PLoS ONE: In vitro Identifikation og karakterisering af CD133pos Cancer Stem-lignende celler i anaplastisk thyreoideakarcinom Cell Lines

Abstrakt

Baggrund

Seneste publikationer tyder på, at neoplastisk initiering og vækst er afhængig af en lille delmængde af celler, betegnet cancer stamceller (CSCS). Anaplastisk thyreoideakarcinom (ATC) er en meget aggressiv fast tumor med dårlig prognose, karakteriseret ved høj dedifferentiering. Eksistensen af ​​CSCS kunne redegøre for heterogenitet ATC læsioner. CD133 er blevet identificeret som en stamcelle markør for normale og ondartede væv, selv om dens biologiske funktion forbliver ukendt.

Metodologi /vigtigste resultater

ATC cellelinjer ARO, KAT-4, KAT-18 og FRO blev analyseret for CD133 ekspression. Flowcytometri viste CD133

POS celler kun i ARO og KAT-4 (64 ± 9% og 57 ± 12%). Disse data blev bekræftet ved QRT-PCR og immuncytokemi. ARO og KAT-4 var også positive for føtal markør onkoføtalt fibronektin og negative for thyrocyte-specifikke differentierende markører thyroglobulin, thyroperoxidase og natrium /iodid symporter. Sorteret ARO /CD133

POS celler udviste højere spredning, selvfornyelse, koloni-dannende evne i sammenligning med ARO /CD133

neg. Endvidere viste ARO /CD133

POS niveauer af skjoldbruskkirtel transkriptionsfaktor TTF-1 svarende til den føtale thyroid cellelinie TAD-2, medens ekspression i ARO /CD133

neg var ubetydelig. Udtrykket af stamcelle markør OLT 4 påvist ved RT-PCR og flowcytometri var markant højere i ARO /CD133

pos i forhold til ARO /CD133

neg celler. Stammen cellemarkører c-KIT og THY-1 var negative. Følsomhed over for kemoterapeutiske stoffer blev undersøgt, viser bemærkelsesværdig resistens mod kemoterapi-induceret apoptose i ARO /CD133

pos sammenlignet med ARO /CD133

neg celler.

Konklusioner /Betydning

Vi beskriver CD133

POS celler i ATC-cellelinjer. ARO /CD133

POS celler udviser stamcelle-lignende funktioner – såsom høj spredning, selvfornyelse evne, udtryk OLT-4 – og er kendetegnet ved højere resistens mod kemoterapi. Den samtidige positivitet for skjoldbruskkirtlen specifik faktor TTF-1 og onfFN foreslår, at de kan udgøre formodede kræft i skjoldbruskkirtlen stamceller-lignende celler. Vores

in vitro

fund kan give ny indsigt for nye terapeutiske tilgange

Henvisning:. Zito G, Richiusa P, Bommarito A, Carissimi E, Russo L, Coppola A, et al. (2008)

In Vitro

Identifikation og karakterisering af CD133

pos Cancer Stem-lignende celler i anaplastisk thyreoideakarcinom cellelinier. PLoS ONE 3 (10): e3544. doi: 10,1371 /journal.pone.0003544

Redaktør: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center og Beckman Research Institute, USA

Modtaget: April 7, 2008; Accepteret: 6 okt 2008; Udgivet: 28 Oktober 2008

Copyright: © 2008 Zito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) 60% (CG)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Indledning

anaplastisk thyroidea carcinom (ATC) er en af ​​de mest aggressive endokrine tumorer med morfologiske træk ved udifferentieret neoplasme. Patienter med ATC har en dårlig prognose med en gennemsnitlig overlevelsestid på 2-6 måneder. Kirurgi, strålebehandling og kemoterapi ikke forbedrer overlevelsesraten [1].

