PLoS ONE: Identifikation af Novel Molekylære Mål for endometriecancer Brug en Drill-Down LC-MS /MS-metoden med iTRAQ

Abstrakt

Baggrund

Antallet af patienter med endometriecancer (EMCA ) med fremskredent stadium eller høj histologisk kvalitet er stigende og prognose er ikke blevet bedre til i det seneste årti. Der er et presserende behov for opdagelsen af ​​nye molekylære mål for diagnose, prognose og behandling af EMCA, som vil have potentiale til at forbedre den kliniske strategi og resultatet af denne sygdom.

Metode og Resultater

Vi brugte en “drill-down” proteomics tilgang for at lette identifikationen af ​​nye molekylære mål for diagnose, prognose og /eller terapeutisk intervention for EMCA. Baseret på peptidioner identificeret og deres retentionstider i første LC-MS /MS-analyse, blev en liste udelukkelse genereret for efterfølgende iterationer. I alt 1529 proteiner er blevet identificeret under Proteinpilot® 5% fejl tærskel fra de syv sæt af iTRAQ udførte forsøg. I gennemsnit er den anden iteration tilsat 78% nye peptider til dem identificeret efter den første kørsel, mens den tredje iteration tilsat 36% yderligere peptider. Af de 1529 proteiner identificeret, kun 40 opfyldte vores kriterier for betydelig forskellen udtryk i EMCA sammenlignet med normale proliferative væv. Disse proteiner inkluderet metaboliske enzymer (pyruvatkinase M2 og lactatdehydrogenase A); calciumbindende proteiner (S100A6, calcyphosine og calumenin) og proteiner involveret i regulering af inflammation, proliferation og invasion (annexin A1, interleukin enhancer-bindende faktor 3, alfa-1-antitrypsin, makrofag capping protein- og cathepsin B). Netværk analyser afslørede regulering af disse molekylære mål ved c-myc, HER2 /neu og TNF-alfa, hvilket tyder på indgreb med disse veje kan være en lovende strategi for udviklingen af ​​nye molekylære målrettede behandlinger for EMCA.

Konklusioner

Vores analyser viste betydningen af ​​drill-down proteomics tilgang i kombination med iTRAQ at overvinde nogle af de begrænsninger af de nuværende proteomics strategier. Denne undersøgelse førte til identifikation af en række nye molekylære mål har terapeutisk potentiale for målrettede molekylære behandlinger af endometrie karcinom

Henvisning:. Voisin SN, Krakovska O, Matta A, DeSouza LV, Romaschin AD, Colgan TJ, et al. (2011) Identifikation af Novel Molekylære Mål for endometriecancer Brug en Drill-Down LC-MS /MS-metoden med iTRAQ. PLoS ONE 6 (1): e16352. doi: 10,1371 /journal.pone.0016352

Redaktør: Yang Cai, Forskningsinstituttet for Børn, USA

Modtaget: August 24, 2010; Accepteret: December 20, 2010; Udgivet: 31 Jan 2011

Copyright: © 2011 Voisin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støtten af den canadiske Cancer Society Research Institute (tidligere National Cancer Institute of Canada) er taknemmeligt anerkendt. AB SCIEX forudsat infrastrukturelle og reagens støtte for denne forskning; Ajay Matta er modtageren af ​​en MITACS Accelerate Fellowship, Ontario, Canada. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser. AB SCIEX giver infrastrukturelle og reagens støtte for denne forskning, men har ingen redaktionelle input i dette manuskript. Endvidere ændrer dette ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

endometrialcarcinom (EMCA) er den fjerde mest udbredt kræft hos kvinder i Nordamerika, med 42160 nye tilfælde og 7780 dødsfald forventes i år i USA alene [1]. Der er to hovedtyper af endometriecancer: Type I EMCA af endometrioide histologi og type II EMCA som er serøs eller klar celle i morfologi, den sidstnævnte type typisk er den mere aggressive af de to. Type I EMCA er den almindelige form for endometriecancer, som udgør omkring 70-80% af de samlede sager [2], [3]. Diagnosen er hovedsagelig baseret på histologisk undersøgelse af væv opnået efter en biopsi, en invasiv procedure typisk som følge af undersøgende diagnose på unormal uterin blødning ved præsentationen. Endometriale carcinomer er primært behandlet ved hjælp af kirurgi med ekstra stråling og /eller kemoterapi, og relativt gunstige resultater er nået forudsat de kræftformer opdages tidligt. Imidlertid er antallet af patienter med EMCA i et fremskredent stadium eller høj histologisk kvalitet, hvilket er tegn på en dårlig prognose, er stigende [2], [4]. Der er et presserende behov for opdagelsen af ​​nye molekylære mål for diagnose, prognose og behandling af EMCA, som vil have potentiale til at forbedre den kliniske strategi og resultatet af denne sygdom.

