PLoS ONE: Anti-cancer effekt af HIV-1 Viral Protein R på doxorubicin Resistant Neuroblastoma

Abstrakt

Flere unikke biologiske funktioner i HIV-1 Vpr gør det til et potentielt magtfuldt middel til anti-cancer terapi. Første, Vpr inhiberer celleproliferation ved induktion af cellecyklus G2-standsning. For det andet inducerer apoptose via flere mekanismer, som kunne være betydelig, da det kan være i stand til at overvinde apoptotisk modstand udstillet af mange kræftceller, og endelig Vpr selektivt dræber hurtigt voksende celler i en p53-uafhængig måde. For at demonstrere den potentielle nytte af Vpr som et anti-cancer middel, vi udført proof-of-concept studier

in vitro

in vivo

. Resultater af vores foreløbige undersøgelser viste, at Vpr inducerer cellecyklus G2-standsning og apoptose i en række forskellige cancertyper. Desuden kunne også detekteres de samme Vpr virkninger i nogle cancerceller, som er resistente over for anti-cancerlægemidler, såsom doxorubicin (DOX). For yderligere at illustrere den potentielle værdi af Vpr i tumor væksthæmning, vedtog vi en DOX-resistent neuroblastom model ved at injicere SK-N-SH celler i C57BL /6 N og C57BL /6J-SCID /SCID-mus. Vi antager, at Vpr er i stand til at blokere celleproliferation og inducere apoptose uafhængigt af lægemiddelresistens status af tumorerne. Faktisk produktion af Vpr

via

adenoviral levering til neuroblastomceller forårsagede G2 anholdelse og apoptose i både narkotika naive og DOX-resistente celler. Derudover præ-infektion eller intratumoral injektion af

vpr

udtrykkende adenovirale partikler i neuroblastomtumorer i SCID mus markant inhiberede tumorvækst. Derfor Vpr kunne eventuelt bruges som en supplerende viral terapeutisk middel til selektiv hæmning af tumorvækst i anti-cancer terapi, især når andre behandlingsformer stoppe med at arbejde

Henvisning:. Zhao RY, Liang D, Li G, Larrimore CW , Mirkin BL (2010) Anti-cancer effekt af HIV-1 Viral Protein R på doxorubicin Resistant neuroblastom. PLoS ONE 5 (7): e11466. doi: 10,1371 /journal.pone.0011466

Redaktør: Fatah Kashanchi, George Mason University, USA

Modtaget: May 6, 2010; Accepteret: 8 jun 2010; Udgivet: 7 juli 2010

Copyright: © 2010 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist understøttet af Chicago Medical Research Council, Illinois Department of Public Aid og US Department of Human Health Services og University of Maryland Medical center (til Ryz). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Selv om der har været store fremskridt i kræftbehandlingen i de seneste årtier, er der stadig eksisterer en række store forhindringer, der begrænser brugen af ​​nogle af disse nye behandlingsformer. De hindringer, der er præsenteret indbefatter, men er ikke begrænset til, 1) tjener bivirkning skyldes ikke-specifikke cytotoksicitet af de terapier, 2) udvikling af lægemiddelresistens, og 3) udvikling af tumor resistens over for apoptose. Derfor ville enhver anti-cancer middel, som enten undgå eller tilsidesætte manglerne i en del af de nuværende anti-cancer behandlinger være af stor betydning for den fremtidige konstruktion af anti-cancerterapi. Ideelt set bør et effektivt anticancermiddel have følgende egenskaber. Det bør være i stand til 1) blok kun unormal celleproliferation, der resulterer fra tab af normal cellecyklusregulering, fx cellulære checkpoint-mutationer; 2) inducerer vedvarende cellecyklusstandsning der kunne føre til celledød eller apoptose; 3) inducerer bestemt celle drab på kræftceller med minimal eller ingen effekt på normale celler; 4) være i stand til at tilsidesætte apoptotisk modstand, et typisk træk ved mange kræftceller; 5) har den celledræbende effekt uafhængig af fælles onkogene mutationer såsom p53; 6) giver den samme standsning og celledræbende virkninger i lægemiddelresistente celler, dvs. når andre kemoterapeutisk lægemiddel svigter; og 7) absorberes let eller udskilles af celler ved sin oprindelige bioaktive formular.