For nylig blev voksne stamceller identificeret i humane skjoldbruskkirtel [2]. Disse celler udtrykker adskillige specifikke markører, såsom den nukleare transkriptionsfaktor OLT 4 (også kendt som oct-3, OCT-3/4) og endodermale markører GATA-4 og HNF4α [2] -. [4]

En forbindelse mellem stamceller og cancerceller er blevet foreslået i forskellige væv, hvor cancerceller er meningen at stamme fra umodne progenitorer eller stamceller [5]. Cancer stamceller (CSCS) er blevet fundet i leukæmi [6], glioblastoma [7], bryst [8], prostata [9], gastrisk [10], lunge [11], og colon [12] cancer. Disse celler, som kun udgør en lille population inden hovedparten af ​​tumoren, besidder den samtidige evne til at forny sig selv og differentiere til andre cytotypes [13]. Stamme-lignende fænotype har vist sig at kunne modstå konventionelle behandlinger, hvilket fører til sygdom tilbagefald, selv når den primære læsion er blevet udryddet [14], [15]. Til dato, men ingen undersøgelser har afgjort vist, at stamceller er ansvarlig for skjoldbruskkirtlen carcinogenese. Imidlertid sjældenhed og hurtige vækst mønster af ATC ligner karakteren af ​​stamceller. Kun én undersøgelse har beskrevet en meget lille population, betegnet side population, beriget med stamceller blandt skjoldbruskkirtlen cancercellelinier [16]. Desuden har hypotesen om føtal celle carcinogenese, hvori cancerceller er afledt af resterne af føtale skjoldbruskkirtlen celler i stedet for voksne thyrocytter, blevet foreslået [17].

Adskillige markører er blevet identificeret til karakterisering af CSCS. Humant CD133, en særdeles konserveret antigen homolog af muse Prominin-1, blev oprindeligt identificeret i en subpopulation af CD34

+ hæmatopoietiske celler afledt fra human føtal lever og knoglemarv [18] – [19]. CD133 er blevet anvendt til identificering og isolering af en formodet CSC population fra flere humane cancere [20], [21]. Derudover blev ekspression af CD133

POS CSCS i hepatocellulært carcinom (HCC) vist at give kemoresistens

in vitro

[14]. Men dens biologiske funktion forbliver ukendt. Transskriptionsfaktoren OLT 4 betragtes som en vigtigste regulator af humane embryonale stamceller pluripotens og selv-fornyelse kapacitet [22]. Interessant er disse stamceller egenskaber tilskrives OLT 4A, en splejsning variant af OLT-4 gen ligger i kernen [23], [24].

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge ekspressionen af ​​formodede stamcellemarkører i etablerede humane ATC cellelinjer, såsom ARO, KAT-4, KAT-18 og tilbage. Vi identificerede CD133

POS celler i ARO og KAT-4 cellelinjer. Denne undergruppe var præget af højere

in vitro

spredning, selv-fornyelse og kolonidannende evne. ARO /CD133

pos var mere modstandsdygtige end ARO /CD133

neg celler til kemoterapi-induceret apoptose. Desuden ARO /CD133

POS celler udtrykte thyroblast specifikke transkriptionsfaktor TTF-1 og den stamcelle markør OLT 4, mens de var negative for stamcelle markører c-Kit og THY-1.

Materialer og metoder

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Menneskelig ATC cellelinjer ARO, KAT-4, KAT-18 og tilbage blev venligst stillet til rådighed af Prof. A. Fusco, University of Napoli , Italien. Under ekspansionsfasen og til selvfornyelse assay celler blev dyrket i RPMI 1640 medium indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS). For alle andre forsøg blev celler dyrket i RPMI1640 serumfrit medium (SFM), suppleret med basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF, 20 ng /ml; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og epidermal vækstfaktor (EGF, 20 ng /ml;. Sigma-Aldrich) [25]

flowcytometri

udtryk for stamcelle markører CD133, OLT-4, c-Kit og Thy-1 blev evalueret ved flow cytometri (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). For CD133-analyse blev celler først behandlet med FcR blokerende reagens (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland) og derefter inkuberet i mørke ved 4 ° C i 10 minutter med phycoerythrin (PE) -konjugeret muse IgG2b anti human CD133 /2 (klon 293C3, Miltenyi Biotec). For co-farvning med c-Kit og THY-1 celler blev efterfølgende inkuberet med monoklonalt muse IgG1 anti-human c-KIT og muse IgG1 anti-humane Thy-1-antistoffer (Chemicon International, Temecula, CA, USA) ved 4 ° C i 30 minutter. Celler blev vasket to gange med PBS og derefter inkuberet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret polyklonalt ged anti-mus ved 4 ° C i 30 minutter. Til farvning med OLT 4 blev celler fikseret og permeabiliseret med Cytofix-Cytoperm kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Celler blev derefter inkuberet med monoklonalt muse-IgG2b anti-humant oct-3/4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) ved 4 ° C i 30 minutter, vasket to gange med PBS og inkuberet med phycoerythrin (PE) -konjugeret polyklonalt ged anti-mus ved 4 ° C i 30 minutter. Det primære antistof genkender OLT-4A isoform af proteinet (aa 1-134).