For nylig har der været intens interesse i studiet af globale proteinekspression, og proteomiske tilgange synes at præsentere en ny strategi for kræftforskning og identifikation af nye biomarkører for klinisk anvendelse. Talrige proteom undersøgelser foretaget i de senere år har forsøgt at opdage potentielle kræft biomarkører gennem differentieret protein screening ved hjælp af kræft og ikke-kræft væv [5] – [9]. En af de mest udbredte teknologier til biomarkør opdagelse er en bottom-up-tilgang, der involverer kemiske mærkning af peptider som følge af enzymatisk nedbrydning af prøven proteiner, efterfulgt af blanding af kontrol- og testprøverne før væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC MS /MS) analyse for at sikre ens behandling af prøverne [6], [7], [9]. Blandt de mere almindelige af disse mærkningsreagenser i brug i øjeblikket er de isobare tags for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) [10]. Tagging muliggør skelne af ellers identiske peptider stammer fra individuelle prøver i blandingen via reporter ioner dannet af disse tags, som tillader relativ kvantificering af den givne peptid i prøverne, og dermed det tilsvarende protein. På grund af kompleksiteten af ​​vævsprøver, er en præ-fraktionering af prøverne ved hjælp af stærk kationbytter (SCX) typisk, forud for analytisk adskillelse på nanoskala omvendt fase (RP) søjle, som er koblet online med massespektrometer. Trods denne todimensionale kromatografisk separation, er der stadig en tendens til et stort antal peptider til at co-eluere under RP separation på grund af prøven kompleksitet. Som følge heraf massespektrometeret er typisk kun i stand til at undersøge en brøkdel af peptiderne på grund af tidspres. I et automatiseret dataopsamling, MS software tendens til at favorisere analyse af de mest udbredte peptider på bekostning af medeluering peptider af lavere mængderne. Da mange kræft-relevante proteiner, herunder signalering og regulatoriske proteiner, typisk udtrykt i lave koncentrationer, denne bottom-up, shotgun tilgang tendens til at gå glip af at erhverve den mest værdifulde oplysninger [11]. En mulig løsning på dette problem er en iterativ analyse af den samme prøve, kombineret med en udelukkelse listen over identificerede peptider, der er genereret efter hver kørsel og anvendes til at informere valget af ioner, der er målrettet til MS /MS-analyse under efterfølgende kørsler. Denne strategi tvinger massespektrometeret for at målrette nye, mindre rigelige peptider til MS /MS-analyse under hver successiv iteration. Variationer af denne fremgangsmåde er blevet rapporteret til matrix-assisteret laser desorption /ionisering (MALDI) MS /MS og ESI-MS /MS [12], [13].

I undersøgelsen, brugte vi en iterativ analyse henviste heri som “bore ned approach”, for at lette identifikationen af ​​nye molekylære mål for diagnose, prognose og /eller terapeutisk intervention for endometriecancer. Det vigtigste mål med denne drill-down metode er at grave flere peptider. Efter den første LC-MS /MS-analyse blev de identificerede peptid ioner og deres retentionstid tilsat for at generere en liste over produkter for yderligere iterationer i LC-MS /MS-analyse. Vores tilgang er begrebsmæssigt svarer til “selektive forløber ion udstødelse” (sel-PIE) metoden tidligere beskrevet af Wang

et al.

[11]. Så vidt vi ved, er dette den første gang, at en sådan kombination af protein kvantificering under anvendelse iTRAQ mærkning og iterativ analyse fremgangsmåde er blevet anvendt til opdagelse af kræft biomarkører.