viralt protein R (Vpr) fra det humane immundefektvirus type 1 (HIV-1) kan potentielt opfylde mange af ovennævnte kriterier. Fordi, 1) Vpr blokerer proliferation af cancerceller ved induktion af cellecyklus G2-standsning [1], [2], og dette standsning effekt er uafhængig af de klassiske DNA checkpoints [3], [4]; 2) Vpr inducerer apoptose gennem flere veje, der ikke afhænger af værtens cellulære reaktioner [5], [6]; og 3) Vpr selektivt dræber hurtigt voksende celler i en p53-uafhængig måde [7], [8], hvilket tyder Vpr celledød kan tilbyde mere selektivt magt til at dræbe kræftceller end normale celler, og denne cytotoksiske ejendom bør være effektive i mange af cancere, hvori p53-genet er muteret. 4) Vpr selv er ikke smitsom; 5) Vpr er et opløseligt protein, der er også naturligt transduceret. Proteinet naturlige tranducing evne gør det muligt at op taget og udskilles af celler uden hjælp af nogen særlig levering køretøj [9]; og 6) Vpr er et virion-associeret protein. Dette giver mulighed for levering af Vpr protein til at målrette specifikke tumorer såsom neuroblastom eller gliom hjælp specialdesignede virale vektorer [For anmeldelser, se [10]].

HIV-1 Vpr er et lille tilbehør viral protein med en gennemsnitslængde på 96 aminosyrer og en beregnet molekylvægt på 12,7 kD. Vpr er et unikt protein, som viser ingen kendt homologi med enhver anden nuværende cellulære proteiner. En tertiære struktur af Vpr foreslået på grundlag af NMR-analyse består af en α-helix-turn-α-helix domæne i den aminoterminale halvdel mellem aminosyrerne 17 til 46 og en lang α-helix fra aminosyre 53 til 78 i carboxyl-terminale halvdel [11]. Disse tre a-helixer er foldet rundt om en hydrofob kerne i en struktur, der tillader interaktion mellem Vpr og andre forskellige cellulære proteiner [12]. Samspillet mellem Vpr og cellulære proteiner understreger de mangeartede roller i sin indblanding med værten cellulære funktioner, som beskrevet ovenfor [For anmeldelser, se [8], [13], [14]].

En af de mest vanskelige cancere til behandling er neuroblastom. Denne dødelige sarkom består af maligne neuroblast celler, enten vises i det autonome nervesystem eller i binyremarven. Neuroblastom betragtes som en form for neuroepitel svulst, der primært rammer spædbørn og børn op til 10 år. Det er en af ​​de mest almindelige faste tumorer i den tidlige barndom. Den tumor stammer typisk i binyremarven, med den mest almindelige sted at være maven (nær binyrerne), men det kan også findes i huden, bryst, hals, bækken eller andre områder. Mens det er underforstået, at genetiske mutationer enten under fosterudviklingen eller dem, der er blevet arvet fører til neuroblastom, den nøjagtige årsag til disse genetiske mutationer er stadig ukendt. Behandlingsmuligheder, der er tilgængelige omfatter primært kirurgi, kemoterapi, strålebehandling, og knoglemarvstransplantationer. Men på trods af forskellige behandlingsmuligheder, morbiditet denne kræft er stadig meget højt og er i øjeblikket tæt på 100%. Den primære årsag til en sådan høj sygelighed er fordi de fleste patienter har udbredt sygdom på diagnose og disse tumorer udvikler hurtig resistens mod kemoterapi og strålebehandling.

En primær tilgang til kræftbehandling ofte indebærer kemoterapi. Kemoterapi virker ved at dræbe hurtigt opdelt celler, hvilket er en vigtig egenskab af kræftceller. Desværre, neuroblastom udvikler resistens hurtigt til kemoterapimidler og gør behandlingen vanskelig. Der er flere mulige årsager til kemoterapi modstand, de omfatter 1) celler, der ikke er dræbt af kemoterapi mutere og blive resistente, 2) proteiner, transport narkotika ind i kræftceller stoppe med at arbejde, 3) celler kan begynde at pumpe narkotika ud af cellen som hurtigt som de kan trænge ind i cellen, 4) gener, der udløser en overproduktion af proteiner, der gør et lægemiddel ineffektiv kan blive amplificeret, og 5) kræftceller kan begynde at reparere DNA-brud forårsaget af behandling. Overvejer hurtig lægemiddelresistens af neuroblastom og et begrænset antal lægemidler i øjeblikket er tilgængelige til behandlingen af ​​neuroblastom, er der et stort behov for en ny terapi, der kunne fortsætte eliminere maligne celler, når disse celler resistente over for andre lægemidler mod cancer. En mulig ny løsning på dette dilemma er den potentielle anvendelse af HIV-1 Vpr med sin unikke biologiske egenskaber er beskrevet ovenfor.

