PLoS ONE: Analyse af foreningen mellem CIMP og BRAFV600E i kolorektal cancer ved DNA-methylering profilering

Abstrakt

En CpG ø methylator fænotype (CIMP) vises ved en særskilt undergruppe af tarmkræft med en høj frekvens af DNA hypermethylering i en bestemt gruppe af CpG øer. Nylige undersøgelser har vist, at en aktiverende mutation af

BRAF

(BRAF

V600E) stramt er forbundet med CIMP, hvilket rejser spørgsmålet om, hvorvidt BRAF

V600E spiller en kausal rolle i udviklingen af ​​CIMP eller om CIMP giver et gunstigt miljø for købet af BRAF

V600E. Vi ansat Illumina GoldenGate DNA methylering teknologi, som afhører 1.505 CpG websteder i 807 forskellige gener, for yderligere at studere denne forening. Vi først undersøgt, om udtryk for BRAF

V600E forårsager DNA hypermethylering ved stabilt udtrykke BRAF

V600E i CIMP-negative,

BRAF

vildtype COLO 320DM kolorektal cancer cellelinje. Vi bestemt 100 CIMP-associerede CpG sites og undersøgte ændringer i DNA-methylering i otte stabilt transficerede kloner over flere passager. Vi fandt, at BRAF

V600E ikke er tilstrækkelig til at fremkalde CIMP i vores system. For det andet, i betragtning af den alternative mulighed, vi identificeret gener, hvis DNA hypermethylering var tæt forbundet med BRAF

V600E og CIMP i 235 primære kolorektale tumorer. Interessant, gener, der viste den mest betydningsfulde link omfatter dem, der medierer forskellige signalveje impliceret i kolorektal tumorigenese, såsom

BMP3

BMP6

(BMP signalering),

EPHA3

,

KIT

, og

FLT1

(receptortyrosinkinaser) og

SMO

(Hedgehog signalering). Endvidere har vi identificeret CIMP-afhængige DNA hypermethylering af

IGFBP7

, som er blevet vist at mediere BRAF

V600E-induceret cellulær senescens og apoptose. Promotor-DNA hypermethylering af

IGFBP7

var forbundet med inaktivering af genet. CIMP-specifik inaktivering af BRAF

V600E-induceret aldring og apoptoseveje ved

IGFBP7

DNA hypermethylering kan skabe en gunstigere vilkår for erhvervelse af BRAF

V600E i CIMP + kolorektal cancer. Vores data vil være nyttige for fremtidige undersøgelser mod forstå CIMP i kolorektal cancer og få indsigt i rollen som afvigende DNA hypermethylering i kolorektal tumorigenese

Henvisning:. Hinoue T, Weisenberger DJ, Pan F, Campan M, Kim M , Young J, et al. (2009) Analyse af foreningen mellem CIMP og BRAF

V600E i kolorektal cancer ved DNA-methylering profilering. PLoS ONE 4 (12): e8357. doi: 10,1371 /journal.pone.0008357

Redaktør: Chun Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: September 6, 2009; Accepteret: 20. november 2009; Udgivet: December 21, 2009

Copyright: © 2009 Hinoue et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Institutes tilskud of Health (NIH) R01 CA118699-02 (PW Laird), R01 CA075090-09 (PW Laird). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Peter Laird er en konsulent for Epigenomics AG og Celgene Corporation. De andre forfattere oplyses nogen potentiel konkurrerende interesse. Dette arbejde blev ikke støttet af enten Epigenomics AG eller Celgene Corporation. Disse virksomheder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet.

Introduktion

Aberrant DNA methylering på CpG øer er blevet bredt observeret i kræft. Promotor CpG island hypermethylering forbundet med inaktivering af udvalgte tumorsuppressorgener synes at være kritisk i tumorer fra starten gennem til vedligeholdelse af tumoren fænotype [1]. Distinct undergrupper af flere typer af humane cancere er blevet foreslået at have et CpG island methylator fænotype (CIMP), hvori en usædvanlig høj frekvens af cancer-specifik DNA hypermethylering er fundet [2], [3]. Selv om dette koncept har været kontroversiel [4], har vi bekræftet eksistensen af ​​CIMP i kolorektal cancer i en storstilet omfattende undersøgelse [5].

CIMP i kolorektal cancer kan opstå gennem en særskilt sti oprindelse i visse undertyper af savtakkede polypper [6] og er observeret i ca. 15% af alle kolorektale kræfttilfælde [5], [7]. Features forbundet med CIMP i kolorektal cancer omfatter køn (kvinde), proksimal placering, og dårligt differentieret eller mucinøs histologi [3], [5], [7], [8]. Vores undersøgelse ved hjælp af en nyudviklet CIMP markør panel i tarmkræft viste, at sporadisk mikrosatellit instabilitet (MSI +) opstår som følge af CIMP-associerede

MLH1

DNA hypermethylering [5]. Desuden fandt vi en stærk sammenslutning af CIMP med tilstedeværelsen af ​​en aktiveret mutant form af

BRAF

(BRAF

V600E) [5]. Både CIMP og

Der er rapporteret BRAF

mutationer i de tidligste stadier af kolorektal neoplasi: CIMP i tilsyneladende normal slimhinde af patienter disponeret for flere savtakkede polypper [9] og

BRAF

mutationer i afvigende krypt foci [10].

RAS-RAF-MEK-ERK signalvejen ofte hyperaktiveret i kolorektal cancer.

KRAS

mutationer forekommer hyppigst i 30-40% af alle tarmkræft [11] og

BRAF

mutationer er til stede ved en frekvens på 5-22%, hvor konstitutivt aktiveret BRAF

V600E variant udgør -90% af alle de

BRAF

mutationer [12]. Mutationer i

KRAS

BRAF

generelt udelukker hinanden, hvilket indebærer tilsvarende downstream effekter i tumorigenese [13]. Imidlertid har nyere undersøgelser vist, at mutationer af disse gener kan spille forskellige roller i tumor initiering og /eller vedligeholdelse [10], [14].

Den ekstremt tætte sammenhæng mellem BRAF

V600E og CIMP hæver spørgsmålet om, hvorvidt BRAF

V600E spiller en kausal rolle i udviklingen af ​​CIMP eller om CIMP-associeret promotor hypermethylering giver en gunstig ramme for køb af BRAF

V600E. I denne undersøgelse, vi søgte efter mulige molekylære forklaringer på sammenhængen mellem BRAF

V600E og CIMP hjælp af Illumina GoldenGate DNA methylering platform, som undersøger status DNA methylering af 1.505 CpG sites placeret på 807 gener. Den GoldenGate DNA methylering assay har været meget anvendt i forskellige undersøgelser og er nu en standard metode til DNA-methylering analyse [15] – [24]. Resultaterne opnået fra kommercielt tilgængelige “GoldenGate Methylering Cancer Panel I”, i særdeleshed, er blevet valideret ved hjælp af forskellige andre teknikker [15] – [17], [22], [23], hvilket gør det en pålidelig kilde for DNA methylering målinger på tværs 1.505 loci. Vi var ikke i stand til at demonstrere en kausal bidrag BRAF

V600E til CIMP i vores cellekultur-system. Men vi identificeret gener, hvis DNA hypermethylering var signifikant forbundet med BRAF

V600E i primære kolorektale tumorer. Inaktivering af disse specifikke gener i forbindelse med CIMP kunne drive købet af BRAF

V600E i CIMP + kolorektale tumorer.

Resultater

Karakterisering af 21 Menneskelig Colorectal Cancer Cell Lines

Vi først forsøgt at bestemme, om ekspressionen af ​​BRAF

V600E ville fremkalde DNA hypermethylering på CpG sites forbundet med CIMP i en

in vitro

cellekultur system. Da primære colon epitelceller ikke var let tilgængelige, vi screenet for tarmkræft cellelinier, der ikke har væsentlig DNA methylering på CIMP-definerer loci og bærer vildtype-former af både

BRAF

KRAS

. Sådanne cellelinjer ville tjene som egnede systemer til indførelse af BRAF

V600E. Vi valgte 21 kolorektale cancer cellelinjer, kendetegnet deres DNA methylering profiler, og bestemt deres

BRAF

KRAS

mutation status (figur 1). Vi brugte MethyLight at vurdere status DNA methylering af fem CIMP-definerer markører tidligere identificerede i vores laboratorium [5]. Ved hjælp af en PMR (procent af methyleret reference) af ≥10 som en tærskel for positiv methylering, vi identificeret seks cellelinier, der manglede DNA-methylering for alle fem CIMP-specifikke markører (figur 1). For at teste vores hypotese, vi oprindeligt valgte

BRAF

og

KRAS

vildtype Caco-2 og COLO 320DM cellelinjer for deres lethed i dyrkning og transfektion. Imidlertid er undersøgelsen beskrevet nedenfor begrænset til COLO 320DM celler, da vi ikke var i stand til at isolere eventuelle stabilt transficerede Caco-2-kloner, der udviste påviseligt niveau af BRAF

V600E ekspression (data ikke vist).

MethyLight blev anvendt til at vurdere status for methylering af DNA på fem CIMP-definerer markører. En PMR af ≥10 blev anvendt som en tærskel for positiv methylering. Sorte bokse angiver PMR ≥10, og hvide felter angiver PMR 10. De DNA methylering frekvenser af de fem CIMP markører stige fra top til bund. Mikrosatelitter ustabilitet status for hver cellelinje er opført som mikrosatellit stabil (MSS) eller husly ustabilitet (MSI). Mutationen status

BRAF

exon 15 og

KRAS

exon 2 er angivet.

stabil transfektion af BRAF

V600E i COLO 320DM Celler

Vi transficerede COLO 320DM celler med en HA-mærket BRAF

V600E cDNA og isolerede G418-resistente kloner. Ekspressionsniveauet af BRAF

V600E blev bestemt ved western blotting under anvendelse af et antistof mod HA-epitopen (figur 2A). Aktiviteten af ​​BRAF

V600E blev bekræftet ved at undersøge aktiveringen af ​​ERK1 /2 under anvendelse af et antistof mod phosphoryleret ERK1 /2 (figur 2A). Otte stabilt transficerede kloner, der udviser høj ekspression af BRAF

V600E, samt stærke aktivering af ERK1 /2, blev individuelt dyrket i kultur, og genomisk DNA blev isoleret ved forskellige passager (mellem 2 og 27) fra disse kloner. Fire tomme vektor transfekterede kloner (EVCs) blev dyrket i de samme betingelser og bruges som kontroller.

(A) Ekspression af BRAF

V600E og ERK1 /2 fosforylering i stabilt transfekterede COLO 320DM celler. Blots blev sonderet med anti-HA antistoffer til HA-BRAF

V600E, anti-phospho-ERK1 /2, og anti-ERK1. Stjerner angiver de otte BRAF

V600E transficerede kloner, der blev udsat for DNA methylering analyse på forskellige celle passager. (B) DNA methylering profiler af utransficerede COLO 320DM celler, tom vektor og BRAF

V600E transficeret COLO 320DM kloner, som bestemt ved Illumina GoldenGate methylering af DNA-assay. methylering data DNA blev scoret som p-værdier som tidligere defineret [16]. Hver række svarer til en individuel CpG locus og dataene blev ordnet efter gennemsnitlig β-værdi på tværs af alle prøver. Hver klon bestilt fra venstre mod højre i stigende antal passager. EVC: tom-vektor transficerede kloner

DNA-methylering Analyse af BRAF

V600E Transficerede COLO 320DM Kloner

Vi næste bestemt status DNA methylering af 1.505 CpG sites placeret på. 807 forskellige gener i hver af de otte BRAF

V600E kloner og fire EVCs hjælp af Illumina GoldenGate Methylering Cancer Panel 1 platform (figur 2B). Vi fandt, at DNA-methylering Ø-værdier på tværs af alle 1505 CpG steder i BRAF

V600E transfekterede kloner (uanset deres BRAF

V600E udtryk niveau) var meget lig dem af tomme vektor kontrol-kloner og relativt stabile i tid. Dette antyder, at der ikke var nogen samlet stigning i DNA hypermethylering i BRAF

V600E transfekterede kloner i CpG mål analyseret (figur 2B).

Vi afgøres næste hvorvidt stabil ekspression af BRAF

V600E specifikt øget DNA methylering af kun CIMP-associerede markører i de 1.505 afhørt CpG sites. Disse steder blev bestemt ved screening 58 primære colorektale tumorprøver ved hjælp af Illumina GoldenGate DNA methylering platform (Datasæt S1). Mutationen status

BRAF

KRAS

i disse prøver var blevet bestemt tidligere [5] (tabel S1). Unsupervised todimensional klyngeanalyse af DNA methylering p-værdier viste en distinkt klynge af 11 tumorprøver, hvoraf størstedelen indeholdt BRAF

V600E og viste hyppigt DNA-methylering af kendte CIMP-associerede markører, herunder

CDKN2A, IGF2

, og

MLH1

(data ikke vist). Vi definerede denne undergruppe som CIMP-positive tumorer (figur 3). Vi identificerede derefter i alt 100 CpG websteder, der har betydeligt højere niveauer af DNA methylering i CIMP-positive (CIMP +) versus CIMP-negativ (CIMP-) tumorer (

P

0,001 efter korrektion for multiple sammenligninger, se afsnittet materialer og fremgangsmåder) (tabel S2). Det skal bemærkes, at reaktioner for tre af de MethyLight-baserede CIMP markører (

CACNA1G

,

NEUROG1

, og

SOCS1

) tidligere identificeret i vores laboratorium er ikke inkluderet i den Illumina GoldenGate Methylering Cancer Panel 1 platform.

RUNX3

Illumina GoldenGate reaktioner viste ikke CIMP-specifik adfærd. En mulig forklaring på denne uoverensstemmelse kunne være, at disse reaktioner er designet omkring transkriptionsstartsitet af

RUNX3

isoform 1, hvorimod vores CIMP-specifikke

RUNX3

MethyLight reaktion er designet på promotor CpG øen af

RUNX3

isoform 2 [5]. Vi så ingen synlig forskel i DNA-methylering mellem BRAF

V600E transfekterede kloner og EVCs på disse CIMP-associerede CpG sites (figur 3). Interessant observerede vi, at den gennemsnitlige DNA-methylering β-værdi 100 CIMP-specifikke loci steg som en funktion af cellens passage (figur 4A og 4B). Men denne stigning ikke korrelerer med niveauerne af BRAF

V600E ekspression og blev også observeret i celler transficeret med kontrolvektoren (figur 4B). Denne generelle stigning i den gennemsnitlige β-værdi er specifik for CIMP-associeret loci, idet middelværdien β-værdi fra flere sæt af 100 tilfældigt udvalgte CpG sites ikke viste en lignende tendens (figur 4C og 4D). Vi konkluderede derfor, at selv CIMP-associeret CpG øer kan være tilbøjelige til at erhverve DNA methylering i visse dyrkningsbetingelser, BRAF

V600E ikke specifikt inducerer CIMP i COLO 320DM celler.

CIMP + tumorer og CIMP associeret loci i 58 primære tumorprøver blev defineret som beskrevet i afsnittet Materialer og fremgangsmåder. Hver række svarer til en individuel locus af 100 locus panelet, og dataene blev sorteret med den gennemsnitlige β-værdi for hver locus i alle 58 primære tumor prøver. Hver BRAF

V600E transficeret klon og EVC er bestilt fra venstre mod højre i stigende antal passager. Tumorer med

BRAF

KRAS

mutationer er angivet med en cirkel og en trekant, henholdsvis. X: mutation status ikke er tilgængelig. Hver BRAF

V600E transficeret klon og EVC er bestilt fra venstre mod højre i stigende antal passager. “P” angiver DNA methylering profiler af moderselskaber utransficerede COLO 320DM celler.

Sorte linjer angiver BRAF

V600E udtrykke kloner og grå linier repræsenterer tomme vektor transficeret kontrol kloner. Hver graftegning punkt repræsenterer betyde Ø-værdier på tværs angivet CpG sites fra Illumina GoldenGate DNA methylering assay på forskellige passager for hver klon. (A) Alle 1505 CpG loci fra Illumina GoldenGate analysen. (B) Kun 100 CIMP-associeret loci er profileret. (C) Et hundrede tilfældigt valgt CpG loci. (D) Et hundrede ikke-CIMP loci, som viser betyde p-værdier svarende til 100 CIMP-associerede loci.