Resultater

Identifikation af proteiner ved anvendelse af iterativ analyse med iTRAQ

i alt 1529 proteiner er blevet identificeret af Proteinpilot® på et konfidensniveau på 95% fra de syv sæt af iTRAQ forsøg udført i denne undersøgelse. Den første kørsel af alle fraktioner identificeret i alt 1137 ikke-redundante proteiner, med det andet og tredje iterationer bidrager de resterende 392 ikke-redundante proteiner. I gennemsnit er den anden iteration tilsat 78% nye peptider til dem identificeret efter den første kørsel, mens den tredje iteration tilsat 36% flere peptider som vist i figur 1 og tabel 1. Inden for en given mængde, ca. 12% af peptiderne var fælles til to på hinanden følgende gentagelser; Der blev dog kun 3 til 6% af peptiderne identificeret i alle tre iterationer. Som forventet, disse yderligere peptider forbedret dækningen af ​​identificerede proteiner. Faktisk den anden iteration tilføjet 34% nye proteiner i gennemsnit, mens den tredje iteration tilføjede kun 14% til den kombinerede liste fra iterationer 1 og 2; derfor var der lidt incitament til at udføre yderligere iterationer. 40% af proteinerne identificeret under første kørsel blev også identificeret i de næste to iterationer (tabel 1). Af de 1529-proteinerne, 623, blev identificeret ved et enkelt peptid; 423 af som viste ≥99% fortroligt. De resterende 906 proteiner blev identificeret i gennemsnit med seks peptider per protein, overvejer kun peptider med ≥95% sikkerhedsgrænser scoringer. Af de 1529 proteiner identificeret i denne undersøgelse, 1260 proteiner (dvs. 82%) havde iTRAQ nøgletal rapporteret for EMCA vævsprøver. En komplet liste over de identificerede proteiner og deres gennemsnitlige iTRAQ nøgletal findes i tabel S1. En lagkagediagram viser fordelingen i cellulære funktioner af disse proteiner er vist i figur 2.

I gennemsnit den anden iteration tilsat 78% nye peptider til dem identificeret efter den første kørsel, mens den tredje iteration tilsat 36% flere peptider. Inden for en given sæt, omkring 12% af peptiderne var fælles for to på hinanden følgende gentagelser; blev dog kun 3 til 6% af de peptider identificeret i alle tre iterationer. Vejviser

Identifikation af differentielt udtrykte proteiner i EMCA

For bestemme differentielt udtrykte proteiner der kan tjene som potentielle molekylære mål for evaluering af diagnose og /eller prognose af EMCA, alle proteiner (n = 1529) identificeret i denne undersøgelse blev vurderet ved anvendelse af kriterierne beskrevet i Materialer Fremgangsmåder sektion. En liste med 40 proteiner, der kan tjene som potentielle biomarkører for EMCA er vist i tabel 2. Af disse 40 biomarkør kandidater, 38 blev identificeret med et minimum af to peptider. De to undtagelser (S100 calcium-bindende protein A6 og beta-2-glycoprotein 1) blev inkluderet, da de blev identificeret ved et peptid med ≥99% fortroligt, og manuel inspektion viste fremragende MS /MS spektral kvalitet (Tal S1 og S2) . Individuelle iTRAQ værdier for protein kvantificering er anført i tabel S2a; en liste over alle identificerede peptider med en Proteinpilot tillid niveau ≥95% er til rådighed i tabel S3. Tabel S4 viser de gentagelser i analysen, hvor proteiner i tabel 2 blev kvantificeret. Som EMCA og normale proliferative væv blev opnået fra forskellige individer og var derfor ikke identiske (dvs. blev analyserne ikke replikeres), den typiske begreb standardafvigelse i kvantitativ analyse kan være vildledende, da et mål for analytisk kvalitet. Vi har derfor valgt at udtrykke de fordelinger af kombineret analytisk og individuel variation på følgende måde: i vores analyser, 28% af de enkelte iTRAQ værdier afvige inden for ± 10% fra deres midler, 54% inden for ± 20%, og 88% inden for ± 50% (se tabel S2b for detaljer). Disse fordelinger er til støtte for vores hypotese, at en 50% ændring i iTRAQ nøgletal er tegn på differentieret udtryk. Faktisk vi identificeret en gruppe af 16 yderligere proteiner, som netop mistede cutoff af vores kriterier for differentieret udtryk, og som endnu kan kvalificere efter medtagelse af yderligere prøver (tabel 3).

Evaluering af diagnostisk potentiale differentielt udtrykte proteiner i EMCA

Andre parametre er relevante for diagnostiske potentialer blev også evalueret. Disse omfatter positive prædiktive værdier (PPVs) og arealer under kurven (AUC) til rådighed fra Receiver Operating egenskaber (ROC) analyse. Værdier for de enkelte biomarkør kandidater er anført i tabel 2.

