PLoS ONE: Evaluering af en forudsigelse protokol til at identificere potentielle mål for Epigenetisk Omprogrammering af Cancer Associated Epstein-Barr-virus

Abstrakt

Baggrund

Epstein Barr virus (EBV) inficerer størstedelen af ​​befolkningen, der forårsager dødelige sygdomme i en lille del i forbindelse med miljøfaktorer. Efter primær infektion, EBV forbliver latent i hukommelsen B-celle-population til livet. Periodisk reaktivering af virus opstår sandsynligvis på grund af aktivering af memory-B-lymfocytter, hvilket resulterer i viral replikation og reinfektion af B-lymfocytter. Methylering af det virale DNA ved CpG-motiver fører til nedregulering af viral genekspression under latens. ZTA, nøglen viralt protein, der medierer latens /reaktivering balance, interagerer med methyleret DNA. ZTA er en transskription faktor for både virale og vært gener. En sub-sæt af sit DNA bindende sites (ZREs) indeholder en CpG motiv, som er anerkendt i sin methylerede formular. Detaljeret analyse af promotoren af ​​det virale gen

BRLF1

afslørede, at interaktion med en methyleret CpG ZRE (RpZRE3) er nøglen til at vælte den epigenetisk inaktivering af genet.

Metode og vigtigste resultater

Her er vi spørgsmålstegn ved, om vi kan bruge disse oplysninger til at identificere, hvilke værtsgener indeholder initiativtagere med lignende respons elementer. En beregningsmæssige søgning af menneskelige gener initiativtagere identificeret 274 mål, der indeholder 7-nukleotid RpZRE3 kerneelement. DNA bindende analyse af ZTA med 17 af disse mål viste, at den flankerende forbindelse med kerneelement ikke har en dybtgående indvirkning på evnen til ZTA til at interagere med de methylerede sites. En anden sammenstillet ZRE blev observeret for én promotor. ZTA var i stand til at interagere med denne hjemmeside, selv om co-belægning med RpZRE3 kerneelement ikke blev observeret.

Konklusioner /Betydning

Denne forskning viser 274 menneskelige initiativtagere har potentiale til at blive reguleret af ZTA at vælte epigenetisk inaktivering af genekspression under viral reaktivering fra latens

Henvisning:. Flower K, Hellen E, Newport MJ, Jones S, Sinclair AJ (2010) Evaluering af en forudsigelse protokol til at identificere potentielle mål for epigenetisk omprogrammering af Cancer Associated Epstein-Barr-virus. PLoS ONE 5 (2): e9443. doi: 10,1371 /journal.pone.0009443

Redaktør: Maria G. Masucci, Karolinska Institutet, Sverige

Modtaget: 14 oktober, 2009; Accepteret: December 2, 2009; Publiceret: 26 feb 2010

Copyright: © 2010 Flower et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af stipendier fra University of Sussex og Brighton og Sussex Medical School. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Epstein Barr virus (EBV) inficerer og forårsager en række sygdomme hos mennesker, herunder Burkitts lymfom, nasopharyngeal karcinom, Hodgkins sygdom, post-transplantation lymfoproliferativ disorder og infektiøs mononukleose (kyssesyge) [1] – [4]. Ligesom andre medlemmer af gammaherpesviruses familien, EBV infektion vedvarer i livet efter primær infektion. Virusset opretholdes i en tilstand af latens i memory-B-lymfocytter og lejlighedsvis reaktivering og replikation anses for at opretholde virusset inden individer [5]. I EBV-inducerede lymfomer, EBV er også til stede i en latent tilstand. I cellelinjer afledt af disse lymfomer, er det virale genom overvejende methylerede [6] – [9]. Virkningen af ​​silencing virusgenekspression ikke kun hjælpemidler unddragelse fra immunsystemet [10], men også forhindrer ødelæggelse af tumorceller ved viral replikation. Faktisk reaktivering af EBV fra latens er blevet foreslået som en vej til behandling af EBV-associerede lymfomer [11], [12].