Apoptose blev vurderet ved caspase 3 assay. Celler blev først fikseret og permeabiliseret med Cytofix-Cytoperm kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Celler blev derefter inkuberet med monoklonalt IgG kanin anti-Active Caspase 3 (BD ​​Pharmingen) ved stuetemperatur i 20 minutter, vasket to gange med PBS og derefter inkuberet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret polyklonalt gede-anti-kanin IgG (Santa Cruz Biotechnology) ved stuetemperatur i 20 minutter.

data blev analyseret med CELLQuest Pro software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Gating blev gennemført på grundlag af negative kontrol farvningsprofiler.

Immuncytokemi

ARO og KAT-4 cellelinjer blev forgyldt i kammer slides (Lab-Tek, Nunc, Inc. Naperville, USA), tilladt at binde i 48 timer og derefter anvendes til immuncytokemi. Celler blev fikseret i 3% H

2O

2 i methanol i 10 minutter ved stuetemperatur, derefter vasket to gange i PBS, blokeret med 3% BSA og permeabiliseret med PBS indeholdende 0,1% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur. Celler blev inkuberet med muse-anti-humant CD133 (IgG1, klon AC133, Miltenyi Biotec) i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur, derefter skyllet med PBS. Ekspression blev detekteret under anvendelse af sekundære biotinylerede antistoffer og streptavidin /peberrodsperoxidase. Kromogen 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) substrat blev anvendt, og objektglas blev modfarvet med hæmatoxylin.

Sortering af ARO /CD133

POS celler

ARO-celler blev trypsinbehandlet og mærket med primære CD133-Biotin og Biotin-Microbeads (Indirekte CD133 celleisolering Kit, Miltenyi Biotec), ifølge producentens instruktioner. Efter magnetisk sortering, blev celle renhed bedømt ved flowcytometri under anvendelse af phycoerythrin (PE) -konjugeret anti-human CD133 /2 (klon 293C3, Miltenyi Biotec).

Isolering af totalt RNA, RT-PCR og QRT-PCR

Samlet RNA blev ekstraheret og oprenset fra dyrkede KAT-4, KAT-18, FRO og ARO (usorteret, sorteret CD133

neg og CD133

pos) cellelinjer hjælp RNeasy Mini Kit (Qiagen, Milano, Italien), herunder en fordøjelse trin med DNase I indstillet. RNA kvantitet og kvalitet blev vurderet ved UV spektrofotometri. 2 ug totalt RNA blev revers transkriberet i et volumen på 20 pi med oligo dT-primere (Applied Biosystems, Darmstad, Tyskland) og Stratascript RT (Stratagene, Amsterdam, Holland) ifølge producentens protokol. Thyroglobulin (Tg) blev thyroperoxidase (TPO), natrium /iodid symporter (NIS), onkoføtalt fibronectin (onfFN) og OLT 4-ekspression analyseret ved polymerasekædereaktion (PCR) [26] – [27]. 1 pi komplementært DNA blev tilsat til 50 pi reaktion indeholdende 5 pi 10 x reaktionsbuffer, 50 mmol /l MgCl

