PLoS ONE: Lang Ikke-Coding RNA ucoo2kmd.1 Regulerer CD44-afhængig cellevækst ved at konkurrere om miR-211-3p i kolorektal cancer

abstrakt

Foruden protein-kodende gener, det humane genom gør en stor mængde af ikke-kodende RNA’er. Lange ikke-kodende RNA’er (lncRNAs) er blevet beskrevet som den største undergruppe af den ikke-kodende transkriptom i humane ikke-kodende RNA’er. I de senere år har lncRNAs blevet anset for at være de vigtigste regulatorer af tumor adfærd. I denne undersøgelse, baseret på tidligere forskning, vi undersøgte udtryk og biologiske rolle af et nyligt identificerede kræft-relaterede lncRNA,

lncRNA-uc002kmd

.

1

. Vi analyserede forholdet mellem

lncRNA-uc002kmd

.

1

og kolorektal cancer (CRC) i en total 45 CRC og parrede tilstødende, ikke-tumor vævsprøver. Vi fandt, at

lncRNA-uc002kmd

.

1

ekspression blev sædvanligvis højt udtrykt i carcinoma sammenlignet med vævet tilstødende til carcinom. Gennem en række eksperimenter, viste resultaterne, at

lncRNA-uc002kmd

.

1

regulerer CD44 som en molekylær lokkedue for miR211-3p. Vores data viste, at overekspression af

lncRNA-uc002kmd

1

forbedret celleproliferation i CRC

Henvisning:.. Wu X, han X, Li S, Xu X, Chen X, Zhu H (2016) lang Ikke-Coding RNA ucoo2kmd.1 Regulerer CD44-afhængig cellevækst ved at konkurrere om miR-211-3p i kolorektal cancer. PLoS ONE 11 (3): e0151287. doi: 10,1371 /journal.pone.0151287

Redaktør: Yifeng Zhou, Medical College of Soochow University, KINA

Modtaget: 10. januar, 2016 Accepteret: 25 Feb 2016; Udgivet: 14. marts 2016

Copyright: © 2016 Wu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. projektet blev støttet af en bevilling fra Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (LY16H160048). Også dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Wenzhou Public Welfare Technology Project (Y20140707), også blev støttet af en bevilling fra Inkubation Projekt af The First Affiliated Hospital i Wenzhou Medical University (FHY2014009). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en vigtig folkesundhedsproblem globalt og er fortsat en væsentlig årsag til dødelighed af kræft i den udviklede verden, hovedsagelig på grund af sin tilbøjelighed til at metastaserer [1]. Det er den anden mest almindelige kræftform diagnose blandt kvinder og den tredje mest almindelige blandt mænd [2]. Selvom resultaterne i kolorektal cancer forskning er der stadig behov for bemærkelsesværdige, nye og effektive terapeutiske strategier. Søgningen efter nye biomarkører for metastatisk progression i kolorektal cancer haster.

Lange ikke-kodende RNA (lncRNAs), som omfatter ikke-kodende transskriptioner af mere end 200 nukleotider, er blevet beskrevet som den største underklasse af ikke-kodende transkriptom hos mennesker [3]. En væsentlig del af tidligere forskning har fokuseret på de lovgivningsmæssige og strukturelle rolle lncRNAs på flere vigtige biologiske processer såsom kromosom inaktivering, celledifferentiering, genomisk prægning og udvikling, og celledeling [4, 5]. I de senere år, med en bred rolle for lncRNA under udvikling af kræft, et stigende antal undersøgelser af dens tilknytning til forekomsten af ​​udvikling af kræft (f.eks undersøgelser vedrørende CRC [2, 6], esophageal planocellulært karcinom (ESCC) [7], og gastrisk cancer (GC) [8]) er blevet offentliggjort. På trods af disse resultater, vores nuværende viden om ekspressionsmønstre og funktionel rolle lncRNAs i CRC fortsat begrænset.

For nylig en undersøgelse fundet en roman lncRNA i GC,

lncRNA-uc002kmd

.

