PLoS ONE: Oral Tolerance til Kræft kan ophæves af T Regulatory Cell Hæmning

Abstrakte

Oral administration af tumorceller inducerer en immun hypo-lydhørhed kendt som oral tolerance. Vi har tidligere vist, at oral tolerance over for en cancer er tumorantigen specifik, ikke-krydsreaktiv og medfører en tumorvækst fordel. Vi undersøgte anvendelsen af ​​regulatoriske T-celle (Treg) udtømning på oral tolerance til en cancer og dens evne til at kontrollere tumorvækst. Balb /C-mus blev sondeernæring fodret homogeniseret tumorvæv – JBS fibrosarkom (for at inducere oral tolerance over for en cancer), eller PBS som kontrol. Vækst af subkutane JBS tumorer blev målt; milt væv skåret ud og flowcytometri anvendes til at kvantificere og sammenligne systemiske tregs og T effektor (Teff) cellepopulationer. Inden og /eller efter tumor fodring blev musene intraperitonealt administreret anti-CD25, for at inaktivere systemisk tregs, eller givet isotype antistof som en kontrol. Mus, der oralt var tolerabel inden subkutan tumor induktion, viste signifikant højere systemiske Treg niveauer (14% vs 6%) og hurtigere tumor vækstrater end kontrollerne (p Accepteret den 22. april 2014 Udgivet: 15. maj 2014

Copyright: © 2014 Whelan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret gennem en forskningsbevilling til GOS og MT fra Cancer Research Irland (CRI06OSUG). MW blev finansieret af et stipendium fra Royal College of Surgeons Edinburgh og Royal College of Surgeons Irland. Forfatterne anerkender også støtte fra Cork Cancer Research Centre. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selv i sammenlignelige tumor iscenesætter prognosen for patienter, der lider spiserøret og mavekræft forbliver konsekvent og markant dårligere end for patienter med distale mave-tarmkanalen kræft, på trods af fremskridt i diagnostiske, kirurgiske og adjuverende behandlinger [1], [ ,,,0],2]. Blandt de mange variabler, der bestemmer tumor vækstrater og prognoser, forskelle i tumor immunforsvar sandsynligvis eksistere mellem fortarm og andre kræftformer. Behandlingen af ​​kosten antigener (AGS) af det mucosale immunsystem i mavetarmkanalen fører til en systemisk Ag specifikt immun hypomodtagelighed betegnes oral tolerance [3]. Det er sandsynligt, at tumor Ags afledt fra tumorvæv udskilles til tarmen ved fortarm cancere ville blive behandlet af de tarmrelateret lymfevæv (GALT), overvejende i den proximale mave-tarmkanalen, på en måde der minder om Ags indtages af slimhindeimmunsystemet og således skabe en tumor Ag specifikt immun tolerance. Vi har tidligere rapporteret, at oralt administreret frisk tumorvæv inducerede en tumor Ag specifik ikke-krydsreaktiv immun tolerance med en deraf følgende vækst fordel for kræft [4].

Mekanismen af ​​tolerance over for indtaget Ags kan tilskrives enten aktiv undertrykkelse eller induktion af klonal sletning /anergi [5]. T-celler klonet fra tolerans mus er blevet tilskrevet en unik undergruppe af CD4

+ befolkning, Th3 celle [6]. I T-celle receptor (TCR) transgene mus, der var en stigning i CD4

+ CD25

+ celler som reaktion på oral Ag administration. Disse tregs blev fundet at udtrykke CTLA-4 og foxp3 og have en undertrykkende funktion

in vitro

. CD4

+ CD25

+ foxp3

+ tregs spille en rolle i at forebygge udviklingen af ​​autoimmun sygdom og har en dobbelt egenskab som både anerge og undertrykkende celler. Betydeligt, er det blevet vist, at fjernelse af denne population kan inducere anti-tumor immune aktivitet [7] – [10]. I eksperimentelle systemer, som tumorer vokser, er der en numerisk stigning i tregs i immunsystemet infiltrat med deraf følgende lokal undertrykkelse af anti-tumor immunrespons. Antistof (Ab) medieret fjernelse af disse tregs kan afslører naturlige tumor immunreaktivitet og denne strategi har vist sig at forstærke det immunterapeutiske ødelæggelse af eksperimentelle cancerformer [10] – [12].

Vi har undersøgt virkningerne af oral tolerance over for JBS tumor på tumor vækstrater og på størrelsen af ​​lymfocytsubpopulationer i Balb /C mus. Konkret vi undersøgt, om induktion af oral tolerance over for tumorer var Treg-afhængige – og om treg inaktivering kunne ophæve oral tolerance og hæmme tumorvækst

Materialer og metoder

Cell Tissue Culture

.

JBS murine fibrosarkom [13] blev dyrket i vævskulturkolber ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2, i DMEM (Dulbeccos minimalt essentielt medium -Sigma-Aldrich, Dublin, Irland). Vævskultur medier blev suppleret med 10% jern-suppleret donor kalveserum, 50 ug /ml gentamycin, 300 ug /ml L-glutamin og 10 mM HEPES (1-Piperazineethane sulfonsyre, 4- (2-hydroxyethyl) mononatriumsalt ), pH 7,4. Standardprocedurer til trypsinisering, centrifugering og resuspension af celler blev anvendt [13]. Levedygtige celletal blev udført ved hjælp af trypanblåt udstødelse (Sigma, Irland).

Etik Statement

Alle murine eksperimenter blev godkendt af dyreetik udvalg University College Cork (AERR # 2010 /003). Undersøgelsen blev udført i nøje overensstemmelse med de betingelser, som det irske børn og sundhed anbefalinger.

Tumor Induktion

Mus blev opnået fra Harlan Laboratories (Oxfordshire, England). De blev holdt ved en konstant stuetemperatur (22 ° C) med en naturlig dag /nat lyscyklus på konventionel dyr koloni. Standard laboratorie mad og vand blev leveret

ad libitum

. Før eksperimenter blev musene gav en prøvetid på 14 dage. Balb /C-mus af begge køn og atymiske Balb /C HsdOla: MF1-nu mus i god stand, der vejer 16-22 g ved 6-8 ugers alderen, blev inkluderet i forsøgene. For JBS tumorinduktion, 2 × 10

6 tumorceller suspenderet i 200 pi DMEM blev injiceret subkutant i flanken af ​​musene. Med denne mængde inokulum og placering der var lidt punkturstedet ekstravasation af cellesuspensionen og tumorvækst og form var konsistent.

sondeernæring Fodring

Efter subkutan inokulation på 2 × 10

6 JBS tumorceller i Balb /C-mus, tumorer udviklet og fik lov til at nå en størrelse på 1-2 cm

3, på hvilket stadium dyrene blev aflivet, og deres tumorer blev fjernet. Tumorerne blev homogeniseret i phosphatbufret saltvand (PBS) (Sigma, Irland) med en FastPrep FP120 homogenisator (Thermo Electron Corp., England). Homogenatet blev vasket grundigt ved centrifugering med PBS for at fjerne debris. Når supernatanten var makroskopisk klart homogenatet blev resuspenderet i PBS til en slutkoncentration på 0,2 g (vådvægt) pr ml. Dette blev alikvoteret og frosset indtil anvendelse. PBS kontrol var også alikvoteret og frosset. Ved anvendelse af en 18 Fr-stål-ball-tipped fodring nål fastgjort til en 1 ml sprøjte, un-bedøvede dyr var sondeernæring fodret 200 pi frisk optøet JBS tumor homogenat (40 mg tumor) eller PBS. Dyrene blev fodret dagligt i 14 dage. Mængden af ​​foder og varigheden af ​​fodring svarede til dem, der anvendes i tidligere offentliggjorte undersøgelser af vores gruppe og var baseret på en litteraturgennemgang, navnlig i forbindelse med undersøgelser, der undersøgte tolerance over for cellulære Ags [4], [14] – [17] . På dag 15 modtog dyrene en subkutan podning af tumorceller (2 × 10

6 celler) og blev overvåget for tumor udvikling dagligt.

Tumor Monitoring

Tumorer blev målt hver 48 timer ved hjælp af en digital skydelære. Tumor volumen blev beregnet ved hjælp af standardformlen

v

=

ab

2π /6 og tumor vækstkurver blev konstrueret. Musene blev humant aflivet i tilfælde, hvor tumoren nåede 1,5 cm

3 i diameter. I det første eksperiment blev mus fodret tumor Ag eller PBS, og vækst- og overlevelseskurverne blev fremstillet. I det andet eksperiment blev systemiske tregs enten permanent inaktiveret (benævnt forarmet) ved anvendelse af anti-CD25 Ab (klon PC61- Bio-Express, New Hampshire, USA), der midlertidigt depleteret under kun eller ikke udtømt fodring. I de sidste eksperiment musene blev fodret i 14 dage og efterfølgende randomiseret til at modtage anti-CD25 Ab eller en kontrol Ab konjugeret til anti-peberrodsperoxidase (HPRN), Bio-Express, USA til at overvåge effekten på sc tumorvækst.

flowcytometrianalyse

ACK erythrocyt lyseringsbuffer (0,15 M NH

4CL, 10 mM KHCO

3, 0,1 mM Na

2EDTA, pH 7,4 med HCI) blev fremstillet under anvendelse af reagenser købt hos Sigma-Aldrich, Irland. Opløsningen blev filtersteriliseret gennem et 0,2 pm filter og opbevaret ved 4 ° C. FACS-farvning puffer blev fremstillet ud fra Dulbeccos phosphatbufret saltvand (Dulbeccos PBS) købt fra Sigma sammen med, bovint serumalbumin (BSA), natriumazid og føtalt kalveserum. Milt og tumorvæv blev fjernet og hakket separat på 70 um nylon cellefilter (BD Biosciences, UK). Disse cellesuspensioner blev opsamlet, vasket i dyrkningsmedium, pelleteret ved 300 g i 10 minutter ved 4 ° C og blev derefter behandlet med ACK erythrocyt lyseringsbuffer i 3 minutter, hvorefter de blev vasket to gange og resuspenderet i FACS-farvning buffer. Levedygtige celler blev bestemt ved en standard trypanblåteksklusion test. Celler blev derefter fortyndet til en koncentration på ca. 2-4 × 10

6 per ml og 100 pi farvning puffer tilsat pr Falcon-rør (Becton Dickinson). Cellesuspensioner og reagenser blev holdt ved 4 ° C under fremstillingen.

celleoverflademarkør Analyse

phycoerythrin-Cy5 (PE-Cy5) konjugerede antistoffer mod murint CD25 og CD3, fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugerede antistoffer mod murint CD25, CD3, CD4 og CD8 og PE-anti-muse foxp3 farvningssæt blev indkøbt fra eBioscience, Insight Biotechnology, England. PE anti murine CD4 og CD3 blev indkøbt fra Serotec, Oxford, England. Fluorokromkonjugerede isotype farvning kontroller (FITC-IgG, PE-IgG2a og PE-Cy5 IgG isotypekontrol) blev købt fra eBioscience. Ukonjugeret anti-murine CD16 /CD32 (Fcy III /II) monoklonalt Ab (Fc-receptor blokerende Ab) blev købt hos Serotec.

For at minimere ikke-specifik binding Ab, anti-CD16 /CD32 Fc-receptor blokerende Ab blev fortyndet til 0,01 pg /pl i farvning puffer, 20 pi per brønd tilsat og inkuberet ved 4 ° C i 20 min. Fluorokromkonjugerede antistoffer mod celleoverflademarkører blev også fortyndet i henhold til producentens instruktioner og blev tilsat til hver prøve uden fjernelse af Fc-blokerende Ab. Celler blev inkuberet i mørke ved 4 ° C i 45 minutter og derefter vasket to gange i 250 pi farvning buffer inden resuspendering i 500 pi farvning puffer til umiddelbar analyse eller en fiksativ opløsning af 0,5% paraformaldehyd i Dulbeccos PBS. Analyse blev udført inden for 48 timer ved hjælp af en FACScaliber flowcytometer (Becton Dickinson, Oxford, Storbritannien) og analyseret af den medfølgende CELLQuest (BD Biosciences) computersoftware program.

In Vivo

Ab Administration

Som tidligere nævnt, anti-CD25 Ab (PC61) og kontrol Ab (isotypekontrol rotte IgG-HRPN) blev indgivet intra-peritonealy i en dosis på 1 mg /kg i et totalvolumen på 200 ul PBS . Timingen af ​​doser afhænger af eksperimentelle protokol, men når to doser skulle administreres de fik fire dages mellemrum (fig. 1). Dette resulterede i over 95% inaktivering af tregs som bestemt ved flowcytometri.

Indledende forsøg involverede mus, som blev depleteret for tregs under hele forsøget og blev nævnt som værende permanent udtømt. For forsøg med udtømning under tolerisering, treg udtømning kun opstod under tumor fodring og ikke når tumorer blev induceret. Den endelige protokol (udtømning indlæg tolerisering), der kræves oral tolerance skal etableres før treg udtynding.

Statistisk analyse

Forskellene mellem de enkelte grupper blev testet ved hjælp af to-sidede Students

t

-test for parrede værdier. Forskelle med

s Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante.

Resultater

Oral administration af tumor Tissue giver en Tumor Specifik Vækst Advantage

Vi har tidligere vist, at subkutane tumorer har en hurtigere vækstrate i mus, der blev fodret tumor før tumorinduktion, sammenlignet med mus, der blev fodret enten PBS eller en alternativ tumor (cARB eller CT26) [4], [13]. Vi har også påvist, at tumorvækst kurven i Balb /C-mus tilnærmer vækstkurven af ​​subkutan tumor i athymiske nøgne mus, som mangler fungerende T-celler, og disse mus blev anvendt som en immun inkompetent kontrol [13]. I denne undersøgelse under anvendelse af samme fodring protokol, vi valideret, at vores tumor fodring regime resulterede i en konsistent og signifikant øget subkutan tumor vækst i Balb /C mus i forhold kontrolgrupper. Subkutane tumorer i grupperne fodret JBS tumor optrådte tidligere (dag 5 versus dag 6/7) og voksede væsentligt hurtigere (p 0,05) (. Figur 2) ved flere tidspunkter Salg

vækstkurver for JBS tumorer. i mus efter gavage fodring i 14 på hinanden følgende dage med JBS tumor homogenat eller med PBS. JBS tumorer voksede betydeligt hurtigere i mus oralt tolerans med JBS. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnitlige tumorvolumen af ​​et panel af seks mus. Forskellen var statistisk signifikant (p 0,05) på dag 8, 9, 12 14 som angivet ved en stjerne på grafen.

Flowcytometrianalyse af lymfocytter som respons på tumoren indtagelse

Efter 14 dages oral tumor eller PBS administration, milt lymfocytpopulationer blev analyseret . Der var en signifikant stigning i CD4

+ CD25

+ celler (p 0,022) efter tumor administration versus PBS. Desuden var der en betydelig stigning observeret i CD25

+ /

foxp3

+ udtryk efter gating på CD3

+ CD4

+ population af lymfocytter (p 0,019) (Fig . 3). Der var ingen signifikant stigning i de samlede antal af CD3

+ CD4

+ eller CD3

+ CD25

+ -celler. Der var heller ikke nogen væsentlig stigning i CD8

+ CD25

+ teff undergruppe befolkninger efter tumoren fodring tidsplan. Der var ingen observerbar forskel i antallet eller forholdet mellem lymfocytpopulationer mellem de mus, der blev fodret PBS og dem ikke tvangsfodring-fodret i denne periode (data ikke vist).

(a) Dot plots viser antallet af perifert blod tregs i PBS (i-iv) eller JBS (v-, viii) fodret mus. Tregs blev farvet ved hjælp af CD3, CD4, CD25 og

foxp3

antistoffer konjugeret til fluorokromer og isotypekontroller og analyseret på flowcytometeret. Cellerne blev gated på CD3

+ og CD4

+ (ii og vi) og isotypekontroller (I og V) og senere dot plots blev erhvervet gennem denne port for CD25

+ og

foxp3

+ celler (IV og VIII) og isotypekontroller (III og VII). Der var en signifikant stigning i CD4

+ CD25

+ celler (p 0,022) efter tumor administration versus PBS. Desuden var der en betydelig stigning observeret i CD25

+ /

foxp3

+ udtryk efter gating på CD3

+ CD4

+ population af lymfocytter (p 0,019). (B) Graf, der repræsenterer de gennemsnitlige procentvise værdier af Treg numre minus isotypekontroller inden for den samlede lymfocyt befolkning perifert fra JBS eller PBS fodrede mus. Der var signifikant flere tregs i milt fra mus, der blev fodret homogeniseret tumor i 14 dage end dem fodret PBS alene (p 0,002; n = 6)

Øget Tumor Growth Rate er associeret med. Aktivitet af tregs

Vi har tidligere vist, at vores anti-CD25 Ab administration protokol letter 90% inaktivering af CD25

+ celler over en periode på 14 dage [8]. Musene blev randomiseret til at modtage enten anti-CD25 Ab ved påbegyndelsen af ​​den 14-dages fodring tidsplan, og igen i slutningen af ​​fodring (benævnt permanent udtømning) eller Ab på tidspunktet for påbegyndelse kun fodring (benævnt udtømning under tolerisering) eller kontrol Ab, eller ingen Ab (fig. 1).

de resulterende subkutan tumor vækstkurver viste, at den tidligere observerede tumorvækst fordel efter fodring var fraværende i mus gennemgår udtømningen under tolerisering tidsplan, med tid til tumor udseende og tumor vækst svarende til PBS-fodrede mus, hvilket indikerer kravet om tregs på tidspunktet for tumor fodring til induktion af oral tolerance (fig. 4a). Som det ses i fig. 4b, tumorer i mus, der modtog anti-CD25 Ab vinder svandt fuldstændigt, både i udtømning under tolerisering og permanente udtynding grupper. Vi, og andre, der tidligere har rapporteret opdagelsen af, at anti-CD25 administration før tumor induktion inducerer komplet tumorregression [8].

(a) Der var ingen signifikant forskel mellem tumor vækstrater mellem mus fodret tumor ( midlertidigt eller permanent) og kontrol mus. Mus der modtog ingen anti-CD25 Ab udtømning viste signifikant forskellige tumor vækstrater på dagen 14, 18 og 22, alt efter om de var blevet fodret tumor og saltvand (p 0,05). Hvert datapunkt repræsenterer betyde tumor henblik 10 mus. (B) Overlevelse kurve for mus, der var permanent, midlertidigt eller ikke udtømt under induktion af oral tolerance. Mus, der var permanent forarmet var 100% helbredt for deres subkutane tumor og forblev sygdomsfri på 100 dage. 75% af dem, der blev midlertidigt forarmet mens fodres tumor blev hærdet, medens 66% af dem, der blev midlertidigt forarmet og fodret PBS hærdet. Der var ingen signifikant forskel mellem de to grupper. Alle disse mus, som fik isotypekontrol Ab bukkede under for tumor byrde (n = 10).

Ændringer i Lymfocyt Sub-populationer observeret i Reaktion på Udtømning af tregs enten permanent eller Under Tolerisering

på forskellige tidspunkter, mus fra hver gruppe blev aflivet, og deres milte analyseret for systemisk CD4

+ CD25

+ Treg og CD8

+ CD25

+ teff numre. Tumor fodring signifikant øget systemiske Treg numre versus PBS fodret grupper, og denne forskel blev også set i anti-CD25 Ab indgivne mus (figur 5a.) (P 0,01). Mens der var betydeligt lavere antal af tregs i PBS-fodrede grupper, der fik anti-CD25 Ab end dem, der fik kontrol Ab (Fig 5b.) (P 0,05), overraskende, en reduktion i den samlede Treg numre blev ikke fundet i anti- CD25 Ab, tumor-fodrede mus.

(a) Celler blev farvet for CD3, CD4 og CD25. Cellerne blev oprindeligt gated på CD3 og efterfølgende på CD4

+ CD25

+. Milt tregs blev analyseret fra mus, som var blevet behandlet med (i) isotypekontrolantistof efterfulgt af PBS fodring; (Ii) midlertidigt udtømt med anti-CD25-antistof, men PBS Fed (iii) permanent udtømt med anti-CD25-antistof og PBS fodret; (Iv) isotypekontrolantistof behandling og tumor fodret, (v) midlertidigt depleteret med anti-CD25, men tumor fodret eller (vi) permanent udtømt og tumor fodret. Repræsentative dot plots fra relevante grupper vises, tre mus fra hver behandlingsgruppe blev analyseret; (B) graf, som repræsenterer de gennemsnitlige data fra dot plots i (a). Der er en signifikant forskel mellem disse mus, som blev tumor fodrede eller PBS fodrede og permanent forarmet med anti-CD25 (p 0,01), udtømning under tolerisering mens PBS eller JBS Fed (p 0,001), kontrol Ab, tumor fodret versus kontrol Ab PBS fodret (p 0,01). Der var en signifikant forskel mellem de mus, der blev behandlet med kontrol Ab eller PBS fodres og dem, der blev behandlet med anti-CD25 Ab til enhver tid og PBS fodrede, (p 0,05). Der var ingen signifikant forskel i tregs mellem nogen af ​​de mus, der blev fodret tumor tværs behandlingsgrupperne.

Vi undersøgte også virkningen af ​​oral tolerance og anti-CD25 Ab på systemiske aktiverede effektor lymfocytpopulation , nemlig CD8

+ CD25

+ -celler. Der var en stigning i antallet af teff celler, som blev permanent forarmet og fodres tumor sammenlignet med alle andre grupper (fig. 6), og denne værdi blev nærmer betydning.

(a) Milte fra mus i hver behandlingsgruppe blev farvet for at bestemme CD3

+ /CD8

+ og CD3

+ /CD25

+ numre. Grupper var som følger (i) tumor fodret men intet antistof udtømning; (Ii) PBS fodret og intet antistof udtømning; (Iii) PBS tilført og anti-CD25 behandlede og (iv) tumor fodret, anti-CD25 behandles. CD8

+ og CD25

+ blev undersøgt inde fra CD3

+ befolkning. Hvert forsøg blev udført tredobbelt; (B) Graf, der repræsenterer ændringerne i teff numre efter tumor fodring og Ab udtynding. Kumulative data fra dot plots repræsenteret i (a) (n = 3).

Anti-CD25 Ab Terapi Post-tumor Fodring overvinder de Induceret Oral Tolerance

For at afgøre, om anti- CD25 Ab terapi kan ophæve en etableret tumorvækst fordel, blev mus, der var tilbagelagt den orale tumor fodring tidsplan tilfældigt opdelt i grupper, der modtager anti-CD25 Ab versus kontrol Ab eller ingen Ab (PBS alene). Administration af anti-CD25 Ab umiddelbart efter tumor fodring, fjernede den tidligere observerede tumorvækst fordel (fig. 7a). Dette viste sig at være væsentlige sammenlignet med de andre grupper (p lt; 0,03). Overlevelsesdata viste, at 100% af mus, som modtog anti-CD25 Ab blev hærdet, en kur sats svarende til den gruppe af mus ikke fodret tumor og efterfølgende behandlet med anti-CD25 Ab (fig. 7b).

( a) Mus blev fodret tumor eller PBS og randomiseret til anti-CD25 Ab, isotypekontrol Ab eller PBS. Dem, som modtog anti-CD25 Ab havde langsommere tumorvækst sats sammenlignet med de andre grupper. Den store forskel i væksthastighed mellem dem, der var tumor eller PBS fodret blev opretholdt i isotypekontrol-Ab og ingen Ab grupper i visse tidspunkter (p 0,05); (B) mus, som blev tolerabel til tumorantigen ved oral administration af tumor blev efterfølgende behandlet med anti-CD25 Treg depletion behandling og blev hærdet af deres subkutane tumor resterende tumorfri i mindst 100 dage.

Treg tal i Hærdede Mus

Den anti-CD25 Ab behandling ikke har langsigtede virkninger på Treg numre. Mus helbredt for deres tumorer gennem anti-CD25 administration blev undersøgt 30 dage senere og havde lignende Treg numre til naive dyr, uanset om de var fra oralt tolerans eller kontrolgrupper (fig. 8).

Et hundrede og tredive dage efter at være behandling med anti-CD25-antistof, blev mus aflivet, og deres milte farvet for CD4

+ CD25

+ tregs. Der var ingen signifikante forskelle set i procentdelen af ​​CD4

+ CD25

+ celler mellem disse mus, der havde helbredt for deres tumor eller naive mus (n = 3 per gruppe).

diskussion

de fleste patienter, der udvikler kræft i øvre mave die-tarmkanalen som en direkte følge af deres sygdom. Selv for dem med klinisk lokaliserede tumorer, der er udsat for helbredende operation, de fem år tilbagefald er normalt over tres procent [18]. På tidspunktet for kirurgi, de fleste af disse patienter har mikrometastaser i forskellige væv indikerer hæmatogen spredning af cancer på et tidligt stadium af tumorudvikling. Dette efterlader patienter i en minimal sygdomstilstand post-kirurgisk behandling. En terapi, der kan lette immunsystemet til at identificere tumor Ags systemisk ville være ideelt, hvis ikke at rydde alle af sygdomsbyrden, så i hvert fald til at skabe en tilstand af tumor vækstdvale [19], [20].

Vi har tidligere vist, at væksten i svagt immunogent JBS cellelinje i flanken af ​​immun kompetente mus førte til en stigning i Treg celleantal i tumoren miljø, men ikke systemisk [8]. I denne undersøgelse har vi modelleret tilstedeværelsen af ​​tumorfragmenter i tarmen til den kliniske situation ved gavage fodring af JBS celler til mus. Vi forventer disse fragmenter, der skal behandles af GALT og ville føre til en systemisk hypo-respons over for tumor Ags [13]. Vi har vist for første gang, at CD4

+ CD25

+ tregs systemisk øges som reaktion på oral administration af hele (JBS) tumor. Derudover har vi vist, at induktionen af ​​oral tolerance over for en tumor giver en vækstfordel til kræft.

Mus hvis tregs blev udtømt ved anti-CD25 behandling uanset tumor eller PBS fodring, demonstrerede regression af tumorer og langsigtede helbredelsesmetoder. Der var ingen forskelle i responsrater mellem tumor fodret og kontrolgrupper indikerer, at Treg hæmning effektivt overvinder de kombinerede orale tolerance og tumor vækst påvirkninger. Det er sandsynligt, at den tidlige induktion af tregs på det systemiske niveau, opnået i denne undersøgelse inden tumor fodring, er ansvarlig for tumorvækst fordel observeret. Det er af interesse, at der ikke var forskelle i antallet af CD8

+ T-celler mellem nogen af ​​grupperne antyder, at en reduktion i Teffs ikke forekommer med oral tolerance-induktion. Det er også sandsynligt, at oral tolerance og tidlige Treg reaktioner ikke hæmme immun sensibilisering til tumoren, men hæmmet effektorfunktion da der ikke var nogen forskel i timingen eller fuldstændigheden af ​​tumorregression efter Ab behandling mellem tumoren fodret tolerans eller PBS kontrolgruppe af mus. Der var en signifikant forskel i det samlede antal af CD4

+ CD25

+ tregs i mus, som modtog anti-CD25 Ab og var tumor fodres og kontrol saltvand fodret grupper. Dette blev også observeret i de grupper, der midlertidigt blev forarmet. Overraskende var der imidlertid ingen signifikant nedgang i tregs observeret mellem grupperne, der blev tumor fodret og modtog enten en doseringsplan af anti-CD25 Ab eller isotypekontrol-Ab. En mulig forklaring på dette kan skyldes analyse af Treg tal ved hjælp af CD4

+ CD25

+ kun på dette stadium af den eksperimentelle proces i modsætning til den mere specifikke CD4

+ CD25

+

foxp3

+. Ingen signifikant fald i tregs kan faktisk involvere forsøgsprotokollen og tidsplanen for undersøgelse af tregs og dosis af anti-CD25Ab, der blev valgt baseret på vores tidligere viden, at maksimum treg udtømning var inden for 7 dage Ab administration. Dosis af Ab anvendt i denne undersøgelse sikret en 90% reduktion i Treg numre hos naive mus. Den samlede stigning i Treg numre som reaktion på fodring blev ikke taget i betragtning, med en øget dosis af Ab. På trods af dette, blev der observeret funktionelle forskelle mellem forskellige doser af anti-CD25 Ab i de resulterende vækstkurver, hvilket tyder CD4

+ CD25

+ Treg celler er involveret i T-celle-respons, som giver tumorvækst fordel efter fodring. Dette kan skyldes den kendsgerning, at virkningen af ​​fjernelse eller funktionelt inaktivering tregs med Ab udtynding under udviklingen af ​​oral tolerance er nok til at give mulighed for delvis uddannelse af immunsystemet og udviklingen af ​​anti-tumor cytotoksiske responser. Interessant nok var flere helbredelser set i de grupper, der blev givet anti-CD25 Ab på tidspunktet for fodring kun og fodres tumor (75%) end hos dem Ab på tidspunktet for fodring og fodret PBS (60%). Det kan være, at Ag lastning med fodring og efterfølgende inaktivering af tregs giver anledning til øget teff numre kunne have fundet sted, og lignende resultater er blevet demonstreret andetsteds [21].

I klinikken, patienter med GALT stede med en allerede oralt tolerabel immunsystemet, og det er endnu ikke fastslået, om oral tolerance kan overvindes efter at der er etableret tumorvækst. I undersøgelser af tolerance, er det blevet vist, at adoptiv overførsel af tregs i murine modeller kan overvinde immunmedieret sygdom [5]. I denne undersøgelse har vi undersøgt, om fjernelsen af ​​tregs kan muliggøre udviklingen af ​​en cytotoksisk T-celle respons på en subkutan tumor. Efter fodring af tumor og etablering af oral tolerance, en enkelt doseringsplan af anti-CD25 Ab fjernet tumorvækst fordel, der normalt ville blive set i fraværet af anti-CD25 Ab behandling. Desuden er administration af anti-CD25 Ab medførte hærder i alle mus, der huser subkutane tumorer. Vi har vist, at selv en etableret oral tolerance til en tumor Ag, og den resulterende aggressive tumorvækst og dårligere overlevelse, kan overvindes ved Treg svækkende terapi. Dette resultat antyder, at kræft i den øvre mavetarmkanal ville kunne godtage terapier, der forsøger at inaktivere etableret Treg celleaktivitet. Det er også vigtigt at bemærke, at anti-CD25 Ab terapi ikke påvirkede de systemiske Treg befolkninger i behandlede mus efter behandlingen sammenlignet med naive mus. Dette er vigtigt, da det begrænser muligheden for, at anti-CD25 Ab terapi af autoimmune sygdomme kunne fjerne tregs helt eller permanent

Resultaterne af denne undersøgelse tyder på en mekanisme for tolerance -. En T-celle-medieret suppression af en antitumor immunrespons. har endnu ikke fastslået identiteten af ​​tumoren Ag (s); Men denne undersøgelse bekræfter og udvider på observationer af tidligere rapporter, hvor fodring af tumor Ags blev vist at forringe antitumor cytotoksicitet og dermed understøtter den hypotese, at tumor Ags som er udgydt i den øvre mave-tarmkanalen og behandles af slimhindeimmunsystemet kan resultere i ned