PLoS ONE: YK-4-279 Forhindrer ERG og ETV1 Mediated prostatakræft Cell Invasion

Abstrakt

Baggrund

Genomisk omrokeringer involverer ETS familie af transkriptionsfaktorer forekommer i 40-70% af prostatakræft tilfælde. ERG og ETV1 er de mest almindelige ETS medlemmer observeret i disse genetiske ændringer. Den høje forekomst af disse omrokeringer og deres biologiske betydning repræsenterer en ny terapeutisk mål for behandling af prostatacancer.

Metoder og Resultater

Vi har for nylig rapporteret udvikling af YK-4-279, en lille molekyle hæmmer af EWS-FLI1 oncoprotein i Ewings sarkom. Da ERG og ETV1 tilhører samme klasse af ETS faktorer som FLI1, vi testede evne YK-4-279 til at hæmme de biologiske funktioner af ERG og ETV1 proteiner i prostatakræft. YK-4-279 inhiberede ERG og ETV1 transkriptionel aktivitet i et luciferase assay. YK-4-279 faldt også ERG og ETV1 nedstrøms target mRNA og protein-ekspression i

ETV1

-fusion positiv LNCaP og

ERG

fusion positive VCap celler. YK-4-279 reduceret motilitet LNCaP-celler i en ridse assay og den invasive fænotype af både LNCaP og VCap celler i et HUVEC invasion assay. Fusion-negative PC3 celler reagerer på YK-4-279. SiRNA medieret ERG knockdown i VCAP celler resulterede i et tab af lægemiddel lydhørhed. Samtidig forbigående ERG udtryk i PC-3 celler medførte øget invasive potentiale, som blev reduceret med YK-4-279.

Konklusion

Disse data viser, at YK-4-279 hæmmer ERG og ETV1 biologisk aktivitet i fusion-positive prostatacancerceller fører til nedsat motilitet og invasion. Derfor YK-4-279 kan have en indvirkning på metastase i prostatakræft, og det kan yderligere vurderes for sine kliniske applikationer i prostatacancer udover Ewings sarkom

Henvisning:. Rahim S, Beauchamp EM, Kong Y, Brown ML, Toretsky JA, Uren A (2011) YK-4-279 Forhindrer ERG og ETV1 Mediated prostatakræft Cell invasion. PLoS ONE 6 (4): e19343. doi: 10,1371 /journal.pone.0019343

Redaktør: James McCubrey, East Carolina University, USA

Modtaget: December 20, 2010; Accepteret: 28 marts 2011; Udgivet: 29 April, 2011

Copyright: © 2011 Rahim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde var generøst støttet af Cancer center Support tilskud P30-CA051008 for brug af Biacore Molekylær Interaktion delte ressource. Støtte til arbejde kom også fra Børnecancerfonden (Baltimore MD), Go4theGoal, Dani Fond, Alex ‘Lemonade Stand Foundation, Liddy Shriver Sarkom Initiative, Burroughs Wellcome Klinisk Scientist Award i Translational Research (JT), og NIH R01CA133662 (JT) , R01CA138212 (JT), R01CA108641 (AU). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: En patentansøgning har indgivet af forfatterne til sammensatte YK-4-279. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige form for kræft og den anden mest førende årsag til kræft dødelighed hos mænd. Kromosomtranslokationer der involverer ETS-familien af ​​transkriptionsfaktorer er til stede i 40-70% af prostatakræft, herunder de mest klinisk aggressive former [1], [2], [3], [4], [5]. Disse translokationer producere kimære gener, der fusionerer promotorregionen af ​​et androgen responsive gen, såsom

TMPRSS2

, til den kodende region af ETS faktorer, hyppigst

ETV1

eller

ERG

[6], [7]. Disse omlejringer føre til androgenafhængig regulering af ETS transkriptionsfaktorer og deres overekspression. ETS proteiner er proto-onkogener, der har været impliceret i patogenese [8]. De styrer ekspression af målgener involveret i celleproliferation, apoptose, invasion og angiogenese. Over-ekspression af ETS faktorer i prostatacancerceller øge celleinvasion og inducerer prostata intraepitelialneoplasi (PIN) i transgene musemodeller [9]. Udtømning af ETS faktorer

in vitro

reducerer motilitet og invasionsevne. ERG og ETV1 udtømning også resultere i reduceret tumorvækst

in vivo

[7]. De seneste resultater viser også, at

TMPRSS2-ERG

udtryk reaktiveres i kastrationsresistent prostatacancer [10]. Således ETS proteiner repræsenterer et hidtil ukendt mål for forebyggelse eller behandling af metastatisk sygdom.