2, 1 pi dNTP, 50 pmol sense- og antisense-primere og 0,5 U Taq Gold DNA-polymerase. Reaktioner blev udført ved 95 ° C i 10 minutter; 35 cykler ved 95 ° C i 45 sekunder, 55 ° C i 45 sekunder (primer specifik) og 72 ° C i 45 sekunder, efterfulgt af en forlængelse ved 72 ° C i 7 minutter og afslutning ved 4 ° C. Primerpar sekvenser, cDNA-fragment størrelser og udglødningstemperaturer var som følger: Tg (762 bp): 5′-CTTCGAGTACCAGGTTGATGCC-3 ‘og 5′-GGTGGTTTCAGTGAAGGTGGAA-3′ (55 ° C), TPO (593 bp): 5’- TGTGTCCAACGTGTTCTCCACAG-3 ‘og 5′-AAGACGTGGCTGTTCTCCCAC-3′ (55 ° C), NIS (179 bp): 5’-CTATGGCCTCAAGTTCCTCT-3 ‘og 5′-TCGTGGCTACAATGTACTGC-3′ (57 ° C), onfFN (215 bp) : 5’-TCTTCATGGACCAGAGATCT-3 ‘og 5′-TATGGTCTTGGCTATGCCT-3′ (55 ° C), OCT-4 (456 bp): 5’-AGCCCTCATTTCACCAGGCC-3 ‘og 5′-TGGGACTCCTCCGGGTTTTG-3′ (63 ° C) , β-actin (439 bp): 5’-GATGACCCAGATGACCCAGATCATGTTTG-3 ‘og 5′-AGGCTGGAAGAGTGCCTCA-3′ (55 ° C). For OLT 4 analyse blev nTERA2 cDNA (positiv kontrol) venligst stillet til rådighed af Dr. S. Liedtke, Düsseldorf Universitet, Tyskland. For onfFN og TTF-1 blev TAD-2-cDNA anvendt som positiv kontrol. CD133 og TTF-1-ekspression blev analyseret ved real-time kvantitativ PCR (QRT-PCR) i individuelle prøver. I alt 2 ug blev anvendt til at måle mRNA niveauer i forhold til p-actin-mRNA-ekspression. PCR-primere og prober blev indkøbt fra Qiagen (Quantitect Primer Prominin1 og TTF1). Alle reaktioner blev udført i et slutvolumen på 20 pi med 2 pi cDNA template under anvendelse af en LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). Dataanalyse blev udført med qBASE Browser, som anvender en Δ-Ct relativ kvantificering model med PCR effektivitet korrektion og enkelt henvisning gen normalisering (β-actin: 5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3 ‘, og 5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’) [28] .

In vitro

Kultur og celleformeringsanalyse af ARO /CD133

pOS celler

Efter isolation, ARO /CD133

pos og ARO /CD133

neg celler blev dyrket umiddelbart i SFM suppleret med bFGF og EGF i en atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

Celleproliferation blev vurderet ved kolorimetrisk assay under anvendelse af 3- (4,5 -Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) og BrdU (kolorimetrisk) kit (Roche Diagnostics GmbH, Tyskland). For MTT-assay, sorteret ARO /CD133

POS og ARO /CD133

neg celler blev udpladet i en plade med 96 brønde i 100 pi SFM /brønd og dyrket op til 72 timer. Cellerne blev inkuberet i 4 timer ved 37 ° C med MTT; Efter inkubation blev mediet fjernet, og cellerne blev behandlet med DMSO i 5 minutter. Levedygtighed blev bedømt ved UV-absorptionsspektrum ved 550 nm med Microplate Reader Model 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

I BrdU assay sorteret ARO /CD133

POS og ARO /CD133

neg blev udpladet i en plade med 96 brønde i 100 pi SFM /brønd og dyrket op til 144 timer. Levedygtighed blev evalueret ved UV-spektrum ved 450 nm med Microplate Reader Model 550 (Bio-Rad, Richmond, CA, USA).

Self-fornyelse Analyse af ARO /CD133

POS celler

Sorteret ARO /CD133

POS-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS. CD133 ekspressionen blev detekteret ved flowcytometri på dag 0, 4, 8 og 11. På samme tidspunkter apoptose blev vurderet ved Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) ifølge producentens anvisninger.

Colony dannelse assay af ARO /CD133

pOS celler

Sorteret ARO /CD133

pos og ARO /CD133

neg celler blev dyrket i 6-brønds plader i methylcellulose SFM (HSC-CFU basisk medium, Miltenyi Biotec). Plader blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator i 2 uger. Antallet af kolonier blev vurderet ved mikroskopisk tælling.

kemoterapeutiske stoffer

ARO /CD133

POS og CD133

neg celler blev dyrket i SFM suppleret med bFGF (20 ng /ml ) og EGF (20 ng /ml) med eller uden cisplatin (5, 10, 15 og 20 uM; Pharma, Østrig), doxorubicin (0,5, 1, 1,5 og 2 uM; Ebewe Pharma, Østrig), etoposid (10, 30 , 100 pM; Teva Pharma, Netherland). Procentdelen af ​​levedygtige ARO /CD133

POS og CD133

neg celler blev evalueret ved 24, 48 og 72 timer efter MTT-assay og efter 48, 96 og 120 timer efter BrdU-assay.