1

, også betegnet

GAPLINC

. Denne lncRNA danner en molekylær lokkedue for miR211-3p, som er rettet mod CD44 for nedbrydning, og overekspression af

lncRNA-uc002kmd

.

1

kunne derfor forbedre CD44-ekspression ved at konkurrere om miR-211- 3p, der bygger en model for

lncRNA-uc002kmd

.

1

medieret celle migration og proliferation i gastrisk kræft [9, 10]. Som en af ​​de mest formodede stamcellemarkører, CD44 spiller en central rolle i mange cellulære processer, herunder cancercellevækst og migration [11]. Derudover har tidligere undersøgelser vist, at CD44 er et velkendt stamcelle markør for CRC [12].

På grundlag af disse oplysninger, vi hypotese i denne undersøgelse, at

lncRNA-uc002kmd

.

1

kunne spille en lignende rolle i CRC. For at teste denne hypotese, vi udledes en måde at afgrænse den transkriptionelle aberration af

lncRNA-uc002kmd

.

1

mellem CRC og parrede tilstødende, ikke-neoplastiske væv.

Materialer og metoder

undersøgelse emner

Homogen Han kinesisk omfattede de emner, der deltager i denne undersøgelse. Fyrre-fem CRC og tilsvarende tilstødende vævsprøver blev opnået fra patienter på First Affiliate Hospital i Wenzhou Medical University (Wenzhou). Der var ingen restriktioner på alder, stadium af CRC, køn eller histologi. Ved rekruttering, blev hver deltager planlagt til en samtale ved hjælp af en epidemiologisk spørgeskema, efter at give skriftligt informeret samtykke. Medicinsk Ethics Committee Wenzhou Medical University godkendt denne undersøgelse. De kliniske karakteristika for alle patienter er anført i tabel 1, som beskrevet detaljeret tidligere [13].

Cellekultur

Humane colorektale cancer-cellelinier, HCT116 og SW480, var købes fra Cell Bank of Type Culture Collection af det kinesiske Academy of Sciences, Shanghai Institute of Cell Biology, og blev overført til mindre end 6 måneder. Procedurerne cellekultur er blevet offentliggjort andetsteds [13]. Celler blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2 i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, penicillin og streptomycin i en 10 ml kultur skålen.

RNA-ekstraktion og rea- time kvantitativ polymerasekædereaktion

TRIzol

® reagens (Invitrogen) blev anvendt til at isolere total RNA fra celler og væv, ifølge producentens instruktioner. Den relative genekspression af

GAPLINC

blev bestemt ved anvendelse af ABI Prism 7500 påvisning sekvens-system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

GAPDH

blev anvendt som en indre standard kontrol, og alle reaktioner blev udført i tre eksemplarer [14, 15]. Primerne anvendt til qPCR amplifikation inkluderet den forreste GTTTCCTGGAAGGGCATTTT og bakgear CAATCAGGGCTCTTGGACTC.

Konstruktion af reporterplasmider

Fremgangsmåden til konstruktion af reporterplasmider er offentliggjort andetsteds [9]. Den pGL3 promotor vektor (GENECHEM) blev anvendt til at konstruere de plasmider pGL3-

lncRNA-uc002kmd

.

1

-3’UTR (plasmidet indeholder

lncRNA-uc002kmd

.

1

3’UTR) og pGL3- CD44-3’UTR. Alle konstruktionerne blev verificeret ved DNA-sekventering.

Forbigående transfektioner og luciferaseassays Salg

HCT116 og SW480 blev transficeret med reporter plasmider ved anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA), ifølge producentens instruktioner. Anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) til måling af luciferaseaktiviteten er offentliggjort andetsteds [16]. Tre uafhængige forsøg blev udført, og hver gruppe omfattede 6 replikater.

actinomycin D assay

HCT116 og SW480 blev transient transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) og co-transficeret med MIR-211-3p, som angivet, i 24 timer; Cellerne blev derefter eksponeret for actinomycin D (Sigma, St. Louis, MO). Cellerne blev høstet og stabiliteten af ​​den

lncRNA- uc002kmd

.

1

mRNA blev analyseret ved hjælp af kvantitativ revers transkriptase PCR (QRT-PCR), som tidligere beskrevet [13].