Vi har for nylig rapporteret en lille molekyle inhibitor for det kimære protein EWS-FLI1 i Ewings sarkom [11]. YK-4-279 hæmmer EWS-FLI1 aktivitet inducerer apoptose i Ewings sarkom cellelinjer og sinker tumorvækst i mus xenograftmodeller. FLI1, ERG og ETV1 er klasse I ETS faktorer og dele mere end 60% identitet og 80% homologi i deres aminosyresekvenser [12]. På grund af den tætte homologi af FLI1 med ERG og ETV1, testede vi evnen hos YK-4-279 til at inhibere ETS genaktivitet i prostata cellelinjer, der demonstrerer androgenafhængige ERG og ETV1 ekspression. Vores resultater viser, at YK-4-279 kan hæmme ERG og ETV1 afhængig transkriptionel aktivitet og dermed fører til reduceret celle motilitet og invasion.

Resultater og Diskussion

VCAP og LNCaP celler androgen-responsive og harbor ERG og ETV1 omlejringer Salg

prostata kræver androgener til at fungere ordentligt og androgen reaktionsevne kan anvendes som grundlag for gruppering prostatakræft-cellelinier i en af ​​to kategorier: androgen-følsomme og androgen-resistente. I de fleste ETS omlejring tilfælde er ETS-genet placeret under direkte regulering af en androgen-responsiv genpromotor. I disse tilfælde androgen medierer overekspression af den onkogene ETS faktor. For at undersøge virkningen af ​​ETS-inhibitorer i prostatacancer valgte vi at arbejde med VCap og LNCaP-celle-linjer. Den VCap cellelinje huser et TMPRSS2-ERG-omlejring, som sker via interstitiel deletion af 3 Mb regionen mellem TMPRSS2 og ERG på kromosom 21 (fig. 1a) [6]. LNCaP-celle-linie indeholder en genetisk translokation hvor der er indsat hele ETV1 locus i den sidste intron af prostata-specifikt MIPOL1 region på kromosom 14 (fig. 1a) [7]. ERG og ETV1 omlejringer er gensidigt udelukkende til VCap og LNCaP-celler henholdsvis og er ikke til stede i PC-3-cellelinjen. Således blev PC-3 cellelinie valgt som en negativ kontrol for vores studier. Vi valideret, at både VCap og LNCaP-celler er androgen-sensitive, hvilket fremgår af en stigning i prostataspecifikt antigen (PSA) ekspression ved stimulering af den syntetiske androgenanalog R1881 (fig. 1b). VCap og LNCaP-celler udtrykker ERG og ETV1 proteiner under basale betingelser på grund af tilstedeværelsen af ​​

ETS

omlejringer i disse celler. Androgen behandling af disse cellelinier, men ikke PC-3, resulterer i forøget ERG og ETV1 mRNA og protein (fig. 1c og d). Disse resultater fastslår, at både VCap og LNCaP-celler er androgen responsive mens PC-3 celler ikke. Androgen reaktionsevne VCAP og LNCaP celler oversætter til øget ETV1 og ERG udtryk på grund af prostatakræft specifikke kromosomale omlejringer.

a) Prostata celler blev analyseret for ETS omlejring status ved at udføre PCR hjælp omlejring specifikke primer. VCAP celler havnen i TMPRSS-ERG omlejring mens LNCaP celler indeholder omarrangeret ETV1. VCap og LNCaP-celler udtrykker ERG og ETV1 protein henholdsvis under basale betingelser. PC-3 celler ikke indeholder enten omordning og udtrykker ikke ERG eller ETV1. b) VCap og LNCaP-celler udtrykker PSA som reaktion på R1881 behandling. PC-3 celler ikke androgen lydhør. Celler blev behandlet med 10 nM R1881 i 48 timer og PSA-ekspression blev analyseret ved real-time qPCR. Resultaterne blev normaliseret til actin. *; p 0,0001, n.s .; ikke-signifikant. c) R1881 stimulering resulterer i forøget ERG og ETV1 mRNA i VCap og LNCaP-celler henholdsvis, men ikke i PC3-celler. RNA blev isoleret fra androgen stimulerede celler og anvendes til at udføre real-time qPCR. Dataene blev normaliseret til det niveau af genekspression i fraværet af androgen. d) ERG og ETV1 proteiner udtrykkes i VCap og LNCaP-celler henholdsvis, men ikke i PC-3-celler. Androgen stimulation resulterede i øget ERG og ETV1 protein i VCap og LNCaP-celler. Prostata celler udtrykte ikke FLI1 protein under basal eller androgen stimulerede betingelser. MOLT4 blev anvendt som en positiv kontrol celle-linje for FLI1 udtryk.

