller gemcitabin, eller med PBS i kombination med depletterende antistoffer mod CD4 eller CD8 (poolede data fra 2 separate eksperimenter er vist).

for at få mere indsigt i sammensætningen af ​​tumor-infiltrerende celler under behandling, vi beregnede hyppigheden af ​​Foxp3 + CD4 + tregs, CD49b

+ CD3

– NK-celler og ICOS

+ CD4

+ aktiverede Th celler og Ki-67

+ CD8

+ prolifererende CTL’er i tumor, tumor-drænende lymfeknuder (TDLN) og milt på dag 15 (Figur 2E-F, fig S8). Procentdelen af ​​CD8

+ CTL’er var ikke forskellige mellem behandlingsgrupperne (fig S8), men deres proliferative kapacitet, som målt ved Ki-67 gjorde stigning, når mus blev behandlet med anti-CTLA4, både i tumor og TDLN. Interessant nok blev den relative tab af prolifererende tumor-infiltrerende CD8

+ T-celler i gemcitabin-behandlede mus delvist reddet af anti-CTLA-4 (figur 2E). Tumor CD4 + T-celle-infiltration blev ikke ændret signifikant ved enten gemcitabin eller anti-CTLA-4, selvom ICOS ekspression som en markør for aktivering blev faldet i alle gemcitabin-behandlede mus, enten med eller uden anti-CTLA4 (fig S8). Procentdelen af ​​tumor-infiltrerende Foxp3

+ CD4

+ T-celler var signifikant nedsat i tumorer behandlet med gemcitabin, anti-CTLA-4 eller kombinationsbehandlingen (figur 2F), en konstatering konsistente med tidligere publicerede data [10 ]. Der blev ikke observeret nogen klare forskelle i NK celle tal mellem behandlingsgrupper (Figur S8).

For at undersøge, om den forbedrede respons på kombinationsbehandling involveret primært CD4

+ eller CD8

+ T-celler eller NK celler udførte vi nedbrydende forsøg under anvendelse af monoklonale antistoffer mod CD4, CD8 (AB1-HA model) og NK1.1 (LLC model, eftersom BALB /C mus udtrykker ikke NK1.1). Vi fandt, at den terapeutiske virkning af gemcitabin plus anti-CTLA4 blev fuldstændig ophæves, når enten CD4

+ eller CD8

+ -celler blev depleteret (figur 2G), hvorimod depletering af NK-celler ikke påvirkede effektiviteten af ​​behandlingen ( Figur S9). Taget sammen viser disse data, at anti-CTLA-4 og kemoterapi synergi i induktionen af ​​en potent anti-tumor immunrespons, med en vigtig rolle for både CD4

+ og CD8

+ T-celler til optimal terapeutisk virkning .

Anti-CTLA-4 og Gemcitabin kombinationsbehandling inducerer Langtidsholdbar Beskyttende Anti-tumor immunologisk hukommelse

En af de vigtige teoretiske fordele ved immunterapi forhold kemoterapi er, at førstnævnte har potentiale til at fremkalde immunologisk hukommelse og derfor mulighed for at opnå holdbare svar. Vi testede, om kombinationsbehandling med anti-CTLA-4 og gemcitabin resulterede i anti-tumor immunologisk hukommelse. Vi reinoculated mus, der havde fuldstændig afviste deres tumorer efter kombinationsbehandling og fundet, at 93% (13 ud 14 mus) af disse mus var fuldstændigt resistente over for tumor genbelastning (figur 3A). Vigtigt er det, for revurdering eksperimenter anvendte vi AB1 celler, der ikke blev transficeret med HA, hvilket indikerer, at den inducerede immunitet var mod delte tumorantigener på AB1 mesotheliom celler og ikke kun mod den transficerede HA-antigenet. Flowcytometrisk analyse af T-celle delmængder i de drænende lymfeknuder fra disse mus udviste forøgede niveauer af både centrale hukommelse og effektor memory CD4

+ T-celler, og i mindre grad CD8

+ hukommelsesceller (figur 3B-E , p 0,001). Sammen antyder disse data, at kombinationen behandling resulterer i en forøgelse af hukommelse T-celler og induktion af beskyttende immunitet.

