PLoS ONE: opregulering af Autophagy-Related Gene-5 (ATG-5) er forbundet med kemoresistens i Human Gastric Cancer

Abstrakt

Autophagy-relateret gen-5 (ATG-5) er en af ​​de vigtigste regulatorer af autophagic celledød. Det er blevet bredt anerkendt som en beskyttende molekylær mekanisme for tumorceller under kemoterapi. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi ekspressionsmønsteret for ATG-5 og multiresistens-associeret protein-1 (MRP-1) i 135 gastriske cancere (GC) patienter, som blev behandlet med epirubicin, cisplatin og 5-FU adjuvans kemoterapi (ECF ) efter kirurgisk resektion og udforskede deres potentielle kliniske betydning. Vi fandt, at både ATG-5 (77,78%) og MRP-1 (79,26%) blev højt udtrykt i GC patienter. ATG-5-ekspression var signifikant associeret med dybde væg invasion, TNM stadier og fjernmetastaser af GC (P 0,05), hvorimod MRP-1-ekspression var signifikant forbundet med tumorstørrelse, dybde væg invasion, lymfeknude metastaser, TNM stadier og differentiering status (P 0,05). ATG-5-ekspression var positivt korreleret med MRP-1 (rp = 0,616, P 0,01). Øget ekspression af ATG-5 og MPR-1 var signifikant korreleret med dårlig samlet overlevelse (OS; P 0,01) og sygdomsfri overlevelse (DFS; P 0,01) i vores GC kohorte. Desuden vi demonstreret, at ATG-5 var involveret i narkotika resistente af GC celler, som primært var gennem regulering autofagi. Vore data antyder, at opreguleret ekspression af ATG-5, et vigtigt molekylært træk ved beskyttende autofagi, er forbundet med kemoresistens i GC. Ekspression af ATG-5 og MRP-1 kan være uafhængige prognostiske markører for GC behandling

Henvisning:. Ge J, Chen Z, Huang J, Chen J, Yuan W, Deng Z, et al. (2014) opregulering af Autophagy-Related Gene-5 (ATG-5) er forbundet med kemoresistens i Human Gastric Cancer. PLoS ONE 9 (10): e110293. doi: 10,1371 /journal.pone.0110293

Redaktør: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, USA

Modtaget: August 5, 2014 Accepteret: September 18, 2014; Udgivet: 17 oktober 2014

Copyright: © 2014 Ge et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of Hunan-provinsen, Kina (nr 2012FJ6088). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af et betydeligt fald i forekomsten sats i mange udviklede lande, mavekræft (GC) er fortsat den fjerde mest almindeligt diagnosticeret malignitet, og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. I løbet af de seneste årtier, standard multimodale behandlingsstrategier sammen med andre anbefalede indstillinger (f.eks D2 dissektion og adjuverende kemoterapi) har undladt at helbrede en stor andel af patienter, der lider med GC, især for dem med avancerede og metastaserende sygdomme, med dårligere overlevelsesrater bliver set sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af ​​kemoresistens under behandlingen [2]. Derfor er identifikation af nye molekylære begivenheder ligger til grund for udviklingen af ​​denne malignitet og dens dårlig prognose samt forståelse mekanismerne i GC kemoresistens presserende behov for mere effektiv klinisk intervention og bedre styring af patienterne.