YK-4-279 hæmmer ERG og ETV1 transkriptionel aktivitet

YK-4-279 retter sig mod EWS-FLI1 onkoprotein i Ewings sarkom [11]. Men, stedet for interaktion med EWS-FLI1 er ukendt. I betragtning af den tætte homologi mellem FLI1, ERG og ETV1 undersøgte vi effekten af ​​YK-4-279 på ERG og ETV1 funktion. Vi først evalueret udtryk for FLI1 i prostata celler. Den humane akut lymfoblastisk leukæmi cellelinje MOLT4 blev anvendt som en kontrol for FLI1 ekspression, under basale betingelser. Ingen af ​​prostata celler anvendt i denne undersøgelse udtrykker FLI1 (fig. 1d). Derfor ville virkningerne af YK-4-279 på prostata celler ikke opstå som følge af målretning FLI1. Dernæst vi valideret direkte interaktion mellem YK-4-279 og rekombinant ERG og ETV1 proteiner under anvendelse af overfladeplasmonresonans (SPR). YK-4-279 bundet til ERG med en affinitet (K

D) på 11,7 uM og bundet til ETV1 med en affinitet på 17,4 uM (fig. 2a, S1). Vi evaluerede YK-4-279 for virkninger på ERG transkriptionel aktivitet under anvendelse af en transient transficeret 207 bp fragment af Id2 genpromotoren der styrer ekspression af luciferase protein. Denne minimale Id2 promotorregionen indeholder to ETS sites og forud er vist at binde ERG [13]. Co-transfektion af ERG og Id2 reporter resulterede i en stigning i luciferaseaktivitet. Promotoraktivitet blev reduceret ved samtidig behandling af cellerne med YK-4-279, uden nogen mærkbar nedgang i ERG proteinniveauer (fig. 2b).

a) Bindende kinetik for YK-4-279 til ERG og ETV1 blev bestemt ved overfladeplasmonresonans. YK-4-279 bundet til ERG og ETV1 med en K

D på 11,7 uM og 17,9 uM hhv. SPR sensorgrams findes i supplerende tal (fig. S1). b) En luciferase assay blev udført i COS-7-celler co-transficeret med ERG og en Id-2 reporter luciferase-konstruktion. Id-2 promotoraktivitet blev reduceret ved YK-4-279 behandling uden at påvirke ERG proteinniveauer. *; p 0,001. c) VCAP celler blev behandlet med 50 nM siERG eller 10 uM YK-4-279 i 48 timer og mRNA og protein ekspressionsniveauer af ERG mål blev evalueret. YK-4-279 behandling resulterede i nedsat udtryk for Plau, ADAM19 og PLAT mRNA. Plau og PLAT protein niveauer blev reduceret så godt. Resultaterne var sammenlignelige med dem opnået ved siRNA medieret ERG knockdown. d) LNCaP-celler blev behandlet med 1 uM YK-4-279 og ETV1 målgenprodukter niveauer blev evalueret. YK-4-279 behandling resulterede i reduceret genekspression af MMP13 uden væsentlig reduktion i ETV1 niveauer. *; p. 0,01

Næste, vi evaluerede effekten af ​​YK-4-279 på ekspressionen af ​​endogene ERG og ETV1 målgener i VCAP og LNCaP cellelinjer. Vi fokuserede på flere medlemmer af plasminogenaktivatoren pathway såsom Plau, PLAT, MMP13 og ADAM19. Disse gener mægle en invasiv fænotype i flere kræftformer og er blevet rapporteret som direkte mål for ETS transkriptionsfaktorer [9], [14], [15]. Eksponering af VCAP celler til 10 uM YK-4-279 i 48 timer resulterede i signifikant reducerede mRNA og protein niveauer i flere ERG målgener, såsom Plau, PLAT og ADAM29. Niveauet af nedregulering var sammenlignelig med den opnået ved siRNA medieret ERG knock-down i VCAP celler (fig. 2c). Tilsvarende YK-4-279 resulterede i nedregulering af ETV1 målgen MMP-13 i LNCaP-celler (fig. 2d). Det skal bemærkes, at denne inhibering af ERG og ETV1 proteinaktivitet blev opnået uden nogen signifikant nedgang i ERG eller ETV1 proteinniveauer. Disse resultater antyder, YK-4-279 er i stand til at inhibere ERG og ETV1 transkriptionel aktivitet i prostatacancerceller, hvilket fører til nedsat ekspression af gener, der er involveret i nedbrydning af ekstracellulær matrix og metastase.