For at demonstrere potentialet nytte af Vpr som et anti-cancer middel, har vi gennemført proof of-concept forundersøgelser

in vitro

og

in vivo

. Resultaterne af vore undersøgelser viste, at Vpr inducerer cellecyklus G2-standsning og apoptose i en lang række cancertyper. Vi har yderligere demonstreret, at også kan detekteres de samme Vpr virkninger i cancerceller, som er resistente over for anti-cancerlægemidler, såsom DOX. Desuden har vi vedtaget en neuroblastom musemodel system, der giver os mulighed for at vise den undertrykkende effekt af Vpr på tumorvækst

in vivo

.

Resultater

Vpr inducerer cellecyklus G2 anholdelse i forskellige kræftceller

Vpr er blevet observeret at fremkalde cellecyklus G2 anholdelse i et bredt sortiment af eukaryote celler, der spænder fra fission gær til humane celler [15], [16]. Disse observationer er tankevækkende, at højt konserverede cellulære aktiviteter i eukaryote celler faktisk påvirkes af Vpr. I denne undersøgelse blev det adenovirusinfektion systemet valgt til at måle den potentielle virkning af HIV-1 på cellecyklus G2 induktion i forskellige cancertyper (tabel 1), som vi beskrev tidligere [17] – [19]. De adenovirale systemer tillader næsten 100% af celler, der skal inficeret ved transduktion og detektion af Vpr effekter kan observeres så tidligt som 5 timer [18]. Ved hjælp af dette system, vi testede den potentielle effekt af Vpr på forskellige former for kræft cellelinjer. Disse cancertyper indbefatter cervikale (HeLa), bryst (MCF-7), ovarie (A2780), og T- eller B-celle-lymfomer (Jurkat og SU-DHL-4). Som vist i figur 1 og tabel 1, Vpr induceret cellecyklus G2-standsning i alle cancer celletyper testet med den undtagelse, at kun delvis G2 skift blev observeret i MCF-7-celler (figur 1 – midten). Den funktionelle relevans af denne delvise G2 induktion formodes i diskussionen. Desuden forekommer denne G2 induktion at være uafhængig af p53-gen status, hvilket er i overensstemmelse med en række tidligere rapporter [7], [20]

Alle cancer cellelinjer (se tabel 1 for detaljer;. Kun 3 cellelinier er vist her som eksempler) blev dyrket som beskrevet i Materialer og Metoder. Celler blev transduceret med Adv eller Adv-Vpr med MOI på 1,0. Cellerne blev høstet 48 timer efter infektion (

efter injektion.

) Blev cellerne derefter fremstillet som beskrevet i Materialer og Metoder. Cellulære DNA indhold blev analyseret ved FACScan flowcytometri (Becton Dickinson), som vi tidligere beskrevet [4], [19]. Cellecyklus profiler blev modelleret ved hjælp ModFit software (Verity Software House, Inc.).

Vpr inducerer cellecyklus G2 anholdelse og celledød uanset resistens status til doxorubicin

Doxorubicin (Adriamycin, hydroxydaunorubicin, DOX) er et anticancerlægemiddel, der er blevet anvendt til behandling af en lang række af cancere, herunder bryst-, mave-, lunge-, ovarie- og blære kræft samt leukæmi, mange typer af carcinom og blødt væv sarkomer. Den præcise molekylære mekanisme af DOX er ikke veletableret. Imidlertid er det kendt at indskyde DNA og afbryder DNA-replikation hvilket fører til celledød [21]. Selvom DOX fortsætter med at være en væsentlig bestanddel af first-line anti-cancer behandlinger i behandling af mange typer af tumorer, udvikling af tumor drug resistente til DOX og andre anticancer regimer er en stor hindring for at opnå en vellykket anti-cancer behandlinger [22], [23]. At undersøge, om Vpr kan blokere celleproliferation ved G2 anholdelse og dræbe de anti-cancer narkotika-resistente tumorceller, vi udtrykte

vpr

gen

via

Adv-Vpr transduktion i tre par narkotika naive (WT) og DOX-resistente (DOX-R) cancerceller. De er human neuroblastom (SK-N-SH), osteosarkom (SaOS2), og brystadenocarcinom (MCF-7). Disse DOX-resistente cellelinier blev genereret ved kontinuerlig inkubation af forældrenes cellelinjer med trinvise stigninger i DOX koncentrationer fra 10