Western blot-

Western blot-analyse blev udført for at vurdere CD44 og A-action-ekspression som tidligere beskrevet [13]. The Western blotting-analyse blev gentaget mindst tre gange.

Cellelevedygtighed assay

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) systemet (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan) blev anvendt til måling cellelevedygtighed, ifølge producentens anvisninger [16]. Der var seks replikater for hver gruppe, og forsøgene blev gentaget mindst 3 gange.

statistiske analyser

Sammenhængen mellem ekspression af

lncRNA-uc002kmd

.

1

og

CD44

gen i CRC væv blev vurderet ved hjælp af envejs variansanalyse og lineær regressionsmodeller. Forskelle mellem grupperne blev vurderet ved anvendelse af parret, 2-tailed t-test. En

P

-værdi af 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Cellular karakterisering af

LncRNA-uc002kmd

1

for at bestemme den cellulære lokalisering af

lincRNA-uc002kmd

.

1

, niveauerne af kontrol udskrift nukleare (

U6

) og cytoplasmatisk kontrol udskrift (

GAPDH

mRNA) blev påvist ved RT-qPCR på det nukleare og cytoplasmatiske fraktioner henholdsvis. For HCT116 cellelinien, QRT-PCR-analyse afslørede, at (middelværdi ± SEM) 89,8%

lincRNA-uc002kmd

.

1

blev påvist i den nukleare fraktion, og 13,1% var beliggende i cytoplasmatisk fraktion. Lignende resultater blev opnået med SW480-cellelinien, specifikt 89,2% og 11,8%

lincRNA-uc002kmd

.

1

blev påvist i den nukleare fraktion og de cytoplasmiske fraktioner, henholdsvis (fig 1A) .

(A) niveauerne af nukleare kontrol udskrift (U6), cytoplasmatisk kontrol udskrift (GAPDH mRNA) og

lincRNA-uc002kmd

.

1

blev vurderet af qRT- PCR med nukleare og cytoplasmatiske fraktioner. Data er gennemsnit ± SEM. (B) Northern blot analyse af

lincRNA-uc002kmd

.

1

udtryk i CRC celler. (C) Maksimal CSF snesevis af

lincRNA-uc002kmd

.

1

ved analyse med PhyloCSF. Scoren er -178,6075. (D)

lincRNA-uc002kmd

.

1

blev udtrykt på et højere niveau i CRC væv i forhold til at matche CRC tilstødende væv. Udtrykket niveau af

lincRNA-uc002kmd

.

1

blev analyseret ved QRT-PCR normaliseret til

GAPDH

. Data er repræsenteret som middelværdi ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (E) De lineære korrelationer mellem

lincRNA-uc002kmd

.

1

ekspressionsniveauerne og CD44 mRNA blev testet. Den relative udtryk værdi blev normaliseret ved

GAPDH

udtryk niveau. (F, G)

lincRNA-uc002kmd

.

1

udtryk væsentligt påvirket CD44 mRNA-ekspression. Knockdown af

lincRNA-uc002kmd

.

1

faldt CD44-ekspression, mens ektopisk udtryk for GAPLINC øget CD44 mRNA-niveau. (H) De protein niveauer af CD44 blev vurderet i CRC-celler (HCT116 celler og SW480 celler) ved Western blot.

LincRNA-uc002kmd

.

1

kunne detekteres som en udskrift af den forventede størrelse ved northern blotting (fig 1B) i CRC-celler. Samtidig undersøgte vi kodning potentiale

lincRNA-uc002kmd

.

1

bruge PhyloCSF, at PhyloSCF score er -178,6075 viste dette resultat det lave kodning potentiale

lincRNA -uc002kmd

.

1 Hotel (fig 1C).

LncRNA-uc002kmd

.

1

er opreguleret i CRC væv

udtrykket niveau af

lncRNA-uc002kmd

.

1

blev undersøgt ved hjælp af real-time PCR i 45 par af CRC væv og matchede tilstødende normale væv. Detaljerede kliniske funktioner er præsenteret i tabel 1.

lncRNA-uc002kmd

.