YK-4- 279 hæmmer ETS medieret prostatakræft celle invasion

Tidligere undersøgelser har antydet, at

ETS

gen omlejringer mægle invasion i prostatakræft [7], [9]. For at løse spørgsmålet om, hvorvidt YK-4-279 er i stand til at hæmme ERG og ETV1 medieret invasion, vi udnyttet en impedans baseret endothelcelle invasion assay [16]. Denne teknik indebærer udfordrende et konfluent monolag af humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC’er) med et andet lag af metastatiske celler, der knytter sig til, og invadere HUVEC monolaget. Tilbagetrækningen af ​​endotheliale celle vejkryds og invasion af prostatacancerceller kan kontrolleres i realtid ved at måle faldet i elektrisk modstand på guldelektroder [17].

A cytotoksicitet assay blev udført for at bestemme den maksimale tolerable dosis af YK-4-279 i forskellige prostatacancercellelinjer. YK-4-279 viste ikke nogen signifikant reduktion i cellevækst ved 1 uM for LNCaP-celler og 10 pM for VCap og PC3-celler efter 2 dages behandling (data ikke vist). Disse doser blev udvalgt til yderligere funktionelle assays for at sikre, at inhibitoriske virkninger af YK-4-279 om invasion og motilitet, er ikke som følge af celledød. Da HUVEC celler blev udfordret med LNCaP og VCAP celler, førte det til en stejl nedgang i el-modstand tegn på celle invasion. Behandling af disse celler med YK-4-279 resulterede i signifikant nedsat invasion af HUVEC-celler ved LNCaP og VCap celler. Forbindelsen alene havde ingen virkning på HUVEC cellemonolaget. YK-4-279 hæmmede ikke invasion af

ETS

-fusion negativ PC-3 celler. (Fig. 3a og b). For at sikre, at de observerede effekter var på grund af hæmning af ETS proteiner, vi reduceret ERG proteinekspression i VCAP celler ved hjælp af siRNA. Dette resulterede i ophævelse af YK-4-279 medieret inhibering af invasion (fig. 3c). Dernæst vi forbigående udtrykt ERG i PC-3-celler og undersøgt disse celler i endotel invasion celleassay. ERG udtryk alene i PC-3 celler bibragt på disse celler en mere invasiv fænotype. Behandling med YK-4-279 hæmmede signifikant ERG medierede stigning i invasion (Fig. 3d). Tilsammen antyder disse resultater, at YK-4-279 er i stand til at inhibere ETS-medieret invasion af prostatacancerceller, både i celler med endogent og eksogent høj ekspression af ETS-proteiner. Salg

a) HUVEC-celler danner et konfluent monolag blev udfordret med LNCaP, VCAP og PC-3 celler med eller uden YK-4-279. YK-4-279 hæmmede VCAP (10 uM) og LNCaP (1 uM) celle invasion af HUVEC’er, mens PC-3 celler ikke blev berørt. Prostata celler blev forbehandlet med YK-4-279. Eksperimenter blev udført in duplo og modstandsdygtighed blev normaliseret til tidspunktet for tilsætning af invaderende celler. b) Invasion blev kvantificeret ved 10 timer efter tilsætning af prostatacancerceller. Resultater er udtrykt i forhold til ikke-behandlede betingelser. *; p 0,01. c) ERG ekspression blev reduceret i VCAP celler under anvendelse af en C-terminal siRNA probe. ERG knockdown i VCAP celler resulterede i et tab af YK-4-279 medieret hæmning af invasion. VCAP celler blev forbehandlet med 10 pM YK-4-279 til 2 dage før udfordre HUVEC monolag. *; p 0,01, d) Forbigående ERG ekspression i PC-3-celler bibringes cellerne en mere invasiv fænotype. Efterfølgende YK-4-279 behandling resulterede i nedsat invasion. PC-3 celler blev behandlet med YK-4-279 i 24 timer før udfordre HUVEC monolag.