I apoptose evaluering, ARO /CD133

POS og CD133

neg celler blev dyrket i 6-brønds plader og behandlet med den højeste koncentration af hvert medikament (20 uM cisplatin, 2 pM doxorubicin og 100 pM etoposid) op til 120 timer. Apoptose evaluering (caspase 3-assay) blev bedømt ved flow citometry som beskrevet ovenfor.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført med SPSS v. 11 software til Windows. Data er udtrykt som middelværdi ± SD. Statistiske sammenligninger baseret på parametriske tests og statistisk signifikans blev defineret ved p 0,05. For eksperimenter med chemoterapics blev forskelle i levedygtighed ATC cellelinier beregnet med Mann-Whitney-test; p for trend med forskellige koncentrationer narkotika blev beregnet med W fra Kendall test.

Resultater

Identifikation af CD133

pos celler i ATC-cellelinjer

For at identificere CSCS i ATC cellelinjer, analyserede vi ekspressionen af ​​CD133 med flowcytometri i ARO, KAT-4, KAT-18 og FRO (fig 1A). ARO og KAT-4 viste en gennemsnitlig positivitet af 64 ± 9% og 57 ± 12%, henholdsvis; KAT-18 og FRO var negative. Resultater blev bekræftet ved QRT-PCR (fig. 1B). CD133

POS celler i ARO cellelinier blev karakteriseret ved cytoplasmatisk og polariseret lokalisering af antigenet på den apikale overflade af cellerne (fig. 1C). Den udifferentierede status ATC cellelinjer blev bekræftet i PCR ved tilstedeværelsen af ​​onfFN [26] og fraværet af thyrocyte-specifikke differentierende markører Tg, TPO og NIS [27] (fig. 2A og B).

(A) Flowcytometrianalyse af CD133 i ARO, KAT-4, KAT-18, og tilbage cellelinjer. Sorte linjer repræsenterer positiv farvning for CD133, grå linjer viser negativ kontrol med matchede isotype antistof. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (B) Analyse af CD133 ekspression i ATC cellelinier ved QRT-PCR. Data er repræsenteret som fold ændring (relativ skala), overvejer KAT-18 = 1. (C) Immuncytokemi af CD133 i ARO cellelinje. Pile angiver apikale og polariseret lokalisering af CD133 (20 × forstørrelse).

Angivelse af skjoldbruskkirtlen specifikke gener (Tg, TPO, NUS) (A) og føtal markør onfFN (B) i ARO, Kat- 4 og normal thyroid ved RT-PCR. TAD-2-cellelinien blev anvendt som positiv kontrol for onfFN mRNA. β-actin blev anvendt som intern kontrol i begge forsøg. bp = basepar.

C

ell kultur af sorterede ARO /CD133

POS celler

Cluster-dannende effektivitet sorterede ARO /CD133

POS-celler blev vurderet ved FACS-analyse, der viser 90% CD133 positivitet (fig. 3A). Efter isolation, ARO /CD133

POS celler, dyrket i SFM suppleret med bFGF og EGF, voksede som et enkelt, ikke-klæbende, sfæriske celler. Efter et par dage, begyndte ARO /CD133

POS celler til at danne klynger, som gradvist steget i antal og størrelse, selvom de ikke danner hårsække. Tværtimod ARO /CD133

neg celler næppe aggregeret i klynger (fig. 3B).

(A) Renhed af ARO /CD133

POS celler efter magnetisk celle sortering vurderet ved flowcytometri. (B) Karakteristik af sorterede ARO /CD133

pos og ARO /CD133

neg på dag 0, 3 og 10 i kulturen. ARO /CD133

POS celler dannes klynger som steg i størrelse overarbejde.

In vitro

celledeling assay, selv-fornyelse og koloni-dannende evne ARO /CD133

pos celler

Proliferation blev vurderet ved MTT og BrdU assay. ARO /CD133

POS celler viste

in vitro

øget spredning i forhold til ARO /CD133

neg celler med både MTT på 48-72 timer og BrdU på 72-144 timer (p = 0,028 og p≤0.001 henholdsvis) (fig. 4A og B). Med hensyn caspase 3, flowcytometri viste spontan apoptose i SFM, som lå efter 144 timer fra 0,5 til 2% for ARO /CD133

POS celler og fra 3.4 til 8,8% for ARO /CD133

neg celler (data ikke vist). Selvfornyelse blev også vurderet (fig. 4C). CD133 ekspressionen på ARO /CD133