1

udskrifter blev udtrykt ved højere niveauer i tumorvæv sammenlignet med tilstødende normale væv (Fig 1D).

Foreningen af ​​

lncRNA-uc002kmd

.

1

og

CD44

i CRC

Vi testede sammenhængen mellem

lncRNA-uc002kmd

.

1

og

CD44

i yderligere 15 par af CRC adjuvans ikke-kræft væv. Resultaterne viste, at patienter med højere

lncRNA-uc002kmd

.

1

ekspressionsniveauerne i CRC væv vises betydelig opregulering af CD44 (

R

2

= 0,24,

P

0,05;. figur 1E)

Brug specifikke siRNA’er, knockdown af

lncRNA-uc002kmd

1

væsentligt reduceret CD44-ekspression, mens overekspression af

lncRNA-uc002kmd

.

1

forbedret CD44 mRNA-niveauer (fig 1F og 1G). Western Blot resultater konsekvent viste, at knockdown af

lncRNA-uc002kmd

.

1

faldt CD44 protein niveauer i HCT116 cellelinie, mens overekspression af lncRNA-uc002kmd.1 øget CD44 protein niveauer. Lignende resultater blev fundet i SW480 cellelinje (figur 1 H).

LncRNA-uc002kmd

.

1

regulerer

CD44

udtryk ved at konkurrere om miR -211-3p

Tilfældigvis miRNA kendt som miR-211-3p blev forudsagt mål for både

lncRNA-uc002kmd

.

1

og CD44. For at verificere rolle miR-211-3p i CRC celler, vi klonede 3’UTR af CD44 og

lncRNA-uc002kmd

.

1

nedstrøms en luciferasegen og cotransficeret disse reportere med mIR-211-3p efterligner i CRC celler. Som vist i figur 2A, MIR-211-3p faldt betydeligt luciferase signaler af begge reportere. Desuden målte vi CD44 og

lncRNA-uc002kmd

.

1

niveauer i CRC celler efter behandling med miR-211-3p efterligner. Som forventet, CD44 og

lncRNA-uc002kmd

.

1

niveauer blev signifikant reduceret (figur 2B). Ud over dette, tester vi ekspressionsniveauet af CD44 og miR-211-3p i 15 par CRC væv, demonstrerer resultaterne en negativ korrelation mellem miR211-3p og CD44-ekspressionsniveauer (

R

2

= 0,24,

P

0,05;.. figur 2C)

(A) Begge

lincRNA-uc002kmd

1

CD44 er målrettet af miR-211-3p. MIR-211-3p faldt betydeligt de luciferase signaler både

lincRNA-uc002kmd

.

1

og CD44. (B) Den CD44 og

lncRNA-uc002kmd

.

1

niveauer blev signifikant reduceret. Dataene er gennemsnit ± SEM, normaliseret til

GAPDH

. (C) De negative korrelationer mellem

lincRNA-uc002kmd

.

1

ekspressionsniveauerne og CD44 mRNA blev testet.

Efter knockdown af

lncRNA- uc002kmd

.

1

af siRNA, vi klonede 3’UTR-regionen i CD44 i en luciferase reporter og cotransficeret konstruktionen med

lncRNA-uc002kmd

.

1

siRNA eller kontrol siRNA. Resultaterne viste derefter, at knockdown af

lncRNA-uc002kmd

.

1

væsentligt reduceret intensitet luciferase. Alle disse resultater antydede, at miR-211-3p kunne målrette

lncRNA-uc002kmd

.

1

og CD44, og at

lncRNA-uc002kmd

.

1

er nødvendig for den rigelige udtryk for CD44 (fig 3A).

(A) reporter vektor var cotransficeret til CRC celler, som blev behandlet af

lncRNA-uc002kmd

.

1

siRNA eller kontrol siRNA. Luciferase signal blev signifikant nedsat. (B) Celler blev høstet og stabiliteten af ​​

lncRNA-uc002kmd

1

mRNA blev analyseret ved QRT-PCR i forhold til tid 0 efter blokering nye RNA-syntese med actinomycin D.; data er gennemsnit ± SEM, normaliseret til

GAPDH

. (C) HCT116 og SW480-celler blev podet i plader med 96 brønde efter blevet transficeret, og celleproliferation blev udført dagligt i 3 dage under anvendelse af CCK-8 assay. Seks replikater for hver gruppe og eksperimentet gentaget tre gange. Data aremean ± SEM. *

P

0,05 sammenlignet med kontroller. (D) Data viste tumor mængder af xenografter i hver gruppe 4 uger efter subkutant implanteret stabile CRC celler. Mean tumorvolumener fra seks nøgne mus i hver gruppe er vist på forskellige tidspunkter. *

P

. . 0,05 sammenlignet med kontroller

LncRNA-uc002kmd

1

modulerer cellevækst

Vi yderligere undersøgt effekten af ​​

lncRNA-uc002kmd

.

1

på celleproliferation i

vitro

. CRC celler blev transficeret med miR-211-3p efterligner eller med en miR-211-3p inhibitor, og Udskriften niveauer i

lncRNA-uc002kmd blev

nedreguleret efter RNA-syntese blev blokeret med actinomycin D i tilstedeværelse af mIR-211-3p (nedreguleret fra 100% til 54% ± 3,2% i nærvær af 1 pmol mIR-211-3p og nedreguleres fra 100% til 28% ± 3,2% i nærvær af 40 pmol miR-211-3p).

Vi udførte CCK-8 analyser til at teste effekten af ​​

LincRNA-uc002kmd

.

1

på celleproliferation i CRC celler. Vi observerede en konsekvent stigning i celledeling af HCT116 (38% stigning) og SW480 (31% stigning) cellelinjer når

LncRNA-uc002kmd

.

1

blev overudtrykt på fysiologiske niveauer gennem CCK -8 analyser, sammenlignet med kontrolgruppen. Ud fra følgende betragtninger

lncRNA-uc002kmd

.

1

nedreguleret cellerne, spredning af den HCT116 (50% fald) og SW480 (27% fald) cellelinjer faldt konsekvent (fig 3C) .

LncRNA-uc002kmd

.

en

accelerere tumorvækst i xenograft

for at undersøge den biologiske betydning af

LncRNA-uc002kmd

.

1

på tumorvækst, xenograft blev subkutant injiceret med CRC celler. Som det er vist i figur 3D, væksten af ​​tumorer fra opreguleret

LncRNA-uc002kmd

1

xenografter blev signifikant øget sammenlignet med kontrol- xenotransplantater:. 423,3 ± 71,6 mm

3 versus 600 ± 17,6 mm

3 for HCT116 celler (

P

0,05); og 420 ± 70,8 mm

3 versus 616.7 ± 21,7 mm

3 for SW480 celler (

P

0,05). henholdsvis

Diskussion

I denne undersøgelse identificerede vi

lncRNA-uc002kmd

.

1

i CRC og fandt at det var dramatisk opreguleret i CRC væv under anvendelse af revers transkriptase polymerasekædereaktion assay, hvilket indikerer den potentielle funktion af

lncRNA-uc002kmd

.

1

i CRC. En række forsøg har vist sammenhængen mellem

lncRNA-uc002kmd

.

1

, miR-211-3p og CD44, konkluderes, at

lncRNA-uc002kmd

.

1

regulerer CD44-afhængig cellevækst ved at konkurrere om miR-211-3p i kolorektal cancer. Vores resultater viser, den vigtige rolle,

lncRNA-uc002kmd

.

1

under CRC tumorigenese.

LncRNAs dukker op som centrale aktører i forskellige grundlæggende biologiske processer og en voksende mængde af forskning har foreslået, at lncRNAs er vigtige aktører i udviklingen af ​​kræft [17-19]. Den mest kendte lncRNA, hotair, opreguleres i galdeblæren cancer (GBC), som fører til tumormetastaser gennem ændret methylering af histon H3 lysin 27 (H3K27) og genekspression [20, 21].

Linc-POU3F3

øges i ESCC prøver, som gennem interaktion med

EZH2

at fremme methylering af

POU3F3

, derefter fremme tumor udvikling [22]. Andre end disse kommenteret-lncRNA, ikke-kommenteret lncRNA har haft den ønskede effekt på udviklingen af ​​mange maligne tumorer, såsom kolorektal cancer-associeret lncRNA (CCAL) fremme CRC progression af den aktiverede Wnt /β-catenin vej [23] . En nylig rapport viste, at

lncRNA-uc002kmd

.

1

, også kendt som GAPLINC, var opreguleret i GC og vises også betydelige prædiktiv effekter i diagnose og prognose af mavekræft, mens i vores undersøgelse,

lncRNA-uc002kmd

.

1

var også involveret i fremme af CRC udvikling.

Dernæst undersøgte vi de mekanismer, som

lncRNA -uc002kmd

.

1

udøver sin funktion i maligne CRC fænotyper. Vores resultater viste klart, at når tavshed

lncRNA-uc002kmd

.

1

udtryk blev CRC celledeling hæmmet. Vore data også bekræftede, at

lncRNA-uc002kmd

.

1

danner en molekylær lokkedue for miR211-3p. Det er almindeligt kendt, at miRNA er korte RNA-sekvenser, selvom målsekvenser af 3’UTRs af mRNA’er derefter negativt manipulere genekspression. MiRNA er involveret i forskellige biologiske processer, såsom celleproliferation, udvikling, differentiering og metabolisme. Generelt miRNA spiller en afgørende rolle i genregulering, primært ved at målrette rigelige protein-kodende gener. Stigende grad har dog mere forskning fundet, at miRNA også kan udføre deres funktion ved målretning lncRNAs [24]. Teorien om konkurrencedygtig endogent RNA viste, at kodende gener og lncRNAs kan regulere hinanden gennem deres konkurrence om miRNA binding [25]. Ifølge denne teori, kan lncRNAs udøve deres indflydelse på mål ved at tjene som lokkefugle for miRNA.

I dette papir, identificerede vi CD44 protein som en vigtig del af den

lncRNA-uc002kmd

.

1

– miRNA regulatoriske netværk. Brug af luciferase reporter analysen, fandt vi, at CD44 undertrykkes af miR-211-3p, og denne funktion er svækket af

lncRNA-uc002kmd

.

1

overekspression. Vi fandt også, at niveauet for CD44 protein gradvist med stigende niveauer af

lncRNA-uc002kmd

.

1

.

CD44 er en celle overflade transmembrant glycoprotein, der spiller en væsentlig rolle i en række biologiske funktioner [26]. Tidligere undersøgelser har vist, at CD44 spiller en kritisk rolle i AML udvikling og variationerne af CD44 kan påvirke dets ekspression, hvilket fører til forskellige risici for AML [15]. Derudover CD44 er et vigtigt stamcellemarkør for flere faste tumorer, hvilket fører til udviklingen og progressionen af ​​cancer [27]. CD44 kan anvendes som en ny markør for egenskaber og styring af mange tumorer såsom GC [28] eller CRC [11]. For nylig har mange undersøgelser vist en signifikant sammenhæng mellem niveauet for

CD44

udtryk og brystkræft tumorgenicitet, som fremhæver den vigtige rolle,

CD44

i tumorprogression og metastase [11, 29, 30 ]. I vores undersøgelse viste vi, at miR211-3p binder til 3’UTR region af CD44, målretning CD44 for nedbrydning. Gennem miR211-3p vildledning,

lincRNA-uc002kmd

.

1

øger CD44 udtryk.

Kollektivt, vores resultater viser, at

lincRNA-uc002kmd

.

1

kan forbedre CD44-ekspression ved at konkurrere om miR-211-3p efterfølgende mediere celle migration og proliferation i CRC.

Tak

projektet blev støttet af en bevilling fra Natural Science Foundation of Zhejiang-provinsen i Kina (LY16H160048). Også dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Wenzhou Public Welfare Technology Project (Y20140707), også blev støttet af en bevilling fra Inkubation Projekt af The First Affiliated Hospital i Wenzhou Medical University (FHY2014009).