YK-4-279 hæmmer ETV1 medieret motilitet i LNCaP Celler

Næste testede vi virkningerne af YK-4-279 på inhibering af motiliteten af ​​LNCaP-celler i en ridse assay. Alle eksperimenter i tidligere tal blev udført med lave passage LNCaP celler (p 30). Imidlertid er lav-passage LNCaP-celler var ikke muligt at foretage en denne teknik, da de løst tillægger celle-kultur skål overflade. Tilsvarende VCap celler vokser i klumper og ikke danner et konfluent monolag. Derfor udførte vi scratch assays ved hjælp af høj passage LNCaP-celler (p 60). High-passage LNCaP-celler vokse i et meget hurtigere og er i stand til at danne et konfluent monolag [18]. De udtrykker også høje basalniveauer af ETV1 (fig. 4a) [19]. Før udførelse af bunden assayet blev YK-4-279 testet for dets cytostatiske natur og viste sig at have nogen virkning på celle-proliferation ved koncentrationer, der anvendes til bunden assay (Fig. S2). YK-4-279 behandling af LNCaP-celler resulterede i et signifikant fald i cellemotilitet i scratch-assayet, mens ingen effekt blev observeret på motiliteten af ​​den negative kontrol-cellelinje, PC-3 (fig. 4b). Den ridse assay blev også udført med forbehandling af LNCaP-celler med 10 pg /ml mitomycin C i 2 timer før ridse overfladen. YK-4-279 var i stand til at hæmme LNCaP celle motilitet i mitomycin behandlede vilkår samt (fig. S3) Disse resultater tyder på, at effekten af ​​YK-4-279 på LNCaP celler i bunden assay skyldes ikke cytotoksicitet, men alene på grund af til inhibering af cellemotilitet.

a) High-passage LNCaP-celler blev analyseret for ETV1 ekspressionsniveauer. HP-LNCaP-celler konstitutivt udtrykker højere mængder af ETV1, sammenlignet med PC-3-celler. b) YK-4-279 hæmmede motilitet i en ridse assay i høj passage LNCaP celler, mens PC-3 celler ikke reagerer. Cellemotilitet blev kvantificeret ved at måle afstanden mellem de vandrende cellegrænser. Motilitet blev udtrykt i forhold til bærerbehandlede betingelser. *; p. 0,0001

EWS-FLI1 oncoproteinet er afhængig af binding til RNA Helicase A (RHA) for sin onkogene funktion [20]. YK-4-279 inducerer apoptose i Ewings sarkom-celler ved at blokere interaktionen mellem EWS-FLI1 og RHA. Som en mulig mekanisme for aktiviteten af ​​YK-4-279 i prostatacancer, undersøgte vi, om vekselvirkning mellem et ETS familiemedlem og RHA er til stede i prostata celler samt. Mens ERG ikke interagerer med RHA i prostatacancerceller, YK-4-279 kan ikke blokere denne interaktion (fig. S4). Vi testede også, om YK-4-279 er i stand til at blokere ERG eller ETV1 binding til ETS sites på DNA’et ved anvendelse af overfladeplasmonresonans. YK-4-279 ikke hæmmer ERG eller ETV1 DNA-binding (fig. S5a). Endvidere blev kromatin immunofældning udført for at vurdere ERG-binding til Plau promotor i nærvær af YK-4-279. Resultater bekræftede Biacore fund, YK-4-279 ikke interfererer med ERG DNA-binding (Fig S5b). Det skal bemærkes, at Ewings celler udtrykker en trunkeret FLI1 protein indeholdende kun exon 6-9 af FLI1. ETS translokationer i prostatacancer, på den anden side, resulterer i ekspressionen af ​​en næsten fuld-længde ETS familiemedlem. Vi derfor hypotesen, at YK-4-279 kan inhibere ETV1 og ERG funktion i prostatacancerceller ved at forhindre protein-protein interaktioner, der er anderledes end EWS-FLI1 partnere i Ewings sarkom. Derfor er yderligere undersøgelse kræves for at fastslå den nøjagtige molekylære mekanisme af YK-4-279 medieret hæmning af ERG og ETV1 funktion i prostata kræftceller.