POS celler oprindeligt faldt fra 90% på dag 0 til 46% på dag 8, og fastholdt en stabil tilstand indtil dag 11. Faldet i CD133 udtryk overtid blev ikke forårsaget af celledød ( 2%, data ikke vist). I stedet celleproliferation fortsatte i hele dyrkningsperioden, hvilket antyder, at ARO /CD133

POS-celler er karakteriseret ved asymmetrisk deling evne (dvs. produktionen af ​​to datterceller, en CD133

POS og en CD133

neg). Kolonidannende assay bekræftede den store selvfornyelse evne ARO /CD133

pos, i sammenligning med ARO /CD133

neg celler. Faktisk ARO /CD133

POS-celler var i stand til at danne et større antal tumor kolonier (p = 0,028) (fig. 4D og 4E).

(A) Cell proliferationsassay (MTT). Stiplet linje repræsenterer ARO /CD133

neg celler, optrukne linje svarer ARO /CD133

POS celler. Data er udtrykt som middelværdier ± SD og er repræsentative for fire uafhængige forsøg. p 0,03. (B) Cell proliferationsassay (BrdU). Stiplet linje repræsenterer ARO /CD133

neg celler, optrukne linje svarer ARO /CD133

POS celler. Data er udtrykt som middelværdier ± SD og er repræsentative for fire uafhængige forsøg. p≤0.001. (C) Self-fornyelse evne ARO /CD133

POS celler. Sort linje repræsenterer antallet af ARO /CD133

POS celler vurderes ved flowcytometri. Punkterede linie repræsenterer cellelevedygtighed vurderet ved MTT-assayet. (D) Colony dannelse assay i methylcellulose medium af sorteret ARO /CD133

pos og CD133

neg celler (40 × forstørrelse) (E) Antal kolonier af ARO /CD133

pos og CD133

neg celler efter 15 dages inkubation (p 0,03).

Behandling af ARO /CD133

pos og CD133

neg celler med kemoterapi narkotika

Drug følsomhed blev evalueret ved MTT og BrdU-assay. ARO /CD133

POS og ARO /CD133

neg celler blev inkuberet med forskellige koncentrationer af doxorubicin, cisplatin og etoposid. ARO /CD133

POS celler viste en bemærkelsesværdig lægemiddelresistens til de tre midler sammenlignet med ARO /CD133

neg celler under hele dyrkningsperioden (p ≤ 0,05 for MTT og p≤0.001 for BrdU, henholdsvis). Et repræsentativt eksperiment efter 48 timers hver behandling er vist i fig. 5A-F. I overensstemmelse med disse resultater, apoptose vurderet ved caspase 3-aktivitet viste en dramatisk aktivering i ARO /CD133

neg i sammenligning med ARO /CD133

POS-celler ved alle tidspunkter analyseres (figur 6A, repræsentant for tre uafhængige forsøg med doxorubicin ). Histogrammer på tidspunkt 72 timer er vist i figur 6B. Lignende resultater blev opnået med de andre lægemidler anvendt (data ikke vist).

(A) MTT-analyse efter 48 timers dyrkning i nærværelse af 0,5, 1, 1,5 og 2 uM doxorubicin (B) efter 48 timer i nærvær af 5, 10, 15 og 20 uM cisplatin (C) efter 48 timer i nærvær af 10, 30 og 100 pM etoposid. Data er udtrykt som middelværdier ± SD og er repræsentative for tre uafhængige forsøg (p ≤ 0,05). (D) (E) (F) repræsenterer BrdU analyse i de samme betingelser for A, B, C (p≤0.001). Stiplet linje repræsenterer ARO /CD133

neg celler og optrukne linje svarer ARO /CD133

POS celler i alle grafer.

(A) Caspase 3 aktivitet efter behandling med doxorubicin. Stiplet linje repræsenterer ARO /CD133

neg celler, optrukne linje svarer ARO /CD133

POS celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD (p≤0.001). (B) Caspase 3-aktivitet på tidspunkt 72 timer med doxorubicin. Sort linie repræsenterer positiv farvning for caspase 3, grå linje viser negativ kontrol med matchede isotype antistof. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

In vitro

karakterisering af ARO /CD133

POS celler

For yderligere at karakterisere ARO /CD133

pos befolkning, vurderet vi co-ekspression af andre stamcelle markører. MRNA ekspression af thyroidea transkriptionsfaktor-1 (TTF-1) i ARO /CD133