(A) Kaplan-Meier overlevelse plot af mus, som var blevet helbredt af enten anti-CTLA- 4 alene eller kombinationsbehandling og der var efterfølgende behandles med stoffet igen AB1 lungehindekræft celler, som viser beskyttende immunitet i 80% og 92% hhv. T-celle delmængde analyse i tumor-drænende lymfeknuder i disse mus (* p 0,05; ** p 0,01 *** p 0,001): CD44

+ /CD62L

+ /CD4

+ T central hukommelse celler (B); CD44

+ /CD62L

– /CD4

+ T effektor memory-celler (C); CD44

+ /CD62L

+ /CD8

+ T central hukommelse celler (D); CD44

+ /CD62L

– /CD8

+ T effektor memory-celler (E)

Effekten af ​​anti-CTLA-4 /Gemcitabin Afhænger Timing

for at bestemme den optimale behandling tidsplan med hensyn til timingen af ​​både anti-CTLA-4 og gemcitabin, vi behandlede AB1-HA tumor-bærende mus med tre forskellige ordninger: gemcitabin efterfulgt af anti-CTLA-4, samtidig kombinationsbehandling og anti-CTLA-4 efterfulgt af gemcitabin (figur S3, figur 4). Et dyr i anti-CTLA-4 efterfulgt af gemcitabin gruppe blev aflivet på grund af vægttab på over 15%, ellers var der ingen synlig toksicitet. Vi observerede markante forskelle i tumorudvækst mellem disse grupper (figur 4). Der var ingen signifikant additiv værdi af kombinationsterapien i enten anti-CTLA-4 eller gemcitabin alene, når det kemoterapeutiske lægemiddel blev administreret separat fra anti-CTLA-4. Den synergistiske anti-tumor virkning blev kun observeret, når de begge lægemidler blev givet samtidigt. Overraskende, når kun den første dosis af gemcitabin blev udeladt (som i “anti-CTLA-4 først” arm versus den samtidige arm), anti-tumor effekt faldet drastisk (figur 4). Disse data viser, at passende tidspunkter for de særskilte forbindelser er kritisk for optimal effektivitet.

(A) Tumor område i mm

2 (middel ± SD) af AB1-HA tumorer, der blev injiceret på dag 0, mus (n = 86) blev behandlet med forskellige tidsplaner af anti-CTLA4 og gemcitabin (se figur S2), eller med PBS (poolede data fra 3 separate eksperimenter er vist). (B) Kaplan-Meier overlevelse plot af det samme forsøg.

Discussion

Kombinationen af ​​kemoterapi og immunterapi til behandling af cancer besidder urealiserede løfte [1]. Den nyligt FDA-godkendte anti-CTLA-4-antistoffet er en logisk og umiddelbart overføres immunterapeutisk tilgang til at kombinere med kemoterapi. Vi antager, at vi ville finde en synergistisk interaktion med en kombination af anti-CTLA-4-blokade og en immunpotenserende cytotoksisk lægemiddel. Vi forventede, at kemoterapien ville forårsage tumorskrumpning og immunogen antigen frigivelse, mens det anti-CTLA-4 ville øge T-celle-aktivering og ekspansion. Tidligere data til at understøtte denne hypotese var begrænset. Et stort fase III forsøg i metastatisk melanom sammenligne anti-CTLA-4 plus DTIC versus DTIC alene fundet en overlevelse fordel for kombinationsbehandlingen sammenlignet med DTIC kemoterapi alene [13]. Men fordi der var ingen sammenligning med anti-CTLA-4 alene var det relative bidrag af kemoterapien til den observerede effekt kunne ikke vurderes nøjagtigt. Ligeledes et fase II studie i ikke-småcellet lungekræft, fundet forbedret progressionsfri overlevelse for kombinationen af ​​Ipilimumab i kombination med kemoterapi alene; igen her Ipilimumab alene var ikke en komparator [20]. I et fase II studie, der gjorde sammenligne Ipilimumab alene versus Ipilimumab plus DTIC, men ved hjælp af lavere doser af undersøgelsen narkotika, var der en tendens i retning af bedre sygdomsbekæmpelse sats for kombinationen arm, men det nåede ikke signifikans [21]. Baseret på disse offentliggjorte humane undersøgelser, kan ingen endelig konklusion drages på en mulig synergistisk effekt af anti-CTLA-4 og kemoterapi. Selv om en tidligere dyr undersøgelse fandt forbedret antitumorvirkning når anti-CTLA4 blev sat til melphalan kemoterapi, dette eksperiment anvendte en subterapeutisk dosis af melphalan, skal skew T-cellereaktioner mod et Th1-fænotype [22]. For nylig, Wu og kolleger fandt, at anti-CTLA-4 behandling i kombination med cisplatin resulterede i bedre sygdomsbekæmpelse i en murin mesotheliom model, når tumorer blev behandlet, før de var palpabel, formodentlig på grund af inhiberet cancer cellerepopulation [23]. Vi fandt ingen offentliggjorte data fra dyr der er relevante for vores hypotese, anvendelse af terapeutiske doser af kemoterapi i åbenlys kræft.