Resultatet af ETV1 hæmning synes at være mere potent end ERG hæmning, i form af celle-motilitet og invasion. Dette fænomen kan ikke endeligt tilskrives bedre ETV1 inhibering, som en rimelig sammenligning af data kompliceres af den kendsgerning, at ERG og ETV1 udtrykkes i forskellige cellelinier. Således kan kvaliteten af ​​respons også være en faktor af forskelle mellem LNCaP og VCap celler. Yderligere eksperimenter, såsom at måle størrelsen af ​​ERG og ETV1 respons i samme celle-linje, vil være forpligtet til at endegyldigt løse dette punkt.

De seneste rapporter har antydet, at ETS knock-down i prostata kræftceller kan resultere i nedsat proliferation i celler, der udtrykker disse oncoproteiner [21], [22]. Selvom eksperimenterne i dette manuskript blev udført ved doser og tidsintervaller, der ikke var toksisk for cellerne, ser der ud til at være en direkte sammenhæng mellem ekspressionen af ​​ETS proteiner og YK-4-279 cytotoksicitet. ETS-omlejring negative PC-3 og DU-145 celler viser minimal respons på YK-4-279 behandling (IC50 100 uM). Tværtimod YK-4-279 er mere toksisk for både VCap (IC50 = 9,55 uM efter 72 h) og LNCaP-celler (2,75 pM efter 72 timer). Derfor kan YK-4-279 også evalueres for sine cytotoksiske potentialer i ETS-omlejring positive prostata kræftceller i fremtidige undersøgelser.

androgen afhængig overekspression af ERG og ETV1 protein i prostata kræftceller har været direkte impliceret til øget invasion og metastase. Desuden har flere undersøgelser korrelerede den forøgede ekspression af disse proteiner med dårlig prognose, højere Gleason scores og en lavere forekomst af tilbagefald overlevelse. I øjeblikket er androgenafhængige signalveje i prostatacancer målrettet via kastrering og androgen receptor antagonister. Virkningerne af disse behandlinger kan være delvist tilskrives nedregulering af omlejrede ETS faktorer. Således den succesfulde udvikling af små molekyler hæmmere af ERG og ETV1, såsom YK-4-279, vil repræsentere en ny linje af lægemidler rettet mod at forebygge eller behandle metastatisk sygdom, og samtidig spare patienterne de langsigtede virkninger af behandlinger rettet mod androgen pathway.

Materialer og metoder Salg

Cell Culture

VCap, LNCaP, PC-3 og DU-145-celler blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA ). HUVEC’er blev fremskaffet fra Lonza Biosciences (Allendale, NJ). VCap celler blev holdt i DMEM-medium suppleret med 10% kalvefosterserum. LNCaP, PC-3 og DU-145-celler blev holdt i RPMI-medium suppleret med 10% FBS og 1% HEPES. HUVEC-celler blev dyrket i EBM-2-medier (Lonza) suppleret med EGM-2 bullet-kit (Lonza) indeholdende vækstfaktorer, antibiotika og 5% FBS.

Western-Blots

Proteinlysater var fremstillet og vestlige-blots udført som tidligere beskrevet [23]. ERG (sc-354), ETV1 (sc-1953) FLI1 (sc-356), PLAT (sc-5241) og actin (sc-1615) antistoffer blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Anti-Plau antistof blev indkøbt fra Calbiochem (Gibbstown, NJ).

mRNA isolation og qPCR

mRNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og cDNA blev fremstillet under anvendelse transcriptor første- cDNA-syntese kit (Roche, San Francisco, CA) ifølge producentens protokol. QRT-PCR blev udført ved anvendelse SYBR green (Roche) på et Mastercycler realplex

4 instrument (Eppendorf, New York, NY). Genekspression blev normaliseret til actin. Primerpar er anført i supplerende tabel S1.

omlejring status

Genomisk DNA blev isoleret fra PC-3, LNCaP og VCAP celler under anvendelse Wizard genomisk DNA ekstraktion kit (Promega, Madison, WI) ifølge til producentens protokoller. PCR blev udført ved anvendelse af primere flankerende omlejring sites. Primer sekvenser kan findes i supplerende tabel S1.

Binding Kinetik

Steady state bindingsaffiniteter blev målt på en Biacore T100 instrument. Rekombinant ERG og ETV1 (Origene, Rockville, MD) proteiner blev immobiliseret på CM5 chips ved aminkobling og 6 forskellige koncentrationer af YK-4-279 blev injiceret over overfladen i dubletter. SPR sensorgrams og K

D-værdier blev opnået under anvendelse af Biacore T100 software.

Luciferase Assay

Cos-7-celler blev co-transficeret med en lentiviral plasmid, der udtrykker den mest almindeligt forekommende trunkerede ERG mRNA, og en vektor indeholdende Id2 genpromotoren driver ekspression af et luciferasegenet. Transfektion blev udført ved anvendelse Fugene 6 (Roche) ifølge producentens protokoller. En lentiviral vektor der udtrykker LacZ blev anvendt som en negativ kontrol. Cellerne fik lov til at udtrykke ERG i 48 timer og derefter blev de behandlet med 10 pM YK-4-279. Luciferaseaktivitet blev målt efter 24 timer ved anvendelse af en dobbelt luciferase assay kit ifølge producentens protokol (Promega, Madison, WI). Resultater blev normaliseret til total proteinkoncentration. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af GraphPad Prism 4.0.

Androgen og YK-4-279 behandling

I androgen behandling, celler blev podet i phenol-rød frie medier indeholdende 10% trækul-strippet FBS og lov til at binde til celle- kultur skål natten over. Efterfølgende blev cellerne serumudsultet i 48 timer i phenol-rød frie medier og derefter stimuleret med 10 nM R1881 (Sigma, St-Louis, MO) i 2 dage.

YK-4-279 blev opløst i DMSO til fremstilling af 10 mM stamopløsning. Logaritmisk voksende celler blev behandlet med en uM eller 10 uM YK-4-279 i 48 timer før vurderingen for genekspression.

siRNA ERG knockdown

Forbigående ERG knockdown blev udført ved hjælp af en brugerdefineret siRNA (5′-CGACATCCTTCTCTCACAT-3 ‘) rettet mod den C-terminale ende af ERG (Dharmacon, Lafayette, CO) [21]. 50 nM siRNA blev transficeret under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens protokoller. Celler blev analyseret for ERG knockdown 5 dage efter transfektion med siRNA.

Transient ERG Expression

PC-3-celler blev transficeret med en pLenti6 /V5-DEST plasmid (Invitrogen), der udtrykker mest almindeligt fundet trunkeret ERG isoform. Transfektion blev udført ved anvendelse Fugene 6 reagent (Roche) ifølge producentens protokoller i 48 timer.

HUVEC Invasion

Anti-invasiv potentiale YK-4-279 blev målt ved hjælp af teknik for elektrisk celle impedans sensing (ECIS) på ECIS Z instrument (Applied Biofysik, Troy, NY) og xCELLigence systemet (Roche). Kort fortalt blev 250.000 HUVEC-celler podet i 8W10E + arrays med elektrode kredsløb ved brøndbund at måle elektrisk modstand. Efter dannelsen af ​​en sammenflydende HUVEC monolag (app. 21-24 timer) blev de invaderende prostatacancerceller tilsat ved en tæthed på 100.000 celler per brønd i DMEM eller RPMI-medium indeholdende de indikerede medikamentkoncentrationer. Tumor celler blev forbehandlet i 24-48 timer med YK-4-279 før tilsætning. Dette tidspunkt af tumorcelle tilsætning blev accepteret som blev overvåget 0 timer af behandlingen og invasion under de følgende 12 timer ved måling af ændringer i modstanden på celle-elektrode interfase. Eksperimenterne blev udført in duplo. Resistens blev normaliseret til tidspunktet for tilsætning af invaderende celler.

Scratch Assay

Celler blev udpladet og fik lov til at danne et konfluent monolag. Celleoverfladen blev ridset ved anvendelse af en p-200 pipettespids. Cellerne fik lov at fylde ridset område og overvåget i løbet af 72 timer. Billeder blev taget ved hjælp af et Nikon Eclipse Ti mikroskop (Nikon, Melville, NY). Cellemotilitet blev kvantificeret ved at måle afstanden mellem de vandrende cellegrænser.

chromatin immunoprecipitation (chip)

PC-3-celler blev transficeret med en pLenti6 /V5-DEST plasmid (Invitrogen), der udtrykker mest almindeligt forekommende trunkerede ERG isoform. Transfektion blev udført ved anvendelse Fugene 6 reagent (Roche) ifølge producentens protokoller for 24 timer. Celler blev derefter behandlet i 6 timer med 10 pM køretøj eller YK-4-279. Chippen blev udført under anvendelse EZMagna Protein en chip Kit fra Millipore ifølge producentens anvisninger. Immunfældning blev udført under anvendelse af 2 ug ERG antistof (SC- 354x, Santa Cruz Biotechnology), 2 ug normalt kanin IgG (Sigma Aldrich) og 1 ug Pol II (Millipore). PCR blev udført ved anvendelse af primere tidligere offentliggjorte for positiv ERG bindende på Plau promotoren i prostata celler [9]. Et PCR-profil på 94 ° C-5 min: 1 cyklus, 94 ° C-30 sek, 55 ° C-30 sek, 72 ° C-1 min: 35 cykler, 72 ° C-5 min: 1 cyklus blev anvendt på en Eppendorf Realplex4 thermocycler

Statistisk analyse

grupper blev sammenlignet ved hjælp af en to-tailed t-test (Prism 4, GraphPad Software, La Jolla, CA) og p. 0,05 blev anset for signifikant .

Støtte Information

figur S1. Salg SPR sensorgrams for YK-4-279 binding til ERG og ETV1. Steady state bindingsaffiniteter blev målt ved at injicere 6 forskellige koncentrationer af YK-4-279 løbet rekombinante ERG og ETV1 proteiner immobiliseret på overfladen af ​​CM5 chips i en Biacore T100 instrument. SPR sensorgrams blev opnået ved hjælp af Biacore T100 software

doi:. 10,1371 /journal.pone.0019343.s001

(TIF)

Figur S2.

YK-4-279 er ikke en cytostatisk. VCap (10.000 celler /brønd), LNCaP-høj passage (10.000 celler /brønd), LNCaP-lav passage (10.000 celler /brønd) og PC-3 (5.000 celler /brønd) -celler blev podet natten over i xCELLigence E-16 plader og lov til at holde sig til godt bund. Den xCELLigence E-16 plader godt bunden er dækket med miniature guld-elektroder, som måler ændringer i elektrisk modstand på overfladen af ​​elektroderne. Ændringer i elektrisk modstand er repræsenteret som en dimensionsløs parameter betegnes celle-indeks, og er direkte proportional med arealet af godt bund dækket af elektroder. Ca. 20 timer efter podning prostatacancerceller blev kulturmedier erstattet med frisk medium indeholdende 1 uM (LNCaP, PC-3) eller 10 pM (VCap) YK-4-279. Celleproliferation blev overvåget i løbet af 72 timer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0019343.s002

(TIF)

Figur S3.

YK-4-279 inhiberer LNCaP cellemotilitet. Celler blev udpladet og fik lov til at danne et konfluent monolag. Celler blev behandlet med 10 ug /ml mitomycin-C i 2 timer inden ridse assay som tidligere beskrevet [24], [25]. Efter mitomycin-C-behandling, blev frisk medium tilsat, og celle-overflade blev ridset ved anvendelse af en p-200 pipettespids. Cellerne fik lov at fylde ridset område og overvåget i løbet af 60 timer. Cell motilitet blev kvantificeret ved at måle arealet af bunden ikke er dækket med migrerende celler .. motilitet blev udtrykt i forhold til bærerbehandlede betingelser. *; p 0,0001

doi: 10,1371 /journal.pone.0019343.s003

(TIF)

Figur S4.

ERG interagerer med RHA i VCap celler. Yk-4-279 ikke blokerer interaktionen mellem ERG og RHA. 9 × 10

7 VCAP celler blev podet i 15 cm-skåle og fik lov til at vedhæfte og spredes i 48 timer. Celler blev behandlet med 10 pM YK-4-279 i 24 timer. Immunfældning blev udført som tidligere beskrevet [11]

doi:. 10,1371 /journal.pone.0019343.s004

(TIF)

Figur S5.

YK-4-279 hæmmer ikke ERG eller ETV1 binding til DNA. a) Rekombinant ERG eller ETV1 proteiner blev immobiliseret på overfladen af ​​en Biacore CM5 chip ved aminkobling. Vildtype dobbeltstrengede oligonukleotider (ATGTAGACCGGAAGTAACTA) indeholdende konsensus Ets bindende site “GGAA” blev injiceret i 5 uM triplikater over overfladen af ​​chippen i nærværelse eller fravær af 50 uM YK-4-279.