POS var signifikant højere end i ARO /CD133

neg celler, svarende til TAD-2 føtal thyroid cellelinje (positiv kontrol) ( fig. 7A). OLT 4 udtryk var 91 ± 3% i ARO /CD133

POS celler

vs

5 ± 1,5% i ARO /CD133

neg, tyder de pluripotente stamceller funktioner i ARO /CD133

POS celler (figur 7B). Disse data blev bekræftet ved semikvantitativ PCR, under anvendelse nTERA2 cellelinje som positiv kontrol (figur 7C). Kvantificering, udtrykt som relativ til nTERA2 tæthed viste OLT 4 mRNA-niveauer i ARO /CD133

neg celler næsten to gange lavere end i ARO /CD133

pos (35%

vs

62% henholdsvis , med nTERA2 = 100%)

(A) QRT-PCR af TTF-1 mRNA-ekspression i ARO /CD133

pos og CD133

neg celler.; TAD-2-cellelinien blev anvendt som positiv kontrol. (B) Flowcytometrianalyse OLT-4A i ARO /CD133

pos og ARO /CD133

neg celler. Sort linje repræsenterer positiv farvning for OLT 4A, grå linje viser negativ kontrol med matchede isotype antistof. (C) Semikvantitativ RT-PCR af OLT 4 mRNA i ARO /CD133

pos og ARO /CD133

neg celler. β-actin blev anvendt som intern kontrol. nTERA2 cellelinje blev anvendt som positiv kontrol. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg

Membranen stamcellemarkører c-Kit -. Udtrykt i økonomiske og sociale råd (embryonale stamceller) – og THY-1 – typiske for mesenkymale og bloddannende stamceller – var negative (data ikke vist).

diskussion

i de sidste par år har flere undersøgelser er blevet offentliggjort støtter hypotesen om, at tumorer opstår fra heterogene cellepopulationer med forskellige biologiske egenskaber. For nylig er det blevet foreslået, at stamceller, kendetegnet ved selvfornyelse og differentiering evne, kan spille en rolle i cancer udvikling [29], [30]. Da det er nødvendigt multiple mutationer forekommer i mange år, før en celle bliver til cancerceller, kan være de bedste kandidater til at akkumulere sådanne kræft-fremkaldende heterogene celler stamceller med lang levetid [5], [31]. Det er dog endnu ikke klart, hvorvidt disse CSCS stammer fra dedifferentiering af modne celler i organer eller fra hjemmehørende stamceller som progressivt erhverve en malign fænotype [32].

ATC er en af ​​de mest aggressive endokrine tumorer er kendetegnet ved høj grad af dedifferentiering [1]. Eksistensen af ​​hjemmehørende skjoldbruskkirtlen stamceller kan forklare både vedvarende spredning og heterogenitet ATC læsioner [4]. Takano et al. hypotese, at et tæt forhold mellem stamceller og carcinogenese kan eksistere i ATC [17], [26], [33]. ATC genekspressionsprofil foreslået mindst tre typer af udifferentierede celler som sin oprindelse: thyreoidea stamceller, der udtrykker onfFN mRNA, men ikke Tg, med høj differentiering potentiale, selv-fornyelse og evne til at generere anaplastisk carcinomer; thyroblasts, der udtrykker både Tg og onfFN mRNA og ikke danner hårsække; prothyrocytes, som er mere differentierede end thyroblasts, der udtrykker Tg men ikke onfFN mRNA, med evnen til at danne follikler. Mitsutake et al. har identificeret en meget lille side befolkning (SP), stærkt beriget for stamceller, i flere humane kræft i skjoldbruskkirtlen cellelinjer. Men både SP

POS og SP

neg befolkninger dannes tumorer når transplanteret i nøgne mus, viser, at kræft stamceller-lignende celler ikke er eksklusiv eller identiske med SP celler [16].