Som gemcitabin er almindeligt anvendt i behandlingen af ​​mange cancertyper, herunder lungehindekræft, testede vi kombinationen i en vel- etableret ikke-immunogen murine model af lungehindekræft. Behandling af AB1-HA med gemcitabin resulterer i moderat reduktion tumor eller forsinket tumorudvækst i denne model, hvorved efterligne den kliniske situation i den kemoterapeutiske behandling af de fleste metastatiske cancere.

Vi fandt her, at kombinationsterapi med gemcitabin og anti -CTLA-4 udøvede et langt større antitumorvirkning end begge alene midler, således virker på en synergistisk måde (figur 1). Denne korreleret med en udtalt stigning i CD4

+ ICOS

+ T-celler i perifert blod, samt en klar stigning i prolifererende CD4

+ T-celler, som bestemt ved Ki-67 farvning, selv om vi ikke gjorde detektere denne stigning i tumoren samt (figur 2). CD4

+ T-celle-infiltration i tumoren blev styrket ved kombinationsbehandlingen, og en gemcitabin-associeret fald i prolifererende tumor-infiltrerende CD8

+ T-celler blev delvist reddet af CTLA-4-blokade. Vigtigere er det, vi fandt ikke nogen reduktion i tumorvækst, når anti-CTLA-4 blev kombineret med cisplatin. Cisplatin er blevet vist at inducere et ikke-immunogen form for celledød [17], og selv om det nedregulere inhibitormolekylet PD-L2 [5], tumor model, vi bruger kun udtrykker meget lave niveauer af PD-L2 (data ikke vist). Derfor betragter vi cisplatin at være en ikke-immunpotenserende form for kemoterapi i denne model. Disse resultater antyder, at kombinationsbehandling med anti-CTLA-4 vil være mest potente, når de kombineres med immunpotenserende kemoterapi.

Da en af ​​de teoretiske fordele ved at kombinere kemoterapi med immunterapi er induktionen af ​​en langvarig immunologisk hukommelse, undersøgte vi hukommelse T-celle respons i mus med tumorer, der havde svandt ved behandling (figur 3). Vi fandt, at disse mus havde forhøjede niveauer af både CD4

+ og CD8

+ effektor hukommelse og centrale hukommelses-T-celler i tumoren-drænende lymfeknuder, korrelerer med beskyttende immunitet mod en genbehandling med tumorceller. Disse resultater stemmer overens med undersøgelser i et murine OVA-udtrykkende

Listeria monocytogenes

model, hvor CD8

+ T-celle hukommelse blev forstærket af en enkelt dosis af anti-CTLA-4 [14]. Vigtigere er det, i vores model, hverken dannelsen af ​​CD4

+ eller CD8

+ memory T-celler blev hæmmet af gemcitabin.