Identifikation af gener, som er betydeligt denatureret i kolorektal tumorer huser BRAF

V600E

Vi overvejede også den alternative hypotese, at promotor methylering af specifikke gen-mål giver en gunstig ramme for køb af

BRAF

mutation i CIMP + tarmkræft. Vi har tidligere identificeret CIMP status og

BRAF

mutation status på 235 primære colorektale tumorprøver [5]. Vi fandt BRAF

V600E i 33 tumorer (14,0%); 31 af disse blev klassificeret som CIMP + og kun 2 som CIMP-. Vi udførte Illumina GoldenGate DNA methylering assay på disse prøver, og identificeret 60 gener, repræsenteret med 89 CpG sites, som er betydeligt methylerede (

P

0,001) i de 33 BRAF

V600E-positive tumorer (tabel S3). Disse gener er kandidater til CIMP-specifik inaktivering, hvilket kan tæt synergi med BRAF

V600E at fremme tumorigenese.

For at validere data genereret ved hjælp af GoldenGate DNA methylering platform, vi analyserede status DNA methylering af fire CIMP-specifikke gener (

Calca

,

EPHA3

,

KIT

, og

SLC5A8

) på en delmængde af fire CIMP-positive og 16 CIMP -negative tumorer på Illumina Infinium DNA-methylering platform. Disse fire gener blev udvalgt, fordi både analytiske platforme afhøre status DNA methylering af identiske CpG-dinukleotid. Vi undersøgte derefter overensstemmelsen af ​​DNA methylering på hvert af disse loci mellem de to platforme, og fundet en høj korrelation koefficient i alle tilfælde (

Calca

: 0,94,

EPHA3

: 0,95,

KIT

: 0,95,

SLC5A8

:. 0.86), udlån yderligere støtte til vores indledende DNA methylering skærm GoldenGate-baserede

Vi bekræftede de nyligt observerede sammenhænge mellem DNA hypermethylering af

BMP3

MCC

med CIMP + og BRAF

V600E i kolorektal cancer [25], [26]. Vi fandt også CIMP-specifik DNA hypermethylering af

BMP6.

Samtidige epigenetisk inaktivering af

BMP3

BMP6

viste sig at være forbundet med aktiveringen af ​​RAS-RAF -MEK-ERK signalvejen i ikke-småcellet lungecancer [27]. Desuden fandt vi en sammenslutning af

SLC5A8

TIMP3

DNA methylering med BRAF

V600E i vores kolorektale tumor prøver, som tidligere var blevet rapporteret i papillære skjoldbruskkirtlen karcinomer [28]. Den funktionelle konsekvens af DNA hypermethylering af sådanne tumorsuppressorgener forbundet med CIMP + og BRAF

V600E forbliver spekulative [25] – [28].

Desuden fandt vi, at DNA-methylering af

SMO

, en komponent af Hedgehog (Hh) signalering, blev tæt forbundet med kolorektale tumorer med BRAF

V600E (tabel S3). Interessant nok er det blevet nylig rapporteret, at øget ekspression af

SMO

bidrager til kolorektal tumorigenese [29]. Men Arimura et al. viste også, at kolorektale cancercellelinjer huser BRAF

V600E, herunder COLO 205, HT-29 og RKO, syntes ikke at vise ekspression af

SMO

[29]. Vores data viser, at CIMP-specifik promoter DNA hypermethylering kan være involveret i undertrykkelsen af ​​

SMO

i kolorektale tumorer bærer BRAF

V600E (tabel S3).

Promotor DNA Hypermethylering og Transcriptional Silencing af

IGFBP7

i

BRAF

Mutant CIMP + kolorektal Cancer

Vi identificerede den

IGFBP7

promoter CpG øen som et mål for DNA methylering i kolorektale tumorer huser BRAF

V600E (

P Drømmeholdet værdi = 3,1 × 10

-9, odds ratio = 12). BRAF

V600E er blevet vist at inducere cellulær aldring [30] – [32]. Oncogene-induceret aldring (OIS) er blevet anerkendt som en vigtig tumor suppressor mekanisme [33]. Den underliggende molekylære mekanisme af BRAF

V600E-induceret aldring og apoptose er blevet belyst i en nylig undersøgelse [34]. Det er blevet påvist, at ekspressionen af ​​

IGFBP7

er både nødvendig og tilstrækkelig til at fremkalde ældning og apoptose medieret af BRAF

V600E. Interessant,

IGFBP7

viste sig at være epigenetisk bragt til tavshed af CpG ø promotor hypermethylering specifikt i primære melanom prøver bærer BRAF

V600E, hvilket indikerer, at tabet af

IGFBP7

udtryk er kritisk for udviklingen af BRAF

V600E-positive melanom [34].

Illumina GoldenGate methylering Cancer Panel 1 platform indeholder to

IGFBP7

prober (IGFBP7_P297_F og IGFBP7_P371_F), der afhøre status DNA methylering af to forskellige CpG-dinukleotider i

IGFBP7

promoter CpG ø (figur 5A). Vi fandt, at disse to CpG steder i

IGFBP7

promotor er kræft-specifikt methylerede (figur 5B) og stærkt forbundet med både BRAF

V600E (Wilcoxon rank-sum test,

P

værdi = 2,0 × 10

-10) og CIMP (

P Drømmeholdet værdi = 3,6 × 10

-9) (figur 5C). Det er blevet rapporteret, at kolorektale tumorer med

KRAS

mutationer viser også DNA hypermethylering ved CIMP-associerede markører, om end på en lav frekvens, og har høje niveauer af DNA-methylering af gener, som undergår alder-associeret DNA hypermethylering. Disse tumorer er blevet beskrevet som CIMP-lav eller CIMP2 [35], [36]. Vi kunne ikke finde en sammenhæng mellem

IGFBP7

DNA hypermethylering og

KRAS

mutationer, når vi udelukkede tumorer med mutant

BRAF

(

P Drømmeholdet værdi = 0,85) . Efter aftale med disse observationer, fandt vi, at DNA hypermethylering af

IGFBP7

er for det meste til stede i kolorektale cancer cellelinjer, som huser BRAF

V600E og vise hyppig DNA methylering af fem-gen CIMP-specifik markør panel tidligere beskrevet (figur 6). Real-time RT-PCR-analyse af kolorektale cancer cellelinjer viste, at

IGFBP7

mRNA-ekspression omvendt relateret til DNA hypermethylering, som cellelinier med

IGFBP7

hypermethylering viste lidt eller ingen

IGFBP7

genekspression (figur 6). Blandt de CIMP- celler, vi undersøgte, viste kun COLO 320DM DNA hypermethylering af

IGFBP7

CpG ø promotor med minimalt niveau af udtryk. Set i bakspejlet kan dette unikke egenskab af COLO 320DM celler sammenlignet med de andre CIMP- cellelinier har aktiveret disse celler til at tolerere mutant

BRAF

overekspression, og kan forklare vore problemer med at få BRAF

V600E udtrykke kloner i andre kolorektal cancer cellelinie, såsom Caco-2.

(A) Genomisk kort over

IGFBP7

promotor-associeret CpG ø, transkriptionsstartstedet (TSS) og exon 1 baseret på UCSC genom browser (marts 2006 samling). Placeringen af ​​bindingssteder for CpG forhørt af Illumina GoldenGate methylering af DNA-assayet er angivet med lodrette pile. (B) DNA methylering niveauer af de to CpG dinucelotides i

IGFBP7

promoter CpG øen. Ø-værdier for hver CpG websted i 10 tumorer (fem CIMP- tumorer med vildtype

BRAF

og fem CIMP + tumorer med mutant

BRAF

, sorte søjler) og tilstødende ikke-tumorvæv ( grå søjler) er angivet. (C)

IGFBP7

promotor DNA methylering box parceller på 235 humane kolorektale tumorer stratificeret af

BRAF

mutation status (venstre) og CIMP + status (til højre) på

IGFBP7

P371 locus. I boksen plots, enderne af kassen er de 25. og 75. kvartiler. Linjen inden i kassen identificerer median β-værdi. De whiskers over og under boksen udvides til højst 1,5 gange IQR. Den CIMP status for hver kolorektal tumor prøve bestemmes som beskrevet i Materialer og metoder sektion.

Kvantitativ real-time RT-PCR-analyse af

IGFBP7

udtryk.

IGFBP7

ekspressionsniveauerne præsenteres i forhold til

PCNA

udtryk. Fejlsøjlerne angiver standardafvigelsen for tekniske tredobbelte målinger. Antallet af methylerede loci blandt de fem CIMP markører og mutation status

BRAF

KRAS

anført i figur 1 er forudsat.

Diskussion

CIMP i kolorektal cancer giver en unik mulighed for at studere molekylære mekanismer, der fører til epigenetiske ændringer i kræft og de bidrag af disse ændringer i udviklingen af ​​sygdommen [3], [37]. De forskellige funktioner, der findes i CIMP er vigtige spor i at forstå denne fænotype [3], [5], [7], [8]. Særligt slående er det yderst stramme sammenhæng mellem CIMP og BRAF

V600E [5]. Mekanismer forbinder epigenetiske (CIMP) og genetiske (

mutation BRAF

) begivenheder og den tidsmæssige rækkefølge, som disse to begivenheder finder sted har tiltrukket interesse [37].

I denne undersøgelse ved at bruge high-throughput Illumina GoldenGate DNA methylering platform, undersøgte vi sammenhængen mellem CIMP og BRAF

V600E i kolorektal cancer. Vi først testet, om udtryk for BRAF

V600E forårsager DNA hypermethylering ved stabilt udtrykke BRAF

V600E i CIMP-negative,

BRAF

vildtype COLO 320DM kolorektal cancer cellelinje. Vi har undersøgt DNA-methylering ændringer i 100 CIMP-associerede bindingssteder for CpG, og fandt, at BRAF

V600E ikke er tilstrækkelig til at inducere DNA hypermethylering på disse steder. En advarsel i vores system er, at BRAF

V600E kunne spille en rolle i at fremkalde DNA methylering kun tidligt i tyk- tumorigenese, som

BRAF

mutationer er blevet beskrevet i den tidligste fase af tumor udvikling [10], [ ,,,0],38], [39]. Det er muligt, at et unikt sæt af genetiske og /eller epigenetiske ændringer, der skete i COLO 320DM celler kunne have skabt et ugunstigt miljø for BRAF

V600E at fremkalde DNA hypermethylering. Eksperimenter svarende til dem beskrevet ovenfor under anvendelse Caco-2 celler, der også viser CIMP- og bærer

BRAF

-Wild type, var ikke vellykket. Vi var ikke i stand til at skaffe stabilt transfekterede kloner som udviste detekterbare niveauer af BRAF

V600E (data ikke vist). Vedvarende BRAF

V600E udtryk kunne være uforenelig med Caco-2 celledeling grund cellulær aldring eller apoptose induceret af BRAF

V600E. Det er bemærkelsesværdigt, at vores RT-PCR-analyse viste den robuste ekspression af

IGFBP7 Salg, en mediator af BRAF

V600E-induceret senescens eller apoptose, i Caco-2-celler i modsætning til COLO 320DM celler.

Tidligere beskrev vi CIMP-associeret methylering af

MLH1

som den underliggende basis for fejlparringsreparationsmangel (MSI +) i sporadisk kolorektal cancer [5]. Minoo

et al.

Rapporterede

MLH1

DNA methylering ved stabil transfektion af BRAF

V600E i NCM460 cellelinje [40]. I vores system, vi ikke registrere en sådan stigning i

MLH1

DNA methylering (data ikke vist). Desuden af ​​de 33 BRAF

V600E primære tumorer undersøgte vi kun 42% (14/33) viste

MLH1

DNA hypermethylering. Derfor kan BRAF

V600E påvirke DNA hypermethylering af

MLH1

men kun under visse omstændigheder. Interessant nok i det foreslåede savtakket vej til CIMP + tumorer, både

BRAF

mutationer og CIMP + er blevet observeret i tidlige precursor læsioner, mens MSI + ikke har [6], [10], [41]. Således inaktivering af

MLH1

kan forekomme på et senere stadium af tumorudvikling. Minoo og kolleger observerede DNA hypermethylering af

CDKN2A

og 15 andre CIMP-associerede markører (

IGFBP7

blev ikke undersøgt) i forældre NCM460 celler, som begrænsede deres evne til at studere videre rolle BRAF

V600E inducerende CIMP i deres eksperimentelle system [40].

Interessant observerede vi, at det samlede DNA-methylering af den CIMP-specifikke loci i vore stabilt transficerede celler øges som funktion af celle passage. Det er interessant at bemærke, at et udvalg lægemiddel i dyrkede celler er blevet beskrevet at resultere i ændringer i den globale chromatinstruktur [42], og en lignende proces kan være forbundet med vore observationer her.

Desuden fandt vi relativt store inter-klonal (blandt forskellige kloner) variation i DNA methylering niveauer i vores transfektionsforsøg (figurerne 2B og 3), med en gennemsnitlig R

2 korrelation beregnes på basis af fire EVCs af 0,88 ± 0,01 (± sd). Vores gennemsnitlige intra-klonal (inden kloner på forskellige passager) R

2 korrelation er 0,97 ± 0,01 og R

2 korrelation mellem tekniske gentagelser i Illumina GoldenGate DNA-methylering analysen er 0,98 ± 0,02 [16]. Derfor har vi fundet nogle store forskelle i DNA-methylering på flere loci selv blandt kontrolpatienterne kloner (figur 2B og 3). Dette understreger vigtigheden af ​​at bruge flere kloner for denne type undersøgelser.

Alternativt den stærke association mellem CIMP og BRAF

kan opstå V600E hvis CIMP specifikt giver en gunstig cellulær kontekst for BRAF

V600E til fremme tumorigenese. I andet sæt eksperimenter, vi bestemt gener, hvis DNA hypermethylering blev tæt forbundet med BRAF

V600E og CIMP + i kolorektal cancer. Interessant nok vi observeret CIMP-afhængige DNA hypermethylering og transkriptionel inaktivering af

IGFBP7

, som er blevet vist at mediere BRAF

V600E-induceret cellulær senescens og apoptose [34]. BRAF

V600E er blevet vist at inducere cellulær senescens i dyrkede og primære humane celler [30], [31], samt musemodel [32]. Oncogene-induceret aldring (OIS) er blevet anerkendt som en vigtig tumor suppressor mekanisme [33]. For BRAF

V600E at fremme sine onkogene virkninger, er yderligere kooperative begivenheder kræves for at omgå ældning [33]. For nylig, det molekylære grundlag for BRAF

V600E-induceret senescens og apoptose er blevet undersøgt i detaljer. Wajapeyee et al. identificeret

IGFBP7

som mediator af BRAF

V600E-induceret aldring i humane primære fibroblaster ved hjælp af en genom-dækkende shRNA skærm. Deres senere fund tyder på, at

IGFBP7

udtryk er både nødvendig og tilstrækkelig til at fremkalde ældning og apoptose i humane primære melanocytter og melanom, hhv. Desuden har de observerede tab af

IGFBP7

i primære BRAF

V600E-positive melanom prøver og konkluderede, at lukke munden på

IGFBP7

udtryk er et afgørende skridt i udviklingen af ​​en melanom huser BRAF

V600E [34].

Promotor-associeret CpG ø DNA hypermethylering af

IGFBP7

er blevet rapporteret i humane kolorektale cancer cellelinjer så godt. DNA-methyleringsinhibitor 5-aza-2′-deoxycytidin er blevet vist at genoprette

IGFBP7

ekspression i kolorektale cancercellelinjer indikerer, at DNA-hypermethylering spiller en stor rolle i nedregulering af dette gen i kolorektalcancer [43 ]. Men dens forening med

BRAF

mutation og CIMP + status i humane kolorektal kræft er ikke blevet undersøgt. I denne undersøgelse fandt vi, at

IGFBP7

DNA hypermethylering er tumor-specifikke og stramt forbundet med kolorektale tumorer bærer BRAF

V600E og udviser CIMP. Desuden fandt vi, at

IGFBP7

DNA hypermethylering er forbundet med tab af udtryk i CIMP + kolorektale cancer cellelinjer. CIMP-specifik inaktivering af BRAF

V600E-induceret aldring og apoptose pathway af

IGFBP7

DNA hypermethylering kan skabe en gunstigere vilkår for erhvervelse af BRAF

V600E i CIMP + kolorektal cancer.

det er vigtigt,

IGFBP7

DNA hypermethylering blev ikke observeret i alle de

BRAF

mutant kolorektale tumorer. Lin

et al

. undersøgte DNA-sekvensen af ​​promotoren og exon regioner

IGFBP7

i ti kolorektale cancercellelinjer.