EBV latency afbrydes efter fysiologiske aktivering af B-lymfocytter, gennem ekspression af ZTA (BZLF1, ZEBRA, EB1, Z) [13] – [15]. ZTA er en sekvens-specifikt DNA-bindende protein, som ligner bzip familien af ​​transkriptionsfaktorer og spiller en kritisk rolle i reaktivering af viral genekspression og replikation af genomet. Gennem direkte interaktion med ZTA respons elementer (ZREs) i initiativtagere, ZTA regulerer ekspressionen af ​​virale og cellulære gener. Mange vært og virale promotorer der er blevet evalueret til dato indeholder ZREs inden de proximale fem hundrede nukleotider af 5′-sekvensen. Hidtil otte har eksperimentelt verificerede bindingssteder for ZTA i deres proksimale promotorområder:

BSLF2 + BMLF1

[16], [17];

BRLF1

[18];

BZLF1

[17], [19], [20]; fælles promotor for

BHLF1

BHRF1

[19]; den lytiske

EBNA1

promotor Fp [21];

BRRF1

[22]; og

BMRF1

[23]. Desuden er 6 værtsgener direkte reguleret af ZTA gennem ZREs i deres initiativtagere

DHRS9

[

24

];

EGR1

[25], [26];

CIITA

[27];

IL-8

[28];

IL-10

[29]; og

IL-13

[

30

]. ZTA interagerer med en bred vifte af ZREs [31] og flere steder findes i nogle ZTA-responsive promotorer, undertiden i umiddelbar nærhed. Et eksempel er den virale promotor for

BZLF1

gen, Zp, som indeholder de to funktionelle ZIIIA og ZIIIB ZREs inden for en samlet spændvidde på 20 nukleotider [17], [19], [20].

ZTA har den usædvanlige træk ved at interagere med en sub-sæt ZREs, der indeholder en methyleret CpG motiv [32]. I nogle tilfælde ZTA er i stand til at interagere med den ikke-methylerede ZRE, mens det for andre ZREs interaktionen med ZTA er afhængig af methylering [22], [26], [32] – [34]. Dette har ført til klassificering af ZREs i tre klasser: klasse I ZREs ikke indeholder et CpG-motiv; klasse II ZREs indeholder en CpG motiv, der er anerkendt i både methylerede og ikke-methylerede stater; og klasse III ZREs indeholder et CpG-motiv, men indregnes kun, når methylerede [35]. Evne ZTA at interagere med methylerede CpG-indeholdende ZREs tillader ZTA at aktivere genekspression i latent viralt genom til trods for den undertrykkende methylering status og dermed vælte epigenetisk inaktivering af det virale genom [22], [32] – [35].

Til dato, tre gener med CpG-holdige ZREs er blevet undersøgt: EBV

BRLF1

, EBV

BRRF1

menneske

EGR1

[22], [26], [32] – [35]. Af disse undersøgelse af reguleringen af ​​EBV-genet

BRLF1

forudsat overbevisende dokumentation for, at interaktionen af ​​ZTA med en methyleret ZRE var medvirkende til at reaktivere EBV i lytisk cyklus i B-lymfocytter [32] – [35]. Den virale

BRLF1

gen omfatter tre ZREs i promotor proksimale område [18], [32]. To af ZREs indeholder CpG-motiver; RpZRE2, er en klasse II ZRE og det andet, RpZRE3 er en kvalitetsklasse III ZRE [35]. Evnen af ​​et enkelt punkt-mutation i ZTA at skelne mellem interaktionen af ​​ZTA med methyleret og ikke-methyleret RpZRE3 tilladt relevansen af ​​interaktionen af ​​ZTA med denne promotor, der skal etableres [34], [36], [37]. Den virale

BRRF1

gen indeholder to CpG-holdige ZREs, som ZTA kun interagerer med i deres denatureret stater [22]. Tilstedeværelsen af ​​et CpG-holdigt ZRE i promotoren for det humane

EGR1

gen, som genkendes af ZTA i sin methyleret form antyder, at EBV kan vælte epigenetisk inaktivering af værtsgener for at modulere værtscellen miljø [26].

RpZRE3 kerneelement (TCGCGAA), som klart viste sig at være nødvendig for væltning epigenetisk inaktivering af

BRLF1

i B-lymfocytter [34], [36], [37], blev valgt til at identificere alle humane gener, der indeholder en nøjagtig match til denne CpG-holdige ZRE i -500 til en region af promotoren og vurdere, om de er anerkendt af ZTA i deres naturlige sammenhæng.

Materialer og metoder

Identifikation af Menneskelige Initiativtagere indeholdende RpZRE3-Core elementer: Indledende Sampling

Promotorregioner (defineret som -500 til en basepar fra transkriptionsstartsitet) af en prøve af humane protein-kodende gener i Ensembl (49) [38] blev ekstraheret under anvendelse af Biomart data management system [39]. Prøven udgjorde 40% af det humane genom. En søgning blev foretaget efter alle forekomster af en nøjagtig (frem og bak) match for at identificere de initiativtagere med TCGCGAA RpZRE3 kerneelement

Identifikation af Menneskelige Initiativtagere indeholdende RpZRE3-Core Elements:. Whole Genome Scanning

Et identisk skærm blev iværksat på hele det humane genom fra Ensembl (50) [40], hvilket resulterede i identifikationen af ​​274 promotorer, der er udpeget af RpZRE3-promotor-274 data-sæt. De 7 nukleotider af RpZRE3 kerneelementet, sammen med 10 flankerende nucleotider på hver side, blev ekstraheret fra hver af de 5 gener fra den oprindelige prøveudtagning. De transskriptionsfaktorbindende site (TFBS) Perl moduler [41] blev anvendt til at skabe en position Vægt Matrix (PWM) baseret på hele længden af ​​disse 27-nukleotidsekvenser. TFBS Perl moduler blev også brugt til at søge i promotorområder (-500 til en) af alle humane protein-kodende gener i Ensembl 50 [40], der blev udvundet ved hjælp Biomart [39]. De promotorer som matcher PWM med en tærskelværdi 80% og indeholdt en eksakt match til RpZRE3-kernen blev yderligere filtreret med 2 kriterier (a) tilstedeværelsen af ​​CpG øer og (b) funktion (baseret på over- repræsentation af Gene Ontology (GO) vilkår [42]). Placeringen af ​​CpG øer blev forudsagt ved hjælp af EMBOSS program CpGPlot [43] med standard indstillinger. Kun gener med et CpG island stede i promotoren blev bibeholdt. GO sigt anmærkninger for molekylær funktion og biologiske processer blev udvundet fra Ensembl for hvert gen [40]. Antallet af gener i RpZRE3 promotor datasæt med hver GO term annotation blev sammenlignet med det samlede antal gener i Ensembl med samme GO sigt. GO vilkår, der skete med en væsentlig højere frekvens (p 0,05) i RpZRE3 datasæt, i forhold til hele genomet, blev defineret som overrepræsenterede

DNA Bindende Analyse af EMSA på RpZRE3 Indeholder Initiativtagere

.

Dobbeltstrenget mærkede DNA prober blev fremstillet ved mærkning af 6 pmol oligonukleotid (27 nt langt) ved 5-enden med [γ-

32P] ATP (30 pCi) under anvendelse af polynukleotidkinase (Roche). 12 pmol af den komplementære oligonukleotidstreng blev tilsat og inkuberet med det mærkede enkeltstrengede ved 95 ° C i 2 minutter, 65 ° C i 10 minutter, og 37 ° C i 30 minutter for at anneale strengene. Koncentrationen af ​​proben var 33,3 nM. Oligonukleotiderne omfattede kerne 7-mere sekvens omgivet af 20 nukleotider, der svarer til den beslægtede flankerende sekvens for hver promotor og syntetiseret. Hvor angivet i figuren, blev den centrale CpG motiv methylerede på begge cytosiner under syntesen (Sigma).

ZTA protein

in vitro

omregnes Wheatgerm ekstrakt (Promega). Dette blev inkuberet med den mærkede probe (ved en endelig sonde koncentration på 3,3 nM) i 30 minutter ved stuetemperatur, før prøven blev fraktioneret på en 8% nativ polyacrylamidgel ved 100 volt i 1 time. Efter påvisning af radioaktivt mærket DNA ved anvendelse af en Storm phosphorimager, blev de relative signaler kvantificeret under anvendelse af ImageQuant software (GE Healthcare, UK).

Konkurrence EMSAs blev udført med en 100X overskud af en dobbeltstrenget ikke-mærkede oligonukleotid udover standard EMSA reaktionen. Lige mængder af hver af de komplementære oligonukleotider blev annealet på samme måde som de mærkede prober og fortyndet til opnåelse af en opløsning koncentration på 3,33 uM. Dette blev tilsat til EMSA reaktionen ved en slutkoncentration på 333 nM (dvs. 100X overskud).

Oligonucleotider

oligonculeotides anvendt, var dobbeltstrengede versioner af følgende sekvenser (5′-3 ‘ ):

XPC GGTGCGTCACTCGCGAAGTGGAATTTG

ZC3H8 GCTTCCCGGCTCGCGAAAGGGAGGACC

HDAC2 TCCCCCACTGTCGCGAAGCTCCCGCCC

MNT CCGCGGCGTCTCGCGAAGGGAGGGGCG

cyclin L2 GGGCGGCTCCTCGCGAAGCTCCACGGC

RpZRE3 GTTTATAGCATCGCGAATTTTGAGTGC

CAPN2 CCGGGGAGGCTCGCGAATCGCGGTCCA

CDO1 CGTCCCAGCGTCGCGAACCACAGCGGC

Falz GGCGCGCAGCTCGCGAAATGCCCGGCG

KIF1B GCTTCGGCCCTCGCGAAACTCCGCCCG

LLGL1 TCGGCCGGGCTCGCGAAGGGACGCCCG

LMO4 GGATCCCGGGTCGCGAAGGGCAGCCCA

MBD4 CCTCCTGCTCTTCGCGAACCGCCCCGC

PLEKHJ1 AGCCGCTCCCTCGCGAAAGTTGGCCCC

PRKD1 CTTCCTGGGGTCGCGAACTTCCCGGGC

SEC14L CGCCCGCTACTCGCGAAGCCCAGCCCG

TADA3L GCTGCGCTTCTCGCGAAAGGGCAGGCA

TOP2B CCGCGCCCCATCGCGAAGATCCGGAGC

XPCLMNTR GGTGCGTCACTCGCGAAGGGAGGGGCG

MNTLXPCR CCGCGGCGTCTCGCGAAGTGGAATTTG

XPC Mcore GGTGCGTCACCCCCTTAGTGGAATTTG

XPCLM3Mcore GGTCCGCCTCCCCCTTAGTGGAATTTG

AP1 mut GATCCACCCCTTAGAGGAAAACATACG

Forudsigelse af transskriptionsfaktorbindende steder Brug Promo

transskriptionsfaktorbindende websted forudsigelse program PROMO [44] blev anvendt med standardindstillingen på 15% forskellighed værdi, for at identificere potentielle bzip transkriptionsfaktorbindingssites i XPC oligonukleotidet.

Resultater

Identifikation af menneskelige Promoters indeholder de RpZRE3-Core element: indledende Sampling

den oprindelige søgen efter RpZRE3-kerneelementer i en prøve af menneskelige initiativtagere afslørede 67 gener med en RpZRE3-kerneelement . 5 af disse, der er involveret i genregulering blev udvalgt til DNA-bindende analyse. Disse 5 gener var ZC3H8 (ENSG00000144161), HDAC2 (ENSG00000196591), XPC (ENSG00000154767), MNT (ENSG00000070444) og CyclinL2 (ENSG00000116148) og sammen med RpZRE3 element fra den virale

BRLF1

promotor (Rp), dannet den RpZRE3-promotor-6 data-sæt.

DNA-bindende assays blev gennemført med de methylerede former af hver af de 5 humane promotorer under anvendelse 27mer dobbeltstrengede oligonukleotider omfattende 7-nukleotid kerneelement og 10-nukleotid flankerende region på hver side sammen med RpZRE3 fra Rp. Elektroforetiske mobilitet shift assays (EMSA) blev foretaget med

in vitro

oversat ZTA protein. ZTA protein /DNA-komplekser dannet let med oligonukleotiderne fra alle seks promotorer (figur 1). Specificiteten af ​​assayet er vist ved manglen på kompleksdannelse med kontrolprotein. Derudover foretog vi konkurrence-forsøg med et overskud af umærkede oligonukleotider og omfattede en version med en mutant ZRE til yderligere sonde specificiteten af ​​interaktionen. Dette bekræfter, at ZTA interagerer med alle seks RpZRE3 kerneelementer specifikt.

(a) nukleotidsekvensen af ​​en streng af hvert oligonukleotid spænder over de angivne ZREs er vist, med det konserverede RpZRE3 kerneelementet (TCGCGAA) på linie. Dobbeltstrengede versioner af disse sekvenser blev anvendt som prober i EMSA, med de 2 cytosiner i CpG core motiv methyleret. Den RpZRE3 fra EBV BRLF1 promotor er inkluderet. (B) DNA-binding mellem

in vitro

oversat ZTA med hver probe blev foretaget af EMSA. Evnen af ​​ZTA (Z) for at interagere med proben blev sammenlignet med en ikke-programmeret oversættelse lysat (C) som en negativ kontrol. Komplekset blev separeret på en 8% gel ved elektroforese og visualiseret ved phosphoimaging. Det overskydende probe kan ses i bunden af ​​gelen. Den anvendes i hvert eksperiment probe er angivet nedenfor gelen. (C) Konkurrence af hver ZRE sekvens (ved 100X overskud) mod mærket RpZRE3 blev bestemt ved konkurrencemyndighederne EMSAs. Data fra mindst 2 eksperimenter blev taget til at beregne konkurrencen dvs. procentdelen af ​​mærkede probe fortrænges af umærket konkurrent. Methylerede ZREs blev brugt til både sonden og konkurrence. AP1 mut, et oligonukleotid tidligere vist sig ikke at interagere med ZTA [36], blev anvendt som en negativ kontrol for at definere omfanget af ikke-specifik binding. Fejl streger indikerer standardafvigelser

Identifikation af Menneskelige Initiativtagere indeholdende RpZRE3-Core Elements:. Whole Genome Scanning

Den komplette humane genom blev scannet for yderligere RpZRE3-centrale elementer. Dette resulterede i en data-sæt af 274 gener, betegnet den RpZRE3-promotor-274 data-sæt (se tabel S1). For at vurdere, om der var en påvirkning af flankerende sekvens på interaktionen af ​​ZTA med disse ZREs vi påtog en systematisk filtrering proces. Den RpZRE3-promotor-274 datasæt blev først filtreret af et Position Vægt Matrix (PWM), som blev dannet fra RpZRE3-promotor-6 data-sæt. Kampe blev yderligere filtreret for gener med mindst en CpG ø i promotoren og en overrepræsenterede GO sigt. Dette resulterede i 12 tidligere uidentificerede initiativtagere og en yderligere en, der var blevet identificeret i det første skærmbillede (Figur 2). Sammen med initiativtagerne fra den første skærm, og den virale

BRLF1

promotor (RpZRE3-promotor-6 data-sæt), disse danner RpZRE3-promotor-18 data-sæt.

(en ) den bioinformatik analyse foretaget for genomet brede scanning er repræsenteret som et flowdiagram. Genetisk input eller output er repræsenteret af ovaler og filtre ved trapezer. (B) En position Vægt Matrix (PWM) blev oprettet ved hjælp af de opstillede sekvenser af RpZRE3-promotor-6 data-sæt. Disse sekvenser er vist i fig. 1 (a). Dette blev anvendt til at filtrere genomiske data fra de humane promotorsekvenser (-500 til +1). (C) overrepræsenteret GO vilkår konstateret for de 274 gener blev identificeret. (D) De 13 gener identificeret som kandidatgener, 12 hidtil ukendte gener og en fra den første skærm, og deres tilhørende Ensembl tiltrædelse koder.

Oligonukleotider blev designet efter samme principper med 10 nukleotider i flankerende sekvens på hver side af RpZRE3-kerneelement, og evnen hos ZTA at interagere med hver lokalitet i sin methylerede form, blev vurderet. EMSA analyse afslørede, at alle tolv af de nyligt identificerede methylerede promotorer blev genkendt af ZTA (figur 3).

EMSA analyse med

in vitro

translateret ZTA protein (Z) eller en ikke-programmeret oversættelse lysat (C) med proberne angivet til højre for hver gel blev udført som beskrevet i fig. 1.

Denne analyse viste, at for RpZRE3-promotor-18 data-sæt, har flankerende sekvens omgiver methylerede kerne 7-mer element ikke have en dybtgående effekt på evnen af ​​ZTA til at interagere med initiativtagerne og derfor det centrale element var tilstrækkeligt til at lette binding. Dette blev illustreret ved genereringen af ​​en PWM hjælp sekvens fra RpZRE3-promotor-18 data-sæt (figur 4), som afslørede ubetydelig sekvenskonservering uden af ​​kerneelementet.

(a) en stilling Vægt Matrix (PWM), skabt ved hjælp af sonden sekvenser af datasæt RpZRE3-promotor-18.

Anerkendelse af ikke-denatureret Initiativtagere

ZTA er i stand til at genkende mange respons elementer, som gør ikke indeholde et CpG-motiv, og derfor ikke har en methyleret kerneelement (klasse I ZREs) [15], [35]. Desuden ZTA genkender én CpG indeholder ZRE, RpZRE2, selv i fravær af methylering (klasse II ZREs) [33]. Evne ZTA at genkende initiativtagerne i deres ikke-methylerede former kan have indflydelse på evnen af ​​EBV til at ændre deres genekspression, så vi undersøgte klassificeringen af ​​ZRE for hver af de 17 menneskelige initiativtagere.

En serie af DNA bindende eksperimenter med de oligonukleotider, der repræsenterer de menneskelige initiativtagere i RpZRE3-promotor-18 data-sæt, blev der foretaget en sammenligning ikke-methylerede med denatureret RpZRE3-centrale elementer. Interaktionen af ​​ZTA med stederne var kvantitativt, hvilket fremgår af reduktionen i kompleksdannelse som protein koncentrationen ZTA blev titreret på hver af de methylerede promotorer (figur 5). Alle bar en skærm ubetydelig binding til de ikke-methylerede oligonukleotider (mindst 10 gange lavere end de methylerede steder), og kan derfor klassificeres som klasse III ZREs.

DNA bindende analyse af

in vitro

translateret ZTA protein (Z) eller en ikke-programmeret oversættelse lysat (C) med både ikke-methylerede og methylerede versioner af proberne er angivet til højre for hver gel blev udført ved EMSA som beskrevet i fig. 1. En titrering af ZTA protein (1:02, 1:04, 1:08) blev anvendt til at sammenligne ikke-methyleret binding til den for den methylerede tilsvarende. Kvantificering af komplekserne dannet mellem ZTA og de ikke-methylerede og methylerede prober, fra mindst 2 forsøg, er vist som et histogram til højre for den tilsvarende gel. Kompleksdannelse er vist i forhold til den maksimale binding for hver probe. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser

ZTA viste en reproducerbar interaktion med den ikke-methylerede XPC oligonukleotid.; interaktionen nåede 50% af bindingen iagttaget med den methylerede oligonucleotid (figur 5). Dette rejser muligheden for, at XPC kerne RpZRE3 element er påvirket af den flankerende sekvens til at opføre sig som en klasse II ZRE.

Yderligere ZRE sammenstillet med en RpZRE3-Core Element i flankerende-regionen

For at identificere hvorvidt sekvenser, der giver methylering uafhængig anerkendelse var begrænset til en bestemt flanke af XPC, en serie af mutant oligonucleotidprober, udveksles flankerende sekvenser mellem XPC og en klasse III-sted (MNT), som ikke indregnes, når ikke-methylerede blev designet. Analyse af interaktionen med ZTA af EMSA viste, at evnen til at give ZTA binding boede i 5′-sekvensen af ​​XPC; den hybride XPCLMNTR kunne binde men MNTLXPCR var ikke (figur 6). Dette antydede, at 5’XPC flankerende sekvens af RpZRE3 element påvirket binding. Det var imidlertid overraskende at opdage, at mutation af RpZRE3 element i XPC forhindrede ikke interaktion med ZTA (figur 6).

(a) Skematisk fremstilling af proberne, der illustrerer XPC og MNT prober, og flank swap prober XPCLMNTR og MNTLXPCR, der støder op til den tilsvarende EMSA analyse, udført på samme måde som beskrevet i fig. 1. (b) Kvantificering af komplekserne dannet med hver probe, fra 2 eksperimenter blev foretaget. Kompleksdannelse er repræsenteret som en procentdel af ZTA kompleks med det ikke-methylerede XPC probe. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser. (C) Skematisk fremstilling af prober, der angiver muteret kernesekvens. EMSA analyse blev udført som beskrevet i fig. 1. (d) Kvantificering af komplekserne dannet med hver probe, fra 2 eksperimenter blev foretaget. Kompleksdannelse er repræsenteret som en procentdel af ZTA kompleks dannet med den ikke-methylerede XPC probe. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser.

En yderligere forklaring til vekselvirkningen mellem ZTA med den ikke-methylerede XPC promotor er, at en uklar ZRE er til stede i 5′-flanke. For at løse dette yderligere vi forsøgt at identificere formodede ZREs i XPC-promotoren ved anvendelse af transskriptionsfaktoren bindingsstedet forudsigelse program PROMO [44], [45]. Selv om dette program indeholder en PWM for ZTA bindingssteder blev ingen forudsagt i denne sekvens. forudsagt imidlertid PROMO tilstedeværelsen af ​​AP1, c-fos og c-jun bindingssites inden 5’flanke af XPC (5’TGCGTCA) (figur 7). c-fos og c-jun proteiner er begge medlemmer af bzip transkriptionsfaktor familie; de danner AP1-DNA-bindingsaktivitet som enten homodimerer eller heterodimerer. Det er relevant, at fos /jun dimerer deler nogle DNA anerkendelse motiver med ZTA [15] – [17], [31], [46] – [49]. Dette førte til den hypotese, at det forudsagte AP1-sted i 5′-flankerende sekvens er en ekstra ZRE der er ansvarlig for binding til den ikke-methylerede XPC oligonukleotid. For at teste hypotesen blev yderligere mutationer indført i 5’XPC flankerende sekvens i det forudsagte AP1 stedet (5’TCCGCCT). Evne ZTA til at interagere med dobbelt AP1 /core mutant websted (XPCLM3Mcore) blev sammenlignet med kernen kun mutant. Dobbelt mutation af det forudsagte AP1 stedet og kernen ophævet evne ZTA at interagere med XPC oligonukleotid, hvilket viser, at binding af ZTA til den ikke-methylerede XPC websted boet sammen med denne AP1 (figur 7).

(a) PROMO transkriptionsfaktor bindingssted forudsigelse software identificeret en AP1 hjemmeside, som er fremhævet i 5’flanke sekvens af XPC. De specifikke nukleotidmutationer er understreget. De dannede komplekser af EMSA er vist til højre for den tilsvarende probesekvens. (B) Kvantificering af komplekserne dannet med hver probe, fra 2 eksperimenter blev foretaget. Kompleksdannelse er repræsenteret som en procentdel af ZTA kompleks dannet med XPC muterede kerne probe. Fejl streger indikerer standardafvigelser.

Denne analyse viste, at RpZRE3 kerneelement ikke er anerkendt i sin ikke-methylerede tilstand i forbindelse med nogen af ​​de virale eller cellulære promotorer i RpZRE3-promotor-18 data-sæt, og at denne ZRE specifikt indregnes, når methyleres.

diskussion

en beregningsmæssige søgningen gav et sæt af 274 menneskelige gener med cellulære promotorer, der indeholder 7-mer RpZRE3 kerneelement. Flankerende sekvens kan påvirke interaktionen af ​​nogle transkriptionsfaktorer med DNA, for eksempel, er interaktionen af ​​E2F-familien med DNA påvirkes af en region på mindst 8 nukleotider 5 ‘og 11 nukleotider 3’ for den centrale nucleotid [50]. Før tildele alle 274 gener som kandidater til regulering af ZTA, var det vigtigt at vurdere, om den beslægtede flankerende sekvens havde en dybtgående effekt på binding af ZTA. Behandling af sekvenserne er repræsenteret i den flankerende sekvens for dette sæt af gener afslørede det at være forskellige; alle fire nukleotider var repræsenteret i 55% af stillinger, og tre af de fire nukleotider var repræsenteret på de resterende positioner. Faktisk umiddelbar flanke af RpZRE3 kerneelement, der består af fire nukleotider både 5 ‘og 3’, havde 100% repræsentation af alle fire nukleotider. Det kan derfor konkluderes, at den flankerende sekvens ikke forhindrer binding til methylerede RpZRE3 kerne, og en PWM genereret fra RpZRE3-promotor-18 data-sæt viste lidt bevarelse uden for kernen motiv. I modsætning hertil interaktionen med det ikke-methylerede kerneelement oprindeligt syntes at blive påvirket af flankerende sekvens i kun 1 af de 18 promotorer. yderligere analyse afslørede imidlertid, at dette er på grund af tilstedeværelsen af ​​en anden ZRE i flankerende sekvens.

Disse resultater viser, at metoden med at foretage en beregningsmæssig mønster match søgning efter 7-mer RpZRE3 kerneelementet er en hurtig og pålidelig metode til at identificere initiativtagere indeholder ZREs, der er anerkendt af ZTA kun når de methylerede (klasse III ZREs)

identifikationen af ​​to tilstødende sidestillede ZREs i XPC promotor præsenterer en interessant problem.; kan begge steder være besat på én gang? Den naturlige sammenstilling af ZREs er tidligere blevet beskrevet for en viral promotor;

BZLF1

og en cellulær promotor

EGR1

. I

BZLF1

promotor er elementerne beliggende med 12 basepar mellem de centrale nukleotider; begge kan være besat samtidigt og begge er funktionelt relevant [17], [19] – [20]. For

EGR1

promotor, elementerne er umiddelbart op med mellem de centrale nukleotider [25], [26] kun 8 nukleotider. Der er ingen beviser for samtidig besættelse af ZTA og kun ét element synes at være funktionelt

in vivo

[26]. Arrangementet af

XPC

promotor placerer elementerne 8 nukleotider fra hinanden, er identiske med

EGR1

, og der er ingen beviser fra de DNA-bindende eksperimenter til samtidig besættelse af lokaliteterne. Som en ZRE indregnes i en methylering-afhængig måde, og den anden indregnes, når ikke-methyleret, er det muligt, at arrangementet kan tilvejebringe en fejlsikker mekanisme til at sikre, at genet er reguleret i både dets methylerede og ikke-methylerede stater .

den enkle beregningsmæssige tilgang til at identificere placeringen af ​​denne methylering-afhængige og nye DNA-bindende motiv i menneskelige gener initiativtagere identificeret 274 gener potentielt reguleres ved at overvinde epigenetisk inaktivering under viral replikationskapacitet cyklus. I betragtning af de kendte funktioner ZTA i omprogrammering viral genekspression, forstyrrer cellecyklus kontrol og replikerende virus-DNA, er det interessant at bemærke, at Gene ontologi vilkår, der er overrepræsenteret i RpZRE3-promotor-274-gen-sæt er stort set involveret i transskription, kromatin re-modellering og mitose. Dette tyder stærkt på, at ZTA kan aktivere dette sæt af cellulære gener med henblik på at opnå disse funktioner. Test, om disse gener aktiveres under latens forstyrrelser i hukommelsen B-lymfocytter

in vivo

er teknisk udfordrende gives både knapheden på memory B-lymfocytter i perifere kredsløb og få tilfælde af ventetid forstyrrelser

in vivo

.

samhusning af RpZRE3 kerneelement i 274 menneskelige initiativtagere er usandsynligt, at have været drevet af en evolutionær fordel for virus, men kan afspejle inddragelse af et cellulært transkriptionsfaktor interagere med det samme element . Dette tyder på, at dette sæt af gener deler en fælles form for regulering under menneskets udvikling eller differentiering. Desuden vil det være interessant at spørge, om samtidig forekomst af RpZRE3-kernen med andre transskription faktor bindingssteder danner et kooperativ

cis

-regulator modul, der kan belyse reguleringen af ​​disse vært og virale gener .

Støtte Information

tabel S1.

RpZRE3-promotor-274 data-sæt:. En tabel af gener, som indeholder en RpZRE3 kerneelement i 500 bp promotor omegn doi: 10,1371 /journal.pone.0009443.s001

(0,05 MB XLS )

tak

Vi takker Queensta Miller og James Heather til diskussion.