Verifikation af differentiel ekspression af proteiner i EMCA væv

overekspression af udvalgte biomarkør kandidater: cathepsin B, calumenin, S100A6, lactatdehydrogenase A (IdhA), og HNRNPA1 i EMCA væv blev verificeret ved Western blot-analyser i en undergruppe af de samme vævsprøver anvendt til iTRAQ LC-MS /MS. Figur 3 viser en sammenligning af fire EMCA væv (T) med fire normale endometrier (N) for de fem biomarkør kandidater med β-actin, der tjener som en loading kontrol. Endvidere immunhistokemisk analyse i et uafhængigt sæt af vævsprøver (n = 5 hver) afslørede intens cytoplasmatisk og /eller nuklear immunfarvning af S100A6 protein i tumorceller af endometrioide EMCA vævssnit (Typiske resultater er vist i figur 4), hvorimod der ingen signifikant immunfarvning blev observeret i epiteliale celler fra normale proliferative endometrier.

Lige store mængder proteiner (50 ug /bane) blev opløst på 10% natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamid gel og derefter elektro-overført til polyvinyliden-difluorid (PVDF) membran. Efter blokering blev blots inkuberet med respektive muse monoklonalt antistof ved passende fortyndinger ved 4 ° C O /N. Membraner blev inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med sekundært antistof. Protein bands blev opdaget af forøget kemiluminescens-metoden (GE Health Care) på Kodak Hyperfilm. Western blot analyse viste overekspression af (i) S100A6, (ii) calumenin, (iii) cathepsin B, (iv) lactatdehydrogenase A (IdhA), og (v) heterogen protein A1 (HNRNPA1) i endometriecancer væv (T1, T2, T3 og T4) i sammenligning med normale endometrium (N1, N2, N3 og N4). β-actin tjente som en loading kontrol viser lige proteinmængder i hver bane.

Immunohistokemisk analyse af S100A6 protein blev udført i uafhængige paraffinindlejrede vævssnit på endometriecancer og normal endometrium (n = 5 hver) som beskrevet i Materialer og Metoder. Panel viser (a) ingen immunfarvning af S100A6 protein i normal endometrium; (B) endometriecancer viser cytoplasmatisk ekspression af S100A6 protein; og (c) negativ kontrol viser ingen udtryk for S100A6 protein.

Network Analysis

Vi udførte Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for at generere netværk viser direkte og indirekte bestemmelser /samspil mellem proteiner identificeret i denne undersøgelse. Disse netværk viser inddrager vigtige spillere, herunder TNF-alfa, NFKB, c-myc, Her2 /Neu, β-catenin, og ERK1 /2-proteiner, som regulerer inflammation og overlevelse og proliferation af tumorceller (figur 5). De fleste af de molekylære targets identificeret i denne undersøgelse er reguleret af c-myc, Her2 /neu, og TNF α, kan således tyder indgriben af ​​disse veje tilvejebringer et middel til udvikling af molekylære målrettede behandlinger for endometriecancer.

De potentielle nye molekylære targets identificeret i denne undersøgelse blev udsat for sti analyser ved hjælp Opfindsomhed Pathways Analysis (IPA) software, Version 7.5. Figuren viser direkte (fede linjer) og indirekte (stiplede linjer) regler (→) /interaktioner (-) blandt de biomarkører identificeret i denne undersøgelse og andre betydeligt associerede proteiner. Disse netværk afslører involvering af centrale proteiner, herunder TNF, NFKB, c-myc, Her2 /Neu, β-catenin, JNK- og Erk1 /2 proteiner, der regulerer inflammation, overlevelse og spredning.

Diskussion

Der har været stor nylige interesse for identifikation af potentielle kræft markører for diagnose og prognose via differential proteomisk analyse. De forskellige spørgsmål, faldgruber og succeser i disse proteomics-baserede biomarkør undersøgelser er blevet diskuteret og revideret [14] – [17]. Vores undersøgelse førte til identifikation af 40 proteiner, der viser signifikant forskellig ekspression i EMCA sammenlignet med normale proliferative væv. Disse proteiner indbefatter metaboliske enzymer [pyruvatkinase M2 (PKM2) og lactatdehydrogenase A (IdhA)]; calciumbindende proteiner (S100A6, calcyphosine og calumenin); og proteiner involveret i reguleringen