Vores tredje mål var at bestemme den optimale sekvens af kemoterapi og anti-CTLA -4 terapi. Da det er kendt fra flere dyreundersøgelser at timing er afgørende i anvendelsen af ​​anti-CTLA-4, når det kombineres med fremgangsmåder vaccination [24], [25], vi hypotese, at optimale timing /planlægning i kombination med kemoterapi ville også være kritisk for anti-CTLA-4 virkningsfuldhed. Vi fandt, at virkningen af ​​kombinationen faktisk afhang planlægning: hvis gemcitabin blev administreret før eller efter anti-CTLA-4, var der ingen additiv værdi over enten alene terapi, hvorimod samtidig behandling førte til sygdomsbekæmpelse i de fleste mus ( Figur 4).

som konklusion vores resultater viser, at anti-CTLA-4-terapi og kemoterapi kan få en klar synergistisk virkning i behandlingen af ​​cancer. Vores data giver et rationale at videreudvikle kombinationer af cytotoksiske lægemidler og anti-CTLA-4 i klinikken. Men baseret på vores data, foreslår vi, at for forskellige grupper af cytotoksiske anti-cancer forbindelser, deres optimale tidsplan og immunogenicitet skal først nøje bestemt i prækliniske modeller og små kliniske studier.

Støtte oplysninger

Figur S1.

Behandlingsplan af gemcitabin og anti-CTLA-4 i AB1-HA model. Balb /c-mus blev inokuleret med 1 x 10

6 AB1-HA murine mesotheliom celler på dag 0 og efterfølgende injiceret ip med PBS, 120 ug /g legemsvægt gemcitabin hver tredje dag i fem doser (Q3Dx5) på dag 9- 12-15-18-21 eller 75 ug anti-CTLA-4 (q3dx4) om dagen 9-12-15-18, enten alene eller i kombination, som angivet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0061895. S001

(PDF)

figur S2.

Behandlingsplan af gemcitabin og anti-CTLA-4 i LLC-model. C57BL /6-mus blev inokuleret med 2,5 x 10

5 LLC murine lungecancerceller på dag 0 og efterfølgende injiceret ip med PBS, 120 ug /g legemsvægt gemcitabin hver tredje dag i fem doser (Q3Dx5) på dag 6-9 -12-15-18 eller 75 ug anti-CTLA-4 (q3dx4) om dagen 6-9-12-15, enten alene eller i kombination, som angivet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0061895.s002 Hotel (PDF)

figur S3.

Behandlingsplan af kombinationsterapi med gemcitabin og anti-CTLA-4 i AB1-HA model, sammenligner forskellige behandlingsskemaer. Balb /c-mus blev inokuleret med 1 x 10

6 AB1-HA murine mesotheliom celler på dag 0 og efterfølgende injiceret ip med 120 ug /g legemsvægt gemcitabin (q3dx5) og 75 ug anti-CTLA-4 (q3dx4) divideret over tre grupper, “samtidige” (anti-CTLA-4 på dagen 9-12-15-18; gemcitabin på dag 9-12-15-18-21), “anti-CTLA-4 først” (anti-CTLA- 4 om dagen 9-12-15-18; gemcitabin på dag 12-15-18-21-24) og »gemcitabin først” (gemcitabin på dag 9-12-15-18-21, anti-CTLA-4 på dagen . 24-27-30-33)

doi: 10,1371 /journal.pone.0061895.s003

(PDF)

figur S4.

Dosis-optimering undersøgelse af anti-CTLA4 i AB1-HA model. Tumor overflade i mm

2 (middel ± SD) af AB1-HA tumorer, der blev injiceret på dag 0, mus (n = 40) blev behandlet med 75 ug anti-CTLA-4 i.p. på dag 9-12-15-18 i de angivne doser og med gemcitabin 120 pg /g kropsvægt på dagen 12-15-18-21-24

doi:. 10,1371 /journal.pone.0061895.s004

(PDF)

figur S5.

gating-strategi til bestemmelse af hukommelse T-celle-undergrupper i tumor-drænende lymfeknuder, under anvendelse af flowcytometri. Tumor-drænende lymfeknuder blev høstet som beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet.