PLoS ONE: RNA Binding Protein CUGBP2 /CELF2 medierer Curcumin-induceret Mitotisk Catastrophe af kræft i bugspytkirtlen Cells

Abstrakt

Baggrund

Curcumin hæmmer væksten af ​​kræft i bugspytkirtlen tumorxenoplantater i nøgne mus; imidlertid er virkningsmekanismen ikke godt forstået. Det bliver stadig mere tydeligt, at RNA-bindende proteiner regulerer posttranskriptionel genekspression og spiller en afgørende rolle i RNA stabilitet og oversættelse. Her har vi konstateret, at curcumin modulerer ekspressionen af ​​RNA-bindende protein CUGBP2 at hæmme bugspytkirtlen kræft vækst.

Metodologi /vigtigste resultater

I denne undersøgelse viser vi, at curcumin behandlet tumorxenoplantater har en signifikant reduktion i tumorvolumen og angiogenese. Curcumin hæmmede proliferation, mens fremkalde G2-M anholdelse og apoptose resulterer i mitotisk katastrofe af forskellige bugspytkirtelkræftceller. Dette blev yderligere bekræftet ved øget fosforylering af checkpoint kinase 2 (Chk2) protein kombineret med højere niveauer af nukleare cyklin B1 og CDC-2. Curcumin øgede ekspressionen af ​​cyclooxygenase-2 (COX-2) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) mRNA, men protein niveauer var lavere. Endvidere curcumin øgede ekspression af RNA-bindende proteiner CUGBP2 /CELF2 og TIA-1. CUGBP2 binding til COX-2 og VEGF-mRNA blev også forbedret, og derved øge mRNA-stabilitet, halveringstiden skifter fra 30 min til 8 timer. På den anden side, lyddæmper-medieret knockdown af CUGBP2 delvist gendannet ekspressionen af ​​COX-2 og VEGF selv med curcumin behandling. COX-2 og VEGF mRNA-niveauer blev reduceret til at kontrollere niveauet, mens proteiner var højere.

Konklusion /Betydning

Curcumin hæmmer pancreas tumor vækst gennem mitotisk katastrofe ved at øge ekspressionen af ​​RNA-bindende protein CUGBP2, og derved hæmmer translationen af ​​COX-2 og VEGF-mRNA. Disse data tyder på, at oversættelsen hæmning er en ny virkningsmekanisme for curcumin under terapeutisk intervention af pancreascancer

Henvisning:. Subramaniam D, Ramalingam S, Linehan DC, Dieckgraefe BK, Postier RG, Houchen CW, et al . (2011) RNA Binding Protein CUGBP2 /CELF2 medierer Curcumin-induceret Mitotisk Catastrophe af bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 6 (2): e16958. doi: 10,1371 /journal.pone.0016958

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Oktober 14, 2010; Accepteret: 18 januar 2011; Udgivet: 11 februar 2011

Copyright: © 2011 Subramaniam et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af NIH giver DK062265, CA109269 og CA135559. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af de fremskridt inden for molekylær patogenese, bugspytkirtelkræft er fortsat et stort uløst sundhedsproblem i USA [1]. Kræft i bugspytkirtlen er en hurtigt invasiv, metastatisk tumor, der er resistent over for standardbehandling [2], [3]. På nuværende enkeltstof kemoterapi (fx Gemcitabin) er grundpillen behandling for metastatisk adenokarcinom i pancreas. Gemcitabin behandling har en tumor svarprocent på under 10%; tilsvarende ingen af ​​de tilgængelige nuværende kemoterapeutiske midler har en objektiv responsrate på over 10% [4], [5]. For nylig lægemiddelkombinationer med gemcitabin også blive undersøgt, men det er for tidligt at sige, om de er klinisk overlegen. Ikke desto mindre er omfanget af dette problem bemyndiger behov for nye terapeutiske midler.

Epidemiologiske undersøgelser antyder, at kosten spiller en stor rolle i forebyggelsen af ​​mange cancerformer. Curcumin, en aktiv bestanddel i krydderiet gurkemeje, har vist anti-tumor effekt i prækliniske undersøgelser [6], [7]. Anti-tumor egenskaber af curcumin omfatter hæmning af tumorvækst og induktion af apoptose [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . kliniske Pilot fase I forsøg har vist, at curcumin er sikker, selv når de indtages med en daglig dosis på 12 g i 3 måneder [17], [18], [19]. En seneste fase I /II undersøgelse viste, at kombinationsbehandling ved anvendelse 8 g oralt curcumin dagligt med gemcitabin var sikkert og muligt for patienter med kræft i bugspytkirtlen berettiger yderligere undersøgelse af dets effektivitet [20].

De anti-tumor egenskaber af curcumin er blevet tillagt, i det mindste delvis, til dets evne til at inhibere ekspressionen og aktiviteten af ​​cyclooxygenase-2 (COX-2) [21], [22]. Det er et hastighedsbegrænsende enzym i den arachidonsyre til prostaglandin syntesevejen. Proteinet overudtrykt i inflammation og i en række forskellige cancere. I pancreascancer, er COX-2 overexpresssion forbundet med hæmning af apoptose, øget tumorindtrængen, og fremme af angiogenese. Den CELF (CUGBP-ETR3-lignende faktorer) familie af RNA-bindende proteiner består af seks medlemmer, der er involveret i forskellige cellulære processer, herunder mRNA splejsning, redigering, stabilitet og oversættelse [23]. Et af medlemmerne, CUGBP2 (også kendt som CELF2, ETR3, BRUNOL2, Napor2) udtrykkes ubikvitært, om end på højere niveauer i muskelceller [24], [25]. I tidligere undersøgelser har vi vist, at når CUGBP2 overudtrykkes, cellerne undergår mitotisk katastrofe [26], [27]. Vi har også påvist, at CUGBP2 kan binde til AU-rige sekvenser i den 3′-utranslaterede region af COX-2-mRNA og forøge stabiliteten af ​​mRNA’et, mens inhibere dets oversættelse [28]. Hur, er et tilknyttet RNA-bindende protein med strukturel lighed med CUGBP2 derimod impliceret i stigende COX-2-mRNA stabilitet og forbedre dets oversættelse ved binding til de samme AU-rige sekvenselementer [29]. En tredje RNA-bindende protein, der fungerer som en post-transkriptionel regulator af genekspression ved at anerkende U-rige sekvens i RNA er TIA-1 (T-celle-begrænset intracellulært antigen-1). TIA-1 er blevet vist at inhibere mRNA-translation under forhold med miljømæssige stress [30], [31]. I denne artikel har vi fastslået effekten af ​​curcumin på ekspressionen af ​​RNA-bindende proteiner i bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr blev håndteret i nøje overensstemmelse med god dyr praksis som defineret af de relevante nationale og /eller lokale dyrevelfærd organer, og alle dyr arbejde blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (protokol # 07-009) af University of Oklahoma Health Sciences center.

celler og reagenser

AsPC-1, MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3 mennesker og Pan02 muse bugspytkirtlen kræftceller (alle fra American Type Culture Collection, Manassas, VA) blev dyrket i RPMI 1640 indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) og 1% antibiotisk-antimycotisk opløsning (Mediatech Inc., Herndon, VA) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2. Curcumin blev købt fra LKT Laboratories, St. Paul, MN.

celleproliferation og apoptose analyser

For at vurdere spredning, celler blev podet på plader med 96 brønde og dyrket natten over. Cellerne blev derefter behandlet med stigende doser af curcumin i RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS. Analyse af celleproliferation blev udført ved enzymatisk assay [32]. For apoptose blev caspase 3/7 aktivitet målt ved anvendelse af Apo-one Homogen caspase-3/7 Assay kit (Promega, Madison, WI).

Kolonidannelse assay

Kort fortalt 6 brønd Skålene blev podet med 500 levedygtige celler og lodes vokse i 24 timer. Cellerne blev derefter inkuberet i nærvær eller fravær af forskellige koncentrationer af curcumin i op til 48 timer. Den curcumin-holdige medium blev derefter fjernet, og cellerne blev vasket i PBS og inkuberet i yderligere 10 d i komplet medium. Hver behandling blev udført tre gange. De opnåede kolonier blev vasket med PBS og fikseret i 10% formalin i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter vasket med PBS efterfulgt af farvning med hæmatoxylin. Kolonierne blev talt og sammenlignet med ubehandlede celler.

Cell cyklus analyser Salg

Celler blev behandlet med curcumin i 12 timer og 24 timer, og derefter trypsinbehandlet og suspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS). Single-cellesuspensioner blev fikseret under anvendelse af 70% ethanol i 2 timer, og efterfølgende permeabiliseret med PBS indeholdende 1 mg /ml propidiumiodid (Sigma-Aldrich), 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) og 2 ug DNase-frit RNase (Sigma-Aldrich) ved stuetemperatur. Flowcytometri blev gjort med en FACSCalibur analysator (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), opfange 50.000 begivenheder for hver prøve. Resultaterne blev analyseret med ModFit LT ™ software (Verity Software House, Topsham, ME).

Real Time Reverse-transskription polymerasekædereaktion Analyse

Total RNA isoleret fra MiaPaCa-2, Pan02 celler og tumorxenografter vha TRIZOL-reagens blev revers transkriberet med Superscript II revers transkriptase i nærvær af tilfældige hexanukleotid-primere (alle fra Invitrogen, Carlsbad, CA). Komplementære DNA’er blev derefter anvendt til Real time PCR under anvendelse Jumpstart Taq DNA-polymerase (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) og SYBR Green nucleinsyrefarve (Molecular Probes, Eugene, OR). Crossing tærskelværdier for de enkelte gener blev normaliseret til p-Actin. Ændringer i mRNA-ekspression blev udtrykt som gange ændring i forhold til kontrol. Primere anvendt i denne undersøgelse var som følger: β-Actin: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ‘og 5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGCG-3′; COX-2: 5’-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ‘og 5′-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′; VEGF: 5’-AGCGCAAGAAATCCCGGTA-3 ‘og 5′-TGCTTTCTCCGCTCTGAGC-3′; Hur: 5′-GTGAACTACGTGACCGCGAA-3’and 5’-GACTGGAGCCTCAAGCCG-3 ‘; CUGBP2: 5’-TGCTTCAACCCCCAACTCC-3 ‘og 5′-GTCCTTGCAGAGTCCCGAGA-3′; TIA-1: 5’-ACCCATCTGTTGAATGGCGT-3’and 5’GGCAACAGGAAAGTCTAAGGGAT-3 ‘; Cyclin D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ‘og 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3’

RNA Stability assay

Celler blev behandlet med curcumin i 2 timer.. Actinomycin-D (10 ug /ml slutkoncentration), en potent inhibitor af mRNA-syntese blev tilsat til cellerne, og totalt mRNA blev ekstraheret ved 0-8 timer. RNA blev underkastet Real time PCR som beskrevet ovenfor. Dataene er angivet som forhold til kontrol celler, på tidspunktet for tilsætning af actinomycin D.

Western blot-analyse Salg

Cellelysater blev underkastet polyacrylamidgelelektroforese og blottet på Immobilin polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore , Bedford, MA). Antistoffer blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Abcam Inc (Cambridge, MA) og Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA) og specifikke proteiner blev detekteret ved den forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .

immunopræcipitation

For immunopræcipitation blev cellerne fikseret med 1% formalin. Lysater blev fremstillet og immunudfældet med anti-CUGBP2 antistof. Pelleten og supernatanten blev efterfølgende inkuberet ved 70 ° C i 1 time for at vende tværbindingerne, og RNA blev oprenset og underkastet RT-PCR til at bestemme COX-2 og VEGF mRNA-niveauer.

siRNA

Sequence rettet mod CUGBP2 mRNA 5′-GCAAACCUUACUGAUCCUA-3 ‘(accessionsnr mumber ns. NM_001025076) og en scrambled kontrol siRNA som ikke matcher nogen af ​​de humane gener blev opnået fra Ambion Inc., Texas, USA og transficeret med siPORT transfektionsreagens (Ambion).

Pan02 xenotransplantattumorer

Fem uger gamle mandlige athymiske nøgne mus købt hos Jackson Laboratories blev anvendt til

in vivo

eksperimenter. Musene blev opretholdt med vand og standard mus chow

ad libitum Hoteller, som anvendes i protokoller godkendt af universitetets Animal Studies Udvalg. Dyr blev injiceret med 1 x 10

6 Pan02 celler i venstre og højre flanke og fik lov til at danne xenotransplantater. En uge efter plantning cellerne og efter iagttagelse af tilstedeværelsen af ​​en håndgribelig tumor, curcumin (200 ug /kg legemsvægt) i 5% Na

2 HCO

3 puffer alene blev administreret intraperitonealt dagligt i 23 d. Tumorstørrelse blev målt ugentligt. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev dyrene aflivet, og tumorerne blev fjernet, vejet og forberedt til brug i histologi (hæmatoxylin eosin, COX-2, VEGF, og CD31) og genekspression studier

. immunocytokemi og immunohistokemi

Celler blev udpladet på at dækglasset og fik lov at vokse i 24 timer. Cellerne blev derefter fikseret med 10% bufret formalin i 10 minutter og derefter vasket med PBS. Cellerne blev derefter permeabiliseret med PBS indeholdende 0,5% Triton X-100 i 10 min. Dækglassene blev inkuberet med kanin-anti-cyclin B1 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) og kanin-anti-cdc2-antistoffer (Abcam Inc., Cambridge, MA) efterfulgt af biotinyleret anti-kanin IgG. Objektglassene blev yderligere behandlet under anvendelse Vectastatin ABC-kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) efterfulgt af DAB-farvning.

Væv indlejret i paraffin blev skåret til en sektion af 4 uM, afparaffiniseret og behandlet med citratbuffer. Derefter blev de blokeret med Avidin /biotin i 20 min. Objektglassene blev inkuberet med anti-COX-2 eller VEGF eller CD31 eller Hur eller CUGBP2 eller TIA-1 eller cyklin D1 natten over ved 4 ° C. Næste objektglassene blev behandlet med det sekundære antistof, såsom HRP ged anti-kanin til efterfølgende COX-2, VEGF, Hur CUGBP2, TIA-1, og cyclin D1-farvning. For CD31staining gede-anti-rotte blev HRP udnyttet. Hvert sekundært antistof blev inkuberet i en time og derefter fremkaldt med DAB (Sigma-Aldrich). Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxylin.

Statistisk analyse

Alle værdier er angivet som middelværdi ± SEM. Dataene blev analyseret ved anvendelse af en uparret 2-halede t-test. En

P

værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Curcumin hæmmer tumorvækst i Pan02 tumorxenoplantater og angiogenese

Til at begynde at evaluere rolle curcumin på tumorproliferation

in vivo

undersøgte vi evnen af ​​curcumin til at undertrykke væksten af ​​muse pancreas cancer cell xenografter i nøgne mus. Kræft i bugspytkirtlen celle inducerede xenotransplantattumorer fik lov til at udvikle sig og vokse til en størrelse på 200 mm

3 hvorefter curcumin blev administreret intraperitonealt i tre uger dagligt. Curcumin inhiberede signifikant væksten af ​​tumorxenotransplantater (fig. 1a). Det udskårne tumorer fra kontroldyr varierede fra 700 til 800 mg, mens der blev behandlet med curcumin vejede mindre end 400 mg (fig. 1B). Desuden blev tumorvolumen signifikant nedsat (fig. 1A). Der var ingen synlig ændring i levervægt, milt vægt eller kropsvægt i dyrene (data ikke vist). Disse data indebærer, at curcumin er et potent terapeutisk middel til behandling af pancreascancer, og er relativt ikke-toksiske for mus. Vi bestemt også virkningen af ​​curcumin på tumorvaskularisering ved farvning for endotel specifikt antigen CD31. Som vist i figur 1C, curcumin behandling betydeligt nedsat CD31-farvning og udvisket tumorkar tyder nedsat angiogenese. Vi beregnede også mikrokar tæthed og fundet det at være faldet betydeligt efter curcumin behandling (fig. 1D).

(A) Nude mus, der bærer Pan02 celle tumorxenoplantater i flankerne blev administreret curcumin intraperitonealt i 3 uger. Der var en signifikant reduktion i tumorstørrelse fra curcumin-behandlede dyr sammenlignet med ubehandlede kontroller (* p 0,05). (B) curcumin behandling resulterede i signifikant lavere tumor vægt i forhold til kontroller (* p 0,05). (C) Tumor snit blev farvet for CD31, en endotelcelle specifik overflademarkør og med hematoxylin og eosin (H 0,05)

Curcumin hæmmer kræft i bugspytkirtlen cellevækst

For at bestemme den mekanisme af curcumin-. medieret vækst anholdelse, vi studerede bugspytkirtelkræftceller

in vitro

. Til dette brugte vi fem forskellige dyrkede cellelinier MiaPaCa-2, Panc-1, aspC-1, BxPC-3 og Pan02. Curcumin undertrykte signifikant spredning af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer MiaPaCa-2, Pan02, AsPC-1, BxPC-3 og Panc-1 i en dosis og tidsafhængig måde. Denne anti-spredning effekt på tumorceller blev set inden for en 24 timers periode, der fortsatte med at stige betydeligt i løbet af den næste 72 timer (fig. 2A). For at bestemme den langsigtede virkning af curcumin behandling blev celler behandlet med 30 pM curcumin i 24 timer, hvorefter cellerne fik lov til at vokse i normal medier. Curcumin behandling undertrykt kolonidannelse i alle pancreascancer cellelinier (fig. 2B), hvilket antyder, at curcumin virkning på tumorcellerne var irreversibel. Cyclin D1 er en cellecyklus regulatorisk protein, der regulerer G1 til S-faseovergangen af ​​cellecyklussen og fungerer som en cofaktor for adskillige transkriptionsfaktorer [33]. Cyclin D1 overekspression har været knyttet til udviklingen og progressionen af ​​kræft [34]. I begge MiaPaCa-2 og Pan02 celler, curcumin behandling resulterede i reduceret cyclin D1-ekspression efter 24 timer (fig. 2C, D). Endvidere cyclin A2, som regulerer S /G2 progression, blev nedreguleret potentielt aftagende progression af celler ud af S-fasen (data ikke vist).

(A) Curcumin inhiberer proliferation af bugspytkirtelkræftceller. MiaPaCa-2, blev Pan02, AsPC-1 og BxPC-3-celler inkuberet med curcumin (1-50 uM) i op til 72 timer. Celleproliferation blev analyseret under anvendelse hexosaminidase-enzymaktivitet. Curcumin behandling resulterede i en signifikant dosis-og tidsafhængig formindskelse i celleproliferation i alle celler i sammenligning med ubehandlede kontroller. (B) Curcumin inhiberer kolonidannelse. MiaPaCa-2 og Pan02 celler blev inkuberet med 30 pM af curcumin i 24 timer og kolonierne fik lov til at danne ved inkubering i regelmæssige medier indeholdende 10% FBS i yderligere 10 d. Behandling med curcumin hæmmede kolonidannelse. En repræsentant for tre uafhængige forsøg er vist. (C) Ekspression af cyclin D1 undertrykkes ved 24 timer. RNA fra MiaPaCa-2 og Pan02 celler inkuberet med 30 pM curcumin blev underkastet Real time PCR for cyclin D1-mRNA-ekspression. Der var signifikant undertrykkelse af mRNA’et ved 24 timer, men ikke ved 12 timer (* p 0,05). (D) Lysater fra MiaPaCa-2 eller Pan02 inkuberet med 30 pM curcumin blev analyseret ved Western blotting for cyclin D1 ekspressionsniveauer. Curcumin behandling hæmmer cyclin D1 mRNA og protein-ekspression.

Curcumin inducerer G2-M cellecyklusstop før mitotisk katastrofe

Vi næste afgøres, om curcumin påvirker cellecyklusprogression og konsekvensen af ​​dette effekt. Curcumin induceret vækst anholdelsen af ​​den MiaPaCa-2 inden 24 timer på G

2 M etape (fig. 3A). Lignende resultater blev observeret i Panc-1 og Pan02 celler (data ikke vist). Curcumin er kendt for at inducere apoptose i forskellige cancerceller. Caspase-3 og 7 er centrale effektormolekyler vides at inducere apoptose i forskellige cancerceller ved at amplificere signalet fra initiator-caspaser, såsom caspase 8 eller caspase 10 [35], [36]. Capsase 3 og 7 blev øget inden for 24 timer i MiaPaCa-2-celler linjeflyvningserfaring behandlet med curcumin tyder induktionen af ​​apoptose (fig. 3B). Western blot-analyser af MiaPaCa-2 og Pan02 cellelysater viste en signifikant stigning i den aktiverede caspase-3 i curcumin behandlede celler (fig. 3B indsat). Disse data antyder, at curcumin behandlet tumorceller undergår apoptose. At afgøre, om en anholdelse i G2 fase eller manglende progression til mitose bidrager til det højere niveau af celler ses i G

2 M fase, vurderede vi udtrykket, og lokalisering af cyklin B1 og serin /thereonine kinase Cdc- 2. Cyclin B1 /CDC-2-komplekset spiller en væsentlig rolle i G

2 M faseovergang af cellecyklussen. For at inducere mitose, cyclin B1 og CDC-2 heterodimerisere og lokalisere til kernen, hvilket igen aktiverer de enzymer, der regulerer chromatinkondensering, opdeling kernemembranen og mitose specifik mikrotubulus reorganisering [37], [27]. Immuncytokemisk analyse viste signifikant højere nukleare niveauer af både cyclin B1 og CDC-2 i curcumin-behandlede celler antyder, at curcumin behandlede celler undergår mitotisk katastrofe (fig. 3C). Ud over dette, western blot analyse viste øget ekspression af både cyclin B1 og CDC-2 i curcumin behandlede celler og phosphorylering af Chk2 kinase i både MiaPaCa-2-celler i kultur og Pan02 tumor xenograft væv (fig. 3D). Eftersom cellerne undergår apoptose samtidig, at de var i G2-M standsning, tyder på, at curcumin inducerer cellerne til at undergå mitotisk katastrofe.

A) cellecyklus profiler af MiaPaCa-2-celler behandlet med curcumin i 12 timer og 24 timer og blev bestemt ved flowcytometri under anvendelse propidiumiodid farvning for DNA-indhold. Curcumin behandling signifikant forøget celler i S og G

2 M fase af cellecyklussen inden 12 timer. (B) Curcumin behandling inducerer apoptose. MiaPaCa-2 og Pan02 celler inkuberet med 30 pM af curcumin blev analyseret for apoptose ved caspase 3/7 aktivering. Curcumin behandling øget antallet af celler, som undergår apoptose sammenlignet med ubehandlede kontroller (* p 0,05). (Indsat) Curcumin inducerer caspase 3, en apoptose mægler. Lysater fra MiaPaCa-2 eller Pan02 celler inkuberet med 30 pM curcumin blev analyseret ved Western blotting for caspase 3 protein. Curcumin behandlede celler viser spaltet (aktiveret) caspase 3, mens ubehandlede celler har ingen spaltede caspase-3. (C) Curcumin behandling øgede niveauer af cyclin B1, CDC-2 og phosphoryleret checkpoint kinase Chk2. Lysater fra curcumin behandlet MiaPaCa-2-celler (til venstre) og Pan02 tumorxenoplantater (til højre) blev analyseret ved western blotting for phospho Chk2, og cyklin B1 og CDC-2 protein ekspressionsniveauerne. Curcumin behandling phosphorylerer checkpoint kinaser og øgede niveauer af cyklin B1 og CDC-2 i både MiaPaCa-2 celler og Pan02 tumorxenoplantater. (D) Curcumin behandlingsresultater i nukleare lokalisering af cyklin B1 og CDC-2. Immuncytokemi af curcumin behandlet med MiaPaCa-2-celler både cyclinB1 og CDC-2-proteinniveauer var overvejende i kernen sammenlignet end ubehandlede celler. Phosphorylering af Chk2, kombineret med øget ekspression og nuklear translokation af cyklin B1 og CDC-2 demonstrerer mitotisk progression af celler.

Curcumin hæmmer COX-2 og VEGF udtryk mens fremkalde CUGBP2 og TIA-1

COX-2 spiller en væsentlig rolle i carcinogenese, herunder øget invasionsevne, fremme af angiogenese og resistens over for apoptose [38]. Vi bestemt derfor sit udtryk i tumorxenoplantater. Real time PCR-analyser viste, at COX-2-mRNA-ekspression var signifikant lavere i curcumin behandlet tumorxenoplantater sammenlignet med kontroltumorer (Fig. 4A). Dette blev yderligere bekræftet ved Western blot og immunhistokemi analyser, hvor lavere niveauer af COX-2-protein blev observeret i curcumin-behandlede væv (fig. 4B, C). Prostaglandiner og de andre tumor promotorer er kendt for at inducere ekspressionen af ​​VEGF i epitelceller som fremmer angiogenese og derved tumorvækst [39]. VEGF-mRNA og proteinekspression blev analyseret og viste sig også at være signifikant lavere i curcumin behandlet tumorxenoplantater sammenlignet med kontroltumorer (Fig. 4A, B). Immunhistokemi viste også, at curcumin reducerede signifikant VEGF-farvning sammenlignet med kontrolpatienter tumor (fig. 4C). Cyclin D1 er en cellecyklus regulatorisk protein, der regulerer G1 til S-faseovergangen og fungerer som en cofaktor for adskillige transkriptionsfaktorer [40]. Cyclin D1 overekspression har også været forbundet med udvikling og progression af kræft [34]. Curcumin behandling inhiberede cyclin D1-ekspression i de tumorxenografter tyder på, at det hæmmer cancer celleproliferation (fig. 4A, B). En række RNA-bindende proteiner er blevet identificeret til at genkende ARE-indeholdende sekvenser og regulere mRNA-stabilitet. Medlemmer af CELF (CUGBP2) og ELAV (Hur) familie af RNA-bindende proteiner er impliceret i forskellige cellulære processer, herunder mRNA splejsning, redigering, stabilitet og oversættelse [23], [41]. Vi har tidligere vist, at CUGBP2 induceres i celler, der undergår apoptose og funktioner til at inhibere COX-2-mRNA translation [28], [42]. T-celle- begrænset intracellulære antigen-1 (TIA-1) er også et RNA-bindende protein, der fungerer som en translationel suppressor, især under betingelser med stress [43]. Her observerede vi, at curcumin behandling resulterede i en betydelig stigning i både CUGBP2 og TIA-1-mRNA og proteinekspression i de tumorxenotransplantater (fig. 4A, B, D). På den anden side var der ingen signifikant ændring observeret i både Hur mRNA og protein niveauer som respons på curcumin (Fig. 3A, B, D).

(A) Samlet RNA fra Pan02 tumorxenografter blev udsat for real time PCR. Curcumin behandling resulterede i reduceret COX-2, VEGF og cyclin D1-mRNA-niveauer i sammenligning med kontroller. På den anden side blev CUGBP2 og TIA-1-mRNA-ekspression forøges (* p 0,05). Dataene er et gennemsnit fra xenografter i 5 mus. (B) Western blot-analyse viste, at væv lysater fra de curcumin behandlede dyr har signifikant lavere niveauer af COX-2, VEGF, og cyclin D1 proteiner, men forøgede niveauer af CUGBP2 og TIA-1-proteiner. (C) Immunhistokemi viser, at curcumin reducerede signifikant ekspressionen af ​​COX-2 og VEGF. (D) Immunhistokemi viser forøget ekspression af CUGBP2 og TIA-1 i tumorxenoplantater.

Curcumin hæmmer COX-2 og VEGF mRNA translation i bugspytkirtelkræftceller

Tidligere undersøgelser har påvist forøgede niveauer af COX-2-mRNA og proteinekspression i pancreas adenocarcinomer [38]. Derfor Derefter bestemte vi effekten af ​​curcumin behandling på COX-2-ekspression. Curcumin behandling signifikant forøget COX-2 mRNA-niveauer i MiaPaCa-2-celler (fig. 5A). Imidlertid var der en signifikant reduktion i COX-2-proteinniveauer (fig. 5B). Lignende resultater blev observeret på Pan02 celler (data ikke vist). Vi bestemt også virkningen af ​​curcumin på VEGF genekspression i cellerne. Curcumin behandling signifikant forøget VEGF-mRNA, mens inhibering proteinniveauer i MiaPaCa-2-celler (fig. 5A, B). Lignende resultater blev observeret i Pan02 celler (data ikke vist). På den anden side, curcumin steg både CUGBP2 og TIA-1-mRNA og proteinekspression signifikant (fig. 5A, B). Der var imidlertid ingen signifikant ændring blev observeret med Hur ekspression (fig. 5A, B). I tidligere undersøgelser har vi vist, at CUGBP2 binder til COX-2 3’UTR at inhibere dets oversættelse [28]. I betragtning af, at COX-2 mRNA-niveauer er højere, men protein niveauer er lavere i respons på curcumin behandling, vi fastslået, om curcumin øger bindingen af ​​CUGBP2 til COX-2 mRNA. Immunpræcipitation koblet RT-PCR viste, at der var en højere grad af CUGBP2 binding til COX-2 og VEGF-mRNA i sammenligning med kontrol, ubehandlede celler (fig. 5C). Endvidere actinomycin D forsøg viste, at curcumin behandling resulterede i signifikant højere niveauer af COX-2-mRNA stabilitet, halveringstiden stigende fra 30 min i de ubehandlede celler til ~8 timer (fig. 5D). Lignende resultater blev observeret med VEGF; halveringstiden af ​​VEGF-mRNA steg også fra 30 min til (. figur 5D). 8 timer i curcumin behandlede celler

(A) mRNA-ekspression. MiaPaCa-2-celler blev behandlet med curcumin i 2 timer. Curcumin behandling forøgede niveauerne af COX-2, VEGF, CUGBP2 og TIA-1-mRNA. Der var ingen signifikant ændring af Hur mRNA-ekspression (* p 0,05). Data fra tre uafhængige forsøg. (B) Western blot-analyser viser, at lysater med curcumin behandlet MiaPaCa-2-celler har lavere niveauer af COX-2 og VEGF proteiner og stigende niveauer af CUGBP2 og TIA-1. Repræsenterer tre uafhængige forsøg. (C) (venstre felt), forøget binding af CUGBP2 binding til COX-2 eller VEGF-mRNA efter curcumin behandling. Helcelleekstrakt (T) fra curcumin-behandlede celler blev immunfældet med anti-CUGBP2 antistof og RNA fra immunopræcipitaterne (P) og supernatant (S) blev isoleret og udsat for RT-PCR for COX-2 og VEGF-mRNA. Dataene viser øget COX-2 eller VEGF mRNA i pelleten af ​​curcumin-behandlede celler. (Højre panel) Dataene blev kvantificeret, og der var en klar stigning i COX-2 og VEGF mRNA i pellet af curcumin behandlede celler. (D) MiaPaCa-2-celler blev behandlet med curcumin i 2 timer og stabiliteten af ​​COX-2 og VEGF-mRNA blev bestemt efter tilsætning af actinomycin D (slutkoncentration: 10 ug /ml). Curcumin forøger halveringstiden af ​​COX-2 mRNA fra 30 min til 8 timer. Tilsvarende curcumin forøgede halveringstiden af ​​VEGF mRNA fra 30 min til 8 timer. Data viser curcumin behandling signifikant forøget stabilitet af COX-2 eller VEGF-mRNA.

Curcumin medieret COX-2 og VEGF mRNA-stabilitet kræver CUGBP2

Vi har tidligere vist, at CUGBP2 binding til COX -2 3’UTR forøger stabiliteten af ​​COX-2-mRNA, mens inhibere dets oversættelse [28]. Vi har derfor bestemmes virkningen af ​​CUGBP2 knockdown på curcumin-medieret translation undertrykkelse af COX-2 og VEGF-mRNA. Real time PCR målinger viste, at curcumin behandling resulterede i signifikant højere niveauer af COX-2 og VEGF-mRNA, som blev reduceret til kontrolniveauer når CUGBP2 ekspression blev knockdown (Fig. 6A). Derefter bestemte vi, hvis der var nogen virkninger på proteinekspression. Curcumin behandling nedsatte signifikant niveauer af både COX-2 og VEGF protein. Men når CUGBP2 blev slået ned med et specifikt siRNA, COX-2 og VEGF proteiner niveauer blev ikke påvirket af curcumin behandling (fig. 6B). Vi bestemt også, om curcumin-medierede virkninger på COX-2 og VEGF mRNA stabilitet påvirkes af CUGBP2 knockdown. Mens curcumin behandling forøgede stabiliteten af ​​COX-2 og VEGF-mRNA, der var en mindre virkning, når CUGBP2 blev også slået ned via bestemte siRNA. Halveringstiden af ​​COX-2-mRNA blev øget fra 30 min til ~8 timer efter curcumin behandling, som blev reduceret til ca. 2 h, når CUGBP2 ekspression blev inhiberet (fig. 6C). Lignende resultater blev opnået for VEGF hvor knockdown af CUGBP2 reducerede curcumin-medieret stabilitet fra 8 timer til 1 time (fig. 6C). Disse data antyder, at curcumin medierede stigning i COX-2 og VEGF-mRNA stabilitet sker dels gennem CUGBP2.

(A) CUGBP2 er nødvendig for curcumin-induceret COX-2 og VEGF-mRNA-niveauer.