-9 til 10

-6 M over en periode på 3 til 6 måneder. Detaljeret fremgangsmåde til generering af disse DOX-resistente cellelinier har tidligere [24] blevet beskrevet. Som vist i tabel 1, ekspression af Vpr forårsager celle vækststandsning i alle testede uanset den resistente status lægemiddel til DOX-celler. Endvidere måling af celleproliferation og levedygtighed ved MTT-assayet, som metaboliserer tetrazoliumsalt (MTT), viste lidt celleproliferation eller levedygtige celler forlod 5 dage efter Adv-Vpr transduktion (figur 2); Tilsvarende bestemmelse af cellemembranen integritet ved trypanblåt, der farver kun døde celler, indikerede, at Vpr giver meget potent cytotoksicitet til sådanne celler (figur 2).

Tre par af lægemiddel naive (WT) og DOX-resistente (DOX-R) cancerceller blev testet for Vpr-induceret G2-standsning (tabel 1) og celledød. Disse cancercellelinier dyrkedes som beskrevet i Materialer og Metoder. Celler blev transduceret med Adv eller Adv-Vpr med MOI på 2,5. Cellelevedygtighed blev bestemt enten af ​​trypanblåt udelukkelse assay som identificerer døde celler (øverste billede) eller ved MTT-assayet til måling af celleoverlevelse (nederste figur). Celler blev undersøgt 5 dage

efter injektion

Intials:. WT, vildtype; Dox-R, doxorubicin-resistente; 1, Mock; 2, Adv og 3, Adv-Vpr.

Vpr inducerer dosisafhængig celledød og apoptose i DOX-naive og resistente neuroblastomceller

For yderligere at forstå Vpr-induceret celle drab i narkotika naive og tumorceller og forberede en

in vivo

undersøgelse af den potentielle Vpr effekt på tumorvækst i en musemodel, besluttede vi at fokusere vores undersøgelse indsats neuroblastom. Neuroblastom blev valgt som model system, fordi neuroblastom er en af ​​de mest almindelige solide tumorer i den tidlige barndom normalt findes i babyer eller små børn. En anden grund til at vælge neuroblastom modellen er, at den menneskelige neuroblastom xenograft musemodel systemet er veletableret [25], [26].

Før udførelse

in vivo

musestudier, vi først bestemmes potentielle dosisafhængige reaktioner af Vpr-induceret celle drab i både vildtype (WT) og narkotika-resistente (DOX-R) SK-N-SH neuroblastomceller. Den trypanblåt og MTT-assays blev anvendt til måling af celleproliferation og levedygtighed 5 dage efter Adv kontrol og Adv-Vpr transduktioner. Sammendrag af disse resultater er vist i figur 3A-a. Mens stigningen af ​​multiplicitet af infektivitet (MOI) på Adv kontrol ikke forårsagede signifikant celledød, blev en klar dosisafhængig celledrab er vist for begge WT og DOX-R-celler som indikeret ved trypanblåt assay. Ved lave ende, MOI 1.0 forårsagede omkring 40-80% celledød; henviser alle cellerne (100%) blev aflivet ved MOI 10.0. MTT assay viste den tilsvarende dosis-afhængigt fald af celleproliferation og overlevelse af celler, og Western blot-analyser bekræftede, at Vpr blev produceret i disse Adv-Vpr-inficerede celler (figur 3A-B). For yderligere at forstå dynamikken i Vpr effekt på celledeling, blev celledeling og levedygtighed målt over tid (op til 5 dage) med MOI 2.5. Som vist i figur 3B viste mock eller Adv-inficerede celler normal celleproliferation og nåede et plateau efter 3 dage med ringe eller ingen celleproliferation detekteret i Adv-Vpr inficerede celler. Den reducerede metaboliske aktivitet over tid foreslog øget celledød over tid. For yderligere at vurdere tilstanden af ​​Vpr-induceret celledrab i neuroblastomceller (uanset om Vpr dræber de celler ved apoptose eller anden mekanisme) potentiel caspase-3-spaltning virkning blev målt som en indikation af apoptose. At skelne Vpr-induceret celledød fra dens virkning på cellecyklussen blev et Vpr-mutant (F34I), som forårsager G2 induktion, men ikke inducerer celledød også inkluderet i denne undersøgelse som en kontrol [18], [27], [28] . Efter adenoviral infektion, status af caspase-3 overvågedes begyndende fra 6 til 36 timer ved Western blot-analyse under anvendelse af antistoffer mod total caspase-3 (figur 3C, top lane) eller spaltes specifikt caspase-3 (figur 3C – midterbanen). Ingen caspase-3 spaltning blev påvist i Adv-F34I Vpr-inficerede celler (angivet med “m”) i hele testperioden; caspase-3-spaltning blev klart synlig 24-36 timer i celler, der var inficeret med vildtype (angivet ved “w”) Vpr.