Under fysiologiske betingelser autophagy er en lysosomer-afhængige, selvstændige fordøje systemet hovedansvarlig for fjernelse og genanvendelse af langlivede proteiner og beskadigede /forældede intracellularorganelles for at opretholde cellehomeostase [3]. Proteinerne og organeller bestemt til destruktion er afsondret indenfor “double-membran” vakuoler (autophagosomes), efterfulgt af fusion med lysosomer at bygge komplekser kendt som autophagosomes, hvor indholdet nedbrydes af lysosomale hydrolaser [4]. Det er blevet dokumenteret, at autofagi kunne induceres som respons på mange ugunstige forhold, herunder næringsberøvelse, oxidativ stress eller DNA skader og tjener som en adaptiv celle mekanisme, vinder tillader celler at overleve og formere sig, mens omfattende eller vedvarende Autophagy resulterer i celledød [ ,,,0],5]. Svækkelser i fysiologisk aktivering, montering og funktion af den autophagic pathway i stigende grad blevet observeret i en lang række forskellige humane cancere, selv om den nøjagtige rolle, som autofagi spiller i cancer tilblivelse og progression er stadig under kontroverser. Visse data går ind for tanken om, at autophagy undertrykker tumorigenese, mens andre beviser tyder på, at autophagy er i stand til at udløse tumor initiering og beskytter tumorceller fra undergår apoptose [6]. Interessant inhibering af autofagi nylig sig at forøge antitumor-aktivitet af adskillige cytotoksiske midler. Li og kolleger rapporterede, at autofagi blev aktiveret som en beskyttende mekanisme mod de cellulære virkninger af 5-FU-behandling og inhibering af autophagy af 3-methyladenin augmented 5-FU-induceret apoptose i colon cancerceller [7], [8]. På den anden side blev nogle anticancerlægemidler (fx cetuximab og dasatinib) demonstreret at inducere autophagic celledød gennem forskellige mekanismer i nogle cancerceller [9] – [13]. Den molekylære maskineri, som autofagi regulerer overlevelse eller død af neoplastiske celler stort set obskure hidtil. Den autophagy vej er en højt moduleret dynamisk proces overvejende udføres af autofagi-relaterede (ATG) familie af gener, der er reguleret af en række centrale kinaser, herunder mTOR, PI3K /Akt, AMPK og MAPK [14], [15]. ATG-5 er en central regulator nødvendig for autophagy i form af sit engagement i autophagosome forlængelse [16]. Tvungen udtryk for ATG-5 sensibiliserede tumorceller til anticancer narkotika behandling både

in vitro

in vivo

; i modsætning siRNA-medieret inhibering af ATG-5 førte til delvis resistens mod kemoterapi [17]

Postoperativ adjuvans kemoterapi er i øjeblikket et større behandlinger til GC.; men den samlede effekt kemoterapi forbliver fattige muligvis som følge af tilstedeværelsen af ​​multiresistens (MDR) fænotype. I modsætning til andre tumor enheder, ekspression af de klassiske MDR-medierende molekyler, såsom glutathion S-transferase og multiresistens gen 1 er ikke særlig udbredt i GC væv, hvilket indikerer, at der kunne eksistere en kompliceret mekanisme for udviklingen af ​​MDR i denne malign sygdom [ ,,,0],18]. Som en af ​​de klassiske lægemiddelresistente mekanismer, har multilægemiddelresistens-associerede protein 1 (MRP1 /ABCC1) vist sig at være stærkt udtrykt i GC og kan således udøve afgørende roller ved mediering MDR i GC [19], [20]. Men det vides ikke om MRP-1-ekspression er associeret med ATG-5-ekspression. Og også, om autofagi er involveret i kemoresistens i GC patienter er uklar.

I den foreliggende undersøgelse, vi først anvendt immunhistokemi til at undersøge ekspressionen profilen af ​​ATG-5 og MRP1 i en sum af 135 GC patienter, som fik ECF (epirubicin, cisplatin og 5-FU) adjuverende kemoterapi efter kirurgisk resektion. De korrelationer mellem ATG-5 og MRP-1-ekspression samt deres udtryk med forskellige klinisk-patologiske træk af GC og kliniske resultater blev også vurderet.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

i alt 135 GC patienter, der består af 91 mænd og 44 kvinder, der gennemgik kirurgi ved Institut for Gastrointestinal Surgery, Xiangya Hospital, Central South University (CSU), Kina, mellem 1. januar 2007 og 31 december 2008 blev inkluderet i denne undersøgelse. Gennemsnitsalderen for kohorten var 53,62 ± 9,73 år, med en rækkevidde på 26 til 72. Theprimary GC tumor tissuesand matchede ikke-kræft (NC) væv placeret mindst 5 cm fra tumoren kerne blev opnået efter kirurgisk resektion og straks behandlet og opbevares indtil videre anvendelse. Ingen af ​​de rekrutterede patienter havde kemoterapi eller strålebehandling før kirurgisk indgreb. Den histopatologiske diagnose blev udført præoperativt og bekræftet ved operation. Alle deltagere med stadium IB til IV tumorer modtaget ECF kemoterapi efter kirurgi (Dose: epirubicin 50 mg /m

2 på dag 1, cisplatin 60 mg /m

2 på dag 1 og kontinuert intravenøs infusion af 5-FU 500 mg /m

2 /d i 4 dage, gentaget hver 3. uge op til 24 uger). De kliniske karakteristika for disse patienter blev anført i tabel 1.

Alle sager i denne undersøgelse blev gennemgået, og alle prøver blev histopatologisk fornyet behandling i oktober 2012. Dybden af ​​muren invasion, regional lymfeknude metastase, og histologiske grad blev bekræftet af den samme gruppe af to erfarne ledende patologer. Patienterne blev kategoriseret baseret på differentiering status for kræftceller i tre histologiske kvaliteter: godt, moderat og fattige. Baseret på en kombination af lokalregional tumor involvering og tilstedeværelsen af ​​metastaser, blev alle tilfælde iscenesat ifølge TNM Classification af maligne tumorer (TNM) fase gruppering [21]. Til analysen af ​​overlevelse, blev datoen for drift bruges til at repræsentere startpunktet for opfølgningen besøg. Patienter, der døde af andre sygdomme snarere end GC eller andre uventede begivenheder blev udelukket fra sagen samling. Dødsårsagen rekrutteret i denne undersøgelse var forværring af GC. Den samlede overlevelse (OS) blev beregnet som en periode fra datoen for den første operation til datoen for død, eller datoen for den sidste opfølgning som slutpunktet. Sygdommen overlevelse (DFS) blev defineret som tidsperioden fra kirurgi indtil datoen for den lokale tilbagefald eller først fjernt orgel metastaser. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra hver patient før operationen, og denne undersøgelse blev godkendt af Research Ethics Committee of Central South University, Kina. Alle prøver blev håndteret og anonymiseres i henhold til de etiske og juridiske retningslinjer.

Immunhistokemi

De friske prøver blev fikseret i 10% neutral bufferet formalin og efterfølgende indlejret med paraffin. De paraffinindlejrede væv blev skåret ved 4 pm og derefter afparaffiniseret med xylen og rehydratiseret til videre H MRP1: ab32574; Abcam Inc., Cambridge, UK) mod respektive målproteiner ved en fortynding på 1:500 natten over ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev peroxidasemærket polymer og substrat-chromogen derefter anvendt for at visualisere immnohistochemical farvning. Endelig blev snit modfarvet med hematoxylin, cover-sled med monteringsmedium og undersøgt ved lysmikroskopi. Alle procedurer blev udført ved Patologisk Institut, Xiangya Hospital, C.S.U. Slides blev fortolkes uafhængigt af to erfarne patologer, som var blind for patienternes oplysninger. Vi kvantificerede farvningsintensitet og procentdelen af ​​farvede celler under anvendelse af en tidligere beskrevet fremgangsmåde [22], [23]: procentdelen af ​​positivt farvede celler (0% -100%) blev multipliceret med den dominerende intensitet mønster af farvning, overvejer 1 som negativ eller opspore, 2 som svag, 3 som moderat og 4 som stærk. Derfor er den samlede score varierede fra 0 til 400. Patienterne blev efterfølgende kategoriseret i fire forskellige undergrupper: score 0-99, score 100-199, score 200-299 og score 300-400

Western blot-analyse

hele ekstrakter celle blev fremstillet under anvendelse af 0,14 M NaCl, 0,2 M triethanolamin, 0,2% natriumdeoxycholat, 0,5% Nonidet P-40 og suppleret med en protease-inhibitor (alle produkter var fra Sigma, St. Louis, Missouri , USA). Derefter blev proteinprøve kørt gennem en 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) gel og overført til en membran. De overførte membraner blev efterfølgende inkuberet natten over ved 4 ° C med et primært antistof. Efter vask blev membranen inkuberet med et peberrodsperoxidase (HRP) -bundet sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur. De primære antistoffer var anti-ATG-5 (Santa Cruz, CA, USA), anti-LC3A /B (Abcam, Cambridge, UK) og anti-β-Actin (Santa Cruz, CA, USA). Alle rapporterede resultater er de gennemsnitlige forhold mellem tre forskellige uafhængige forsøg.

Celleproliferationsassay

Celler podedes på plader med 96 brønde (10000 celler /brønd) i 24 timer før behandling. MTT-assays blev anvendt til at vurdere celleproliferation ved forskellige tidspunkt efter behandlingen. MTT-assayet blev udført som følger: MTT blev tilsat til hver brønd, og pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 4 timer. Mediet blanding MTT blev derefter fjernet og 150 pi dimethylsulfoxid (DMSO) blev tilsat til hver brønd. Absorbansen blev målt ved 570 nm ved anvendelse af en flerlags spektrofotometer

RNA-interferens Salg

siRNA-duplexer målrettet ATG-5 blev syntetiseret som følger: siRNA-ATG5-486:. GACGUUG GUAACUGACAAATT; siRNA-ATG5-695: GUCCAUCUAAGGAUGCAAUTT og siRNA-ATG5-938: GACCUUUCAUUCAGAAGCUTT. siRNA-duplexer indeholdende ikke-specifikke sekvenser, blev anvendt som en negativ kontrol (NC): UUCUCCGAACGUGUCACGUTT. Forskellige siRNA’er blev transficeret separat i celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens, og mediet blev udskiftet 6 timer efter transfektion.

Real-time RT-PCR

totalt RNA fra cellelinier og væv var ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, USA), ifølge producentens instruktioner. Koncentrationen af ​​RNA blev målt ved anvendelse af et spektrofotometer. Et cDNA pulje blev syntetiseret under anvendelse af 1 ug af total RNA og TaqMan revers transkription Reagenser (Applied Biosystems, Foster City, USA) som beskrevet af producenten. Ekspressionen af ​​målgenet blev evalueret under anvendelse af en relativ kvantificering tilgang (2

-ΔΔCt metode) med β-actin som intern reference.

immunofluorescensbestemmelse

Celler blev permeabiliseret med 0,3 % Triton X-100 i 10 minutter efterfulgt af fiksering med 2-4% Methanal i 15 minutter, og blokeret med 3% fåreserum ved stuetemperatur i 60 minutter. Derefter, probet med primære antistoffer anti-LC3B (Santa Cruz, CA, USA) natten over ved stuetemperatur, og cellerne blev vasket tre gange med PBS. Farvet med Alexa Fluor 488 konjugeret 488 kanin-anti-gede-IgG i 1 time ved stuetemperatur, og derefter blev cellerne vasket tre gange med PBS. Kerner blev visualiseret ved farvning med DAPI (Sigma, USA) i 2 minutter. De farvede celler blev observeret med inverteret fluorescensmikroskop.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført med SPSS softwarepakken 15,0 til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kvantitative data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Pearsons χ

2 test blev anvendt til at sammenligne forskellen mellem klassificeret data, mens en-vejs-ANOVA test blev udført for at sammenligne forskellen mellem kvantitative data. Overlevelse analyser blev udført ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank test. Cox-regressionsmodellen blev udført for at vurdere den uafhængige hazard ratio af hver variabel i den multivariate analyse. Sammenhængen mellem ATG5 og MRP1 udtryk blev undersøgt ved hjælp af Bivariate Korrelation (Pearson) test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når

P

værdier var mindre end 0,05.

Resultater

Angivelse af ATG-5 og MRP-1 i GC

ekspressionsmønsteret og placering af ATG-5 og MRP-1 i vores GC patienter, som blev behandlet med epirubicin, cisplatin og 5-FU adjuvans kemoterapi (ECF) efter kirurgisk resektion, blev undersøgt under anvendelse af immunhistokemiske analyse. Blandt de 135 GC prøver, 105 (77,78%) var positive for ATG-5 immunreaktivitet, og 107 (79,26%) var MRP-1 positiv. Som afbildet i figur 1, fandt vi, at ATG5 overvejende blev udtrykt i cytoplasmaet. Desuden overekspression af ATG-5 var positivt korreleret med den for MRP-1 i GC. (R = 0,616,

P

0,001), som afsløret af den Bivariate Correlation test. Den positive udtryk i tilstødende ikke-kræft væv var 113 (83,70%) for ATG-5 og 89 (65,93%) for MRP-1. Dataene viste, at både ATG-5 og MRP-1 var positivt udtrykt i cancer og ikke-cancervæv, der antyder, at ATG-5 og MRP-1 kan induceres af kemoterapi i både tumor- og ikke-tumorvæv. Som alle vores patientprøver blev behandlet med ECF kemoterapi, og vi fandt, at både ATG-5 og MRP-1 var stærkt udtrykt og positivt korreleret i disse prøver. I mellemtiden tidligere undersøgelse viser, at MRP-1 måske forbundet med multiresistens i GC. Sammen med tidligere fund, vores resultater tyder på, at ATG-5 og MRP-1 kan være involveret i kemoresistens i GC patienter.

(A) ATG-5 farvning i ikke-kræft gastrisk væv scorede 285 (× 200) ; (B) ATG-5 farvning i GC tumorvæv scorede 50 (× 400); (C) ATG-5 farvning i GC tumorvæv scorede 270 (× 400); (D) ATG-5 farvning i GC tumorvæv scorede 400 (x 200).

Foreninger mellem ekspressionen af ​​ATG-5 eller MRP-1 og klinisk-patologiske karakteristika af GC

sammenslutninger af ATG-5 og MRP1 ekspression med forskellige klinisk-patologiske parametre for GC er vist i tabel 1 og tabel 2. Ekspression af ATG-5 var signifikant associeret med dybde væg invasion, fjernmetastaser og TNM stadier af GC (

P

0,001,

P

= 0,018,

P

0,001 henholdsvis). MRP-1-ekspression var signifikant forbundet med øget tumorstørrelse, dybde væg invasion, regionale lymfeknuder metastase, TNM stadier (

P

= 0,032,

P

0,001, P = 0,016, P 0,001 henholdsvis) og differentiering status (

P

= 0,005). For yderligere at bestemme involvering o f ATG-5 og MRP-1 i GC udvikling, vi udførte overlevelse analyse inden for vores patientprøver. Vores overlevelse analyser viste, at den totale overlevelse (OS) sats i vores GC kohorte var 43,70% med en gennemsnitlig overlevelse på 39.849 måneder (95% CI, 35.636-44.061 måneder); mens sygdomsfri overlevelse (DFS) sats var 34,07% med en gennemsnitlig overlevelse på 35.802 måneder (95% CI, 31.618-39.986 måneder). Vi næste klassificeret patienterne i fire forskellige undergrupper i henhold til de snesevis af immunhistokemi farvning. Kaplan-Meier overlevelse analyse viste en højere ATG-5-ekspression signifikant associeret med dårligere OS (

P

0,001) og DFS (

P

= 0,003). Parvise sammenligninger indikerede, at patienter, der bærer den højeste ATG-5-ekspression (scores 300-400) havde de fattigste overlevelsesrater sammenlignet med den for andre undergrupper (figur 2A og 2B). Konsekvent, blev opreguleret MRP-1-ekspression sig at være signifikant associeret med dårlig OS (

P

= 0,001) og DFS (

P

= 0,018) af vores GC patienter. Undergruppen med de højeste MRP1 udtryk scorer (0-99) syntes at have den værste prognose (figur 2C og 2D) i sammenligning med andre undergrupper. Vore data viste også, at der var en signifikant korrelation mellem TNM stadier og overlevelse GC patienter. Patienter med stadium III og IV tumorer viste dårligere prognose sammenlignet med dem husly fase IB og II-tumorer (

P 0,01

) (Figur 2E og 2F). Mere interessant, at Cox multivariate fare regressionsmodel viste, at ATG-5 og MRP-1-ekspression niveauer og TNM stadier var alle uafhængige og væsentlige prognostiske indikatorer til at forudsige OS (

P

= 0,037,

P

= 0,005,

P

0,001 henholdsvis) og DFS (

P

= 0,004,

P

= 0,008,

P

0,001 henholdsvis) af GC (tabel 3). Vores data indikerer ATG-5 og MRP-1 blev tæt forbundet med GC udvikling og kan tjene som dårlig prognose markører i GC behandling.

(A og B) Patienterne blev inddelt i følgende fire undergrupper baseret på ATG -5 immunfarvning: scorede 0-99 (kurve a), scorede 100-199 (kurve b), scorede 200-299 (kurve c) og scorede 300-400 (kurve d). Forskellen mellem forskellige undergrupper var statistisk signifikant som evalueret af de samlede Log-rank sammenligninger (OS:

P

0,001, DFS:

P

= 0,003). Parvis Log-rank sammenligninger viste, at undergruppen D udstillede de fattigste overlevelsesrater i forhold til andre undergrupper (OS:

P

0,05, DFS:

P

0,01). (C og D) Patienterne blev inddelt i følgende fire undergrupper baseret på MRP-1 immunfarvning: scorede 0-99 (kurve a), scorede 100-199 (kurve b), scorede 200-299 (kurve c), og scorede 300-400 (kurve d). Forskellen mellem forskellige undergrupper var statistisk signifikant ved de samlede Log-rank sammenligninger (OS:

P

= 0,001, DFS:

P

= 0,018). Parvis Log-rank sammenligninger viste, at undergruppen A havde den mest gunstige prognose blandt de fire undergrupper (OS:

P

0,05, DFS:

P

0,001). (E og F) Patienterne blev inddelt i fire undergrupper i henhold til forskellige TNM stadier. Forskellen mellem forskellige undergrupper var statistisk signifikant ved de samlede Log-rank sammenligninger (OS:

P

0,001, DFS:

P

0,001). Parvis Log-rank sammenligninger viste, at undergrupper III eller IV udstillet dårligere overlevelsesrater end undergrupper IB og II (OS:

P

0,01, DFS:

P

0,001). Vejviser

ATG-5 var signifikant opreguleret i kemoterapi celler

for yderligere at udforske den rolle, ATG-5 i tumorigenese og narkotika resistente. Vi har detekteret protein udtryk i flere gastrisk cancer cellelinier (AGS, BGC-832, SGC7901, SGC7901 /DPP og MKN45) og i en udødeliggjort human gastrisk epitel slimhinde cellelinje (GES). Interessant fandt vi, at ATG-5 dramatisk blev overudtrykt i DPP resistent cellelinje, SGC7901 /DPP-celler, sammenlignet med alle de andre cellelinier, som omfatter DPP følsomme SGC7901 celler (figur 3A). Vi bekræftede endvidere, at SGC7901 /DPP celler er resistente over for DPP behandling. IC 25, IC50 og IC75 var 15,4 pM, 38,7 pM og 93,53 uM i SGC7901 celler. I modsætning hertil IC 25, IC50 og IC75 var 120,03 uM, 271.9 uM og 423,7 pM i SGC7901 /DPP (figur 3B). Det er omkring 5 til 9 gange højere end i ikke-lægemiddelresistente celler. Vores finde kraftigt antyder, at ATG-5 bidrager til lægemiddelresistente af GC celler.

(A) Niveauet for ATG5 blev påvist i cellelinjer hjælp western blot analyse. β-actin blev anvendt som interne kontroller. (B) IC 25, IC50 og IC75 af SGC-7901 og SGC-7901 /DDP celler blev testet ved hjælp af MTT-assays efter DPP behandling.

Hæmning af ATG-5 sensibiliserede kemoterapi celler til lægemiddelbehandling

for yderligere at bevise, at ATG-5 bidrager til det stof resistente af GC celler, vi brugte små interfererende RNA (siRNA’er) til knockdown ekspression af ATG-5. Tre siRNA’er blev udformet. Vores real time PCR og Western blot Resultaterne viste, at alle tre siRNAs inhiberede ekspressionen af ​​ATG-5 ved både mRNA og protein niveau (figur 4A og 4B). Vi valgte en, siRNA-ATG5-695, med højeste knockdown effektivitet til at udføre følgende eksperiment. Vi knockdown ATG-5-ekspression og derefter behandlet af cellerne med DPP. Celleproliferation evne blev undersøgt ved 0, 48 og 72 timer efter behandling. Vores Resultatet viste, at knockdowning ATG-5 påvirkede ikke celledeling i SGC7901 /DPP celler sammenlignet med kontrol siRNA (siRNA NC). DPP behandling alene lidt inhiberede proliferationen af ​​cellerne. Interessant, når vi knockdown ekspressionen af ​​ATG-5 og behandles cellerne med DPP samtidig, celleproliferationen evne blev yderligere undertrykt sammenlignet med celler behandlet med DPP alene 48 og 72 timer efter behandling (figur 4 C). Vore data understøtter endvidere, at ATG-5 bidrager til det drug-resistente of GC-celler.

(A) mRNA-niveauet af ATG-5 blev påvist ved real time PCR efter behandling med siRNA’er. GAPDH blev brugt som interne kontroller. (B) Proteinet niveau af ATG-5 blev påvist ved Western blot efter behandling med siRNA’er. β-actin blev anvendt som interne kontroller. (C) Spredningen evne blev testet ved hjælp MTT assay 48 timer eller 72 timer efter forskellig behandling.

Autophagy var involveret i narkotika resistente DC celler

Som ATG-5 er en central regulator af autofagi, vi spekuleret på, at autophagy kan være involveret i lægemiddelresistent af GC-celler. Så vi brugt 3mA, som er en autophagy inhibitor, til behandling af resistente celler drug. Som forventet, fandt vi, at 3mA sammen med DPP behandling havde en lignende effekt med ATG-5 kncokdown sammen med DPP behandling (figur 4C og 4D). Dataene viser, at autofagi bidrager til det drug-resistente. Derefter undersøgte vi, om autofagi blev ændret under behandlingen. Vi bruges Immunofluorescens assay til påvisning LC3B ekspressionsniveau, som er en autophagy markør i cellerne. Vores data viser, at autofagi blev undertrykt efter silencing ATG-5 eller behandling af cellerne med 3 mA (figur 5A). Og western blot resultat yderligere bekræftet, at LC3A /B proteinekspression blev kun påvirket i celler behandlet med siRNA-ATG5 eller 3mA. Følgelig celleproliferation blev yderligere inhiberet kun når autofagi inhiberet (figur 4 og figur 5). Derfor afslørede vores data, at ATG-5 var involveret i narkotika resistente DC celler, som var hovedsagelig gennem påvirke autophagy af kræftcellerne.

(A) autofagi blev påvist ved immunfluorescens assay af LC3B i cellerne 48 timer efter forskellig behandling. (B) De proteinniveauer af LC3A og LC3B blev testet ved Western blot. β-actin blev anvendt som interne kontroller.

Diskussion

GC stadig en af ​​de hyppigste maligne tumorer på globalt plan på trods af dens faldende incidens og det samlede antal er forudsagt til løbende kravle som følge af befolkningstilvæksten. Hos mænd, GC rangerer den anden i dødeligheden; hos kvinder, er det den fjerde i dødeligheden [24], [25]. Den rå dødelighed af GC i Kina var 25,2 pr 100 000 [26]. I vores undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​ATG-5 og MRP-1 i en kohorte af GC patient efter kemoterapi. Derefter, vi demonstreret, at ATG-5 blev opreguleret i cisplatin (DDP) resistent cellelinje. Endvidere efter ATG-5-ekspression eller aotophogy blev inhiberet, kræftcellerne blev sensibiliseret til DPP behandling. Vores resultater giver ny indsigt i den mekanisme af kemoterapi i GC progression.

Vi evaluerede exression profil ATG-5 og MRP-1 i 135 kinesiske GC patienter. I en aftale med tidligere rapport [22], viste vores resultater, at en høj procentdel af GC væv udtrykte ATG-5, og ATG-5-ekspression blev statistisk forbundet med dybden af ​​væggen invasion, fjernmetastaser og TNM stadier af GC. Disse resultater støtter en forestilling om, at højt ekspressionsniveau af ATG5 kan bidrage til, en vis grad, en mere aggressiv og ondartet fænotype i GC. Dette synspunkt understøttes yderligere af vores fund af sammenhængen mellem højere ATG5 udtryk i GC og dårligere prognose af patienterne (se mere diskussion nedenfor). Hvad vigtigere er, vi identificeret en positiv korrelation mellem ATG-5 og MRP1 ekspression i vores GC kohorte. I betragtning af at MRP1 er et ABC transmembrantransport protein velkendt at fremme MDR-fænotypen i GC, er det rimeligt at foreslå, at ATG-5 kan også impliceret i giver GC kemoresistens gennem visse ukendte molekylære mekanismer.

Det er almindeligt accepteret, at tilbagefald og metastaser er to store forhindringer i vores bestræbelser på at forbedre lav OS og DFS overlevelsesraten for GC. Kemoresistens fortsat et af de vigtigste årsager, der fører til tumorrepopulation /tilbagefald efter behandling. Passende mulighed for individuel behandling vil være utvivlsomt gavnligt at forbedre det kliniske resultat; ikke desto mindre, nuværende beslutning behandling er for det meste afhængig af TNM stadier [27], [28]. Vores overlevelse analyser i de 135 GC patienter med stadium IB til IV tumorer afslørede, at både ATG-5 og MRP-1-ekspression var i stand til selvstændigt at forudsige OS og DFS efter behandling med adjuvans ECF kemoterapi, hvilket antyder, at overvågning af deres ekspressionsniveauer i kombination af konventionelle prognostiske markører kan give os yderligere værdifulde oplysninger for en bedre evaluering af kemoterapi effekt i GC patienter. Interessant, fandt vi ATG-5 blev overudtrykt i narkotika resistent GC cellelinjer. Og silencing ATG-5 kan sensibiliserede de resistente celler stof til kemoterapi igen. Vore data antyder, at ATG-5 kan være et mål for kemoterapi paitents.

akkumulerende beviser har antydet, at autofagi er i stand til at udløse både celleoverlevelse og celledød under forskellige sammenhænge. Liu et al rapporterede, at ved at hæmme PI3K /Akt /mTOR pathway, kan β-elemen fremkalde beskyttende autofagi at hjælpe GC celler bedre at tilpasse sig stressende forhold og beskytte dem mod at undergå apoptose død [29]. Endvidere har nylige undersøgelser vist, at PI3K /Akt /mTOR-signalvejen ofte aktiveres i humane gastrointestinale maligniteter [30]. Den PI3K /Akt signalering modulerer også MDR i GC celle gennem regulering af p-glycoprotein, Bcl2 og Bax [31]. Ligeledes har nogle midler mod cancer blevet rapporteret at hæmme mTOR signalering og inducere autofagi i cancerceller ved at nedbryde mange store komponenter i mTOR-aksen [14], [32]. Samlet set antyder disse data at autofagi kunne induceres under kemoterapi, og undertrykkelse af autophagic pathways under anvendelse autofagi inhibitor har potentiale til at forbedre det kemoterapeutiske effektivitet i GC patienter med ATG-5 høj ekspression. Til støtte, fandt vi, at når autophagy blev hæmmet, blev lægemiddelresistente celler også sensibiliseret til narkotikabehandling igen som lyddæmpende ATG-5 udtryk. Så vores resultat støtte, autofagi bidrager til kemoterapi i patienten.

Sammenfattende overekspression af ATG-5, en vigtig molekylær spiller i autophagic vej, er forbundet med kemoresistens i GC. Ekspression af ATG-5 og MRP-1 kan betragtes som uafhængige prognostiske markører til forudsigelse OS og DFS af GC patienter baseret på de aktuelt opnåede data. På grundlag af TNM trin, kan detektion af deres ekspressionsniveauer være klinisk relevant for en bedre forudsigelse af kemoterapeutiske behandlingsresultater hos patienter, der lider af denne malign sygdom. Fremtidige undersøgelser med vurdering af et større antal sager, ideelt fra en anden etnisk baggrund, er absolut berettiget til at bekræfte vores resultater i denne undersøgelse.