I nærværende undersøgelse, vi selv fastholder, at ATC kan stamme fra skjoldbruskkirtlen stamceller. Vi beskriver CD133

POS celler med fænotypiske karakteristika stamceller, der vokser uden at danne hårsække. Men blandt de fire cellelinjer analyseret, kun ARO og KAT-4 viste høj procentdel af CD133

POS-celler (64 ± 9% og 57 ± 12%, henholdsvis;. Figur 1A). Vore resultater stemmer overens med nylige observationer for stærkt aggressive hepatoma cellelinier, også kendetegnet ved meget høj procentdel af CD133

POS-celler [34]. Høj CD133 ekspression i ATC kan derfor forbundet med tumor aggressivitet. Men fraværet af denne markør i KAT-18 og tilbage cellelinjer, antyder, at den blotte tilstedeværelse af CD133 ikke er tilstrækkeligt, og andre markører stadig skal identificeres. Desuden som beskrevet af Takano et al. [17], fandt vi, at ARO og KAT-4 cellelinjer udtrykte onfFN men ikke Tg, TPO og NIS, bekræfter deres udifferentierede status.

For bedre at karakterisere de funktionelle og fænotypiske træk af disse formodede CSCS i ATC, vi studerede sorterede ARO /CD133

POS celler. ARO /CD133

POS celler viste højere celleproliferation rate sammenlignet med CD133

neg celler (fig. 4A og B). Endvidere blev selvfornyelse evne ARO /CD133

POS celler bekræftet ved fald i CD133 udtryk parallelt at stige i celledeling, hvilket tyder asymmetrisk division, dvs. produktion af CD133

pos og CD133

neg datter celler. Dog kan andre end asymmetrisk division (fx CD133 post-transkriptionel nedregulering) mekanismer ikke udelukkes. Minimale celledød procenter udelukke, at faldet i CD133 ekspressionen skyldtes apoptose ( 2%).

Yderligere bekræftelse af, at de fleste af de ARO /CD133

POS celler kan være stamceller /progenitorceller kommer fra ekspression analyse af andre gener relateret til “stemness”. Selvom stamceller markører c-Kit og THY-1 var negative, blev en stærk positivitet fundet for OLT 4. OLT 4 hører til POU (Pit-Oct-Unc) familie af transkriptionsfaktorer, der medierer pluripotens i økonomiske og sociale råd gennem hæmning af vævsspecifik og fremme af stilk-celle gener [22], [23]. ARO /CD133

POS sorteret celler var stærkt positiv for OLT 4A i sammenligning med ARO /CD133

neg celler, og deres ekspression var svarende til den i nTERA2 embryonale teratom cellelinie. Primerne og det monoklonale antistof, der anvendes i vores forsøg med splejsningsvariant nukleare OLT 4A udelukke enhver pseudogen kontaminering eller artefakter [24].

nukleare thyroid transkriptionsfaktor TTF-1 er en homeodomæne-holdigt protein, der tilhører til NKX-2 klasse af homeobox-gener, som er nødvendig for korrekt udvikling skjoldbruskkirtlen og anvendes som en markør for skjoldbruskkirtlen og lungecarcinom [35]. TTF-1-ekspression blev fundet signifikant højere i ARO /CD133

POS end i ARO /CD133

neg celler, med mRNA-niveauer er sammenlignelige med TAD-2 føtal thyroid cellelinje (positiv kontrol). Dette indebærer, at selv om alle ATC cellelinier dedifferentierede (fraværende udtryk for thyreoidea-specifikke gener, såsom Tg, TPO og NIS og positivitet for onfFN), i ARO /CD133

poscells en markør for skjoldbruskkirtlen organogenesen stadig vedligeholdes.

Endvidere for at funktionelt karakterisere disse putative cancer stamceller-lignende celler, testede vi følsomhed over for de mest almindelige kemoterapeutiske lægemidler anvendt i ATC, dvs. cisplatin, doxorubicin og etoposid. Cisplatin tværbinder DNA på flere forskellige måder interfererer med celledeling ved mitose, doxorubicin interagerer med DNA ved indskydning og hæmning af makromolekylære biosyntese og etoposid hæmmer enzymet topoisomerase II [36] – [38]. ARO /CD133

POS-celler afslørede en signifikant resistens over for alle lægemidler, der anvendes ved hvert tidspunkt i forhold til ARO /CD133

neg celler som påvist ved markant lavere apoptose niveauer detekteret via caspase 3 (fig. 6). Den potentielle induktion af anti-apoptotiske i stedet apoptotiske molekyler, eller blokering af thyrocyte fysiologiske reguleringsmekanismer celle-omsætning, demonstreret i andre skjoldbruskkirtlen sygdomme, såsom autoimmun thyroiditis [39], kan forklare den erhvervede evne skjoldbruskkirtlen stamceller-lignende celler til at blive resistente til kemoterapi.