A. Vpr inducerer dosisafhængig celledød i lægemiddel-naive og resistente SK-N-SH-celler. en. Niveau af Vpr-induceret celledød blev undersøgt ved at inficere DOX-naive og resistente SK-N-SH-celler under anvendelse af stigende MOI af Adv eller Adv-Vpr-virus. Celledød blev målt ved at bestemme cellemembranen integritet og proliferation under anvendelse af Trypan blå belastende (venstre) eller cellelevedygtighed ved MTT-assayet (højre). Celler spredning og levedygtighed blev undersøgt 5 dage

efter injektion

. b. Vpr proteinproduktion blev bekræftet ved Western blot analyse. Bemærk, at det er meget vanskeligt at opdage Vpr protein ved lav MOI. Vellykket infektion af Adv-Vpr blev verificeret ved forstørrede kerner af celler som tidligere beskrevet [43]. B. Vpr inducerer celledød over tid til medicin-naive og resistente SK-N-SH-celler. Både lægemiddel-naive og resistente SK-N-SH-celler behandlet på samme måde som A. Kun MOI2.5 blev anvendt her. C. Vpr inducerer apoptose i medicin-naive og modstandsdygtig SK-N-SH-celler. Caspase-3-spaltning blev overvåget op til 36 timer. Initialer: CSP3, caspase-3; cl-CSP3, kløvet caspase-3; m, Adv-VprF34I; w, Adv-Vpr.

Sammen resultaterne af disse

in vitro

undersøgelser støtter tanken om, at Vpr blokerer neuroblastom celledeling ved cellecyklus G2 anholdelse og celledræbende

via

apoptose. Vigtigere, Vpr giver disse cytotoksiske effekter til neuroblastomceller på et tilsvarende niveau uanset deres lægemiddelresistens status.

In vivo

virkning Vpr på neuroblastom tumorvækst i et musemodelsystem

Vi undersøgte dernæst Vpr virkning på tumorvækst af neuroblastomceller i C57-SCID mus modelsystem [29], [30]. To forskellige fremgangsmåder blev anvendt til at indføre Vpr i tumorer, dvs. præ- viral transduktion før celleinokulering i mus eller post intratumoral injektion. For pre-transduktion, vildtype og DOX-resistente SK-N-SH blev injiceret med Adv, Adv-VprF34I og Adv-Vpr

s.c.

I venstre flanke af C57-SCID-mus. Tumorstørrelsen blev målt hver 7. dag. Endelig tumorstørrelse måling var på 26 dage efter transduktion og mus blev derefter aflivet til yderligere analyse. Som vist i figur 4A, en gennemsnitlig tumorstørrelse på ca.. 2 cm blev tydeligt ses i mus, som blev inokuleret med wt eller DOX-resistente SK-N-SH-celler 26 dage efter transduktion. Lignende tumor størrelser blev også observeret i Ad-F34Ivpr inficerede mus. I modsætning hertil var meget små knuder på injektionsstedet ses i Ad-Vpr-transducerede mus, hvilket tyder på ekspressionen af ​​Vpr i disse celler forhindrede deres vækst i C57-SCID-mus. For at minimere potentielle variation af individuelle mus blev individuelle mus injiceret med alle tre transducerende virus

s.c.. På

det abdominale område som vist i figur 4B. Svarende til, hvad vi har observeret i mus podet med enkelt behandling, om samme størrelse af tumorer blev set ved de steder, Adv eller Adv-F34Ivpr injektioner mens lidt eller ingen knuder blev set på de steder, Adv-Vpr injektioner.

Suppression af neuroblastom tumorvækst med Vpr demonstreres her enten ved præ-transduktion af adv-Vpr (AB) eller post-intratumoral injektion (C). For pre-transduktion, blev vildtype (WT) eller DOX-resistent SK-N-SH dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS ved 37 ° C med en 95% luft /5% CO

2 atmosfære. Friske celler blev først dyrket i en plade med 12 brønde i 36 timer og adenoviral transduktion blev udført 5 timer før celleinokulering med MOI på 2,5, hvilket blev bestemt empirisk. Celler blev derefter behandlet med Trpsin- EDTA, resuspenderet i DMEM og vasket med PBS 3 gange. Afsluttende celler blev suspenderet i DMEM i inokulering. Ca. 2 × 10

6 celler i volumen på 100 pi blev injiceret

s.c.

I venstre flanke af C57-SCID-mus. 3-4 mus blev injiceret for hver behandling. Disse behandlingsgrupper omfatter en Adv viral kontrol, Adv-Vpr og Adv-F34IVpr. Den F34IVpr mutanten blev anvendt her som en kontrol, da en enkelt aminosyreændring af aminosyre 34 fra Phenylalanin (F) til Isoleucin (I) gør Vpr stand til at forårsage apoptose (figur 3C), men tillader cellecyklussen at indtaste en langvarig G2 fase [18], [27], [28]. Tumorstørrelsen blev målt hver 7. dag ved måling af to vinkelrette tumordiametre ved anvendelse af skydelære. Final tumormåling var på 26 dage efter transduktion og mus blev derefter aflivet til yderligere analyse. For intralæsional injektion af Vpr, WT og DOX-R SK-N-SH-neuroblastomceller fremstillet i det væsentlige på samme måde som beskrevet ovenfor. 200 pi af Adv, Adv-Vpr eller Adv-F34Ivpr blev derefter injiceret diskret 3 gange i tumorerne 2 uger efter celleinokulering med et viralt koncentration på 1.012 /ml. Tumorstørrelsen blev målt hver 7. dag. Endelig måling af tumorstørrelsen var på 39 dage efter injektion og mus blev derefter aflivet til yderligere analyse. Tre uafhængige forsøg blev udført og resultaterne af disse forsøg med gennemsnitlig tumorstørrelse med standardafvigelse (SD) er vist i tabel 2.

En af de potentielle argumenter om resultaterne fra præ-transduktion er at ekspressionen af ​​Vpr

in situ

kunne hurtigt dræbe SK-N-SH-celler og dermed forhindrer tumor dannelse og dermed test af Vpr effekt på faktiske tumorvækst. For at omgå dette problem, blev en alternativ post-intratumoral injektion metode. WT og DOX-R SK-N-SH-neuroblastomceller blev fremstillet og inokuleret væsentlige samme måde som beskrevet ovenfor. Den Adv, Adv-Vpr eller Adv-F34Ivpr blev derefter injiceret diskret 3 gange ind i tumorer 2 uger efter celle podning. Tumorstørrelsen blev målt hver 7. dag. Endelig måling af tumorstørrelsen var på 39 dage efter injektion og mus blev derefter aflivet til yderligere analyse. Statistiske tests blev udført for at vurdere de potentielle forskelle i tumorstørrelse hver uge eller i løbet af hele forsøgsperioden. De endelige resultater er vist i tabel 2. Selv om Vpr reduceret 44,1 ± 11,8% af tumorvækst i vildtype SK-N-SH-tumorer ved uge 1 efter intratumoral injektion, statistiske analyser indikerede en

t

– værdi på 2,35 (p = 0,10), dvs. ingen statistisk forskel; Ligeledes blev der ikke tumorvækst forskel ses i Dox-R tumorer ved uge 1. Imidlertid blev statistiske signifikante forskelle observeret både i tumorerne vildtype og Dox-R ved uge 2 og uge 3. Navnlig i WT-neuroblastomceller , Vpr reduceret 64,2 ± 6,7% eller 76,4 ± 5,9% af tumorvækst ved uge 2 eller 3 efter intratumoral injektion, respektivt; Tilsvarende blev en sammenlignelig procent af reduktion (67,1 ± 4,5% eller 75,6 ± 1,8%) også påvist i de DOX-R-celler i den samme tidsperiode. Sammenligning af tumorvækst i hele forsøgsperioden ved at bruge de vejede gennemsnitlige beløb [31] foreslog overordnede forskelle i tumorvækst mellem Ad kontrol-behandlede mus og Ad-Vpr injicerede mus (p 0,05). I modsætning, blev der ikke fundet statistiske forskelle mellem Ad kontrol og Ad-F34IVpr grupper. Derfor er det klart, at ekspressionen af ​​Vpr i tumorer betydeligt har reduceret tumorvækst og udtryk for Vpr faktisk undertrykker tumorvækst af humane neuroblastomceller uanset dens resistente status narkotika.

Diskussion

i den foreliggende undersøgelse påviste vi, at en HIV-1 viralt protein Vpr blokke celleproliferation ved at arrestere de celler i G2-fasen af ​​cellens cyklus i forskellige cancer testede celletyper (tabel 1, figur 1). Desuden Vpr inducerer celledød i tre af disse cancercellelinier uanset om de er resistente eller følsomme over for DOX (figur 2). Yderligere analyser af Vpr virkning på neuroblastomceller indikerede, at Vpr inducerer celledød i en dosisafhængig måde (figur 3A-B)

via

apoptose som angivet ved caspase-3-spaltning (figur 3C). Ved anvendelse af en neuroblastom musemodel, har vi yderligere demonstreret, at levering af Vpr

via

adenoviral levering til neuroblastomtumorer, enten ved præ-infektion (figur 4A-B) og intratumoral injektion (figur 4C), markant inhiberede tumor vækst. Således de beskrevne resultater viser ved proof-of-concept, at Vpr kan være en god kandidat til yderligere undersøgelse på sin rolle i tumor undertrykkelse især i dem, der er resistente over for lægemidler mod cancer.

Selvom Vpr inducerer cellecyklus G2 standsning i alle cancer testede celletyper, blev det bemærket, at niveauet for G2 standsede celler i brystcancer-cellelinie MCF-7 meget blev reduceret (figur 1 – midten). Det er uklart for øjeblikket, hvorfor denne cellelinie er delvist resistent over for Vpr-induceret G2-standsning. Men der synes at være en interessant sammenhæng mellem Vpr-induceret G2 anholdelse og den enzymatiske status af protein fosfatase 2A (PP2A). Som vi har rapporteret tidligere, en af ​​de unikke funktioner i Vpr-induceret G2 anholdelse er, at det kræver funktionen af ​​PP2A [2], [4], [16], [32]. Søg litteratur indikerede, at A regulatoriske underenhed af PP2A enten formindskes eller tabt væsentligt i MCF-7-cellelinje [33], [34]. Reduktionen af ​​G2-standsning i MCF-7-celler understøttede den opfattelse, at Vpr inhiberer celleproliferation ved induktion af G2-standsning gennem en PP2A-medieret mekanisme [4], [32]. Desuden er denne observation antyder, at Vpr ikke kan være i stand til at blokere celleproliferation med G2-standsning i alle tumorceller, især de tumorceller, der indeholder PP2A-relaterede mutationer. Yderligere undersøgelse af dette begreb er helt sikkert berettiget, især i forbindelse med brug af Vpr som en anti-cancer middel.

Vpr inducerer celledød og apoptose via flere mekanismer [For anmeldelser, se [5], [6]] . Da Vpr er i stand til at inducere celledød og apoptose i både DOX-naive og resistente neuroblastomceller, en eller få af disse foreslåede Vpr pathways kan have forårsaget den observerede cytotoksicitet. Vores fremtidige indsats vil fokusere på test, som mekanisme Vpr celledød kunne overvinde apoptotisk modstand, et typisk træk ved mange kræftceller, herunder neuroblastom. Baseret på data vist i figur 3C, er det klart, at Vpr er i stand til at forårsage apoptose som angivet ved caspase-3-spaltning. Denne observation er i overensstemmelse med vores karakteristik af Vpr-induceret apoptose i de samme neuroblastomceller vist ved hjælp af bilag V assayet [35]. Der har vi endvidere demonstreret, at Vpr-induceret apoptose i SK-N-SH-neuroblastomceller gennem en mitokondrier-afhængig og caspase-9-medieret mekanisme [35].

Vi anvendte pre-infektion og intra- tumorale injektioner i vores musemodel for indførelse af Vpr til neuroblastomtumorer. Disse to metoder blev anvendt, fordi udtryk for Vpr

in situ

hurtigt kunne dræbe celler og dermed forhindre forsøg på faktisk tumorvækst. Vores resultater viste begge metoder signifikant reducerede tumorvækst efter indførelse af Vpr. Sammenligneligt, DOX-resistente celler viste også tilsvarende niveau for tumorstørrelse reduktion støtter den forudsætning, at Vpr ekspression undertrykker tumorvækst uanset lægemiddelresistent status.

Det er værd at nævne, at i de beskrevne eksperimenter, vi ikke teste potentialet Vpr virkning på metastatiske neuroblastomceller. Vi har dog foretage indledende farmakologiske undersøgelser for at afprøve potentielle negative virkning af C57-SCID mus, når de blev udsat for Vpr gennem systematisk full-body injektion. I de eksperimenter blev en eskalerende stigning på Adv-Vpr viruspartikler fra 1 x 10

13-6 × 10

13 af viruspartikler injiceret i C57-SCID-mus gennem hale årer. Ingen åbenlyse bivirkninger blev observeret i disse mus under hele forsøgsperioden. Patologiske undersøgelser af forskellige organer 3 uger efter viral injektion viste ingen klare cytotoksiske virkninger pålagt af Vpr (data ikke vist). Derfor kunne systematisk indførelse af Vpr også være en mulighed for fremtidig testning.

Konceptet med at anvende HIV-1 Vpr som et potentielt middel mod cancer er ikke ny. Faktisk har andre tidlige undersøgelser, herunder vores foreslået denne mulighed [36] og en række undersøgelser har vist, at levering af Vpr til forskellige tumorer, såsom melanom [37] – [39], hepatom [40], [41] og mundtlige kræft [42] undertrykke tumorvækst

in vivo

. Hvad der er nyt, er imidlertid, at vi har vist for første gang, at Vpr er stand til at undertrykke tumorvækst uanset om det er følsom eller resistent over for et anticancer lægemiddel gennem induktion af cellecyklus G2-standsning og apoptose. Dette resultat kunne potentielt være væsentlig på grund destruktion af lægemiddelresistente kræftceller gør det til en potentiel og kraftfuld ny og alternativ anticancermiddel. Denne type anticancermiddel kan blive særligt nyttige som et supplerende viralt terapeutisk middel til selektiv inhibering af tumorvækst, især når andre behandlinger mislykkes.

Materialer og metoder Salg

cellelinier og kultur

forskellige humane cancercellelinier, der repræsenterer forskellige kræfttyper med eller uden lægemiddel resistens over for anticancer drug doxorubicin (DOX) anvendes i dette studie og opsummeret i tabel 1. med mindre andet specifikt er angivet, er disse cellelinjer blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Cellgro) eller RPMI 1640-medium (Sigma) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Invitrogen). Inkubation var ved 37 ° C i en CO 5%

2 inkubator.

Adenoviral infektion

Adenoviral vektor (Adv) og adenovirusvektoren indsat med

Vpr

gen (adv-Vpr) blev venligst stillet til rådighed af Dr. LJ Zhao [17]. Ca. 1 x 10

6 af testcellerne blev inficeret med Adv eller Adv-Vpr-virus. Fyrre-otte timer

efter injektion.

, Celler blev høstet for cellecyklus analyse eller Western blot-analyse. Infektioner blev udført ved en infektionsmultiplicitet (MOI) på 1,0 for cellecyklus analyser som vist i tabel 1 og fig. 1. MOI på 2,5 blev anvendt til initial celledød analyser som vist i fig. 2.Under denne adenovirale transducerende tilstand, blev mere end 90% infektion effektivitet opnås med disse virale lagre (data ikke vist).

Cell cyklus analyse

Cellerne blev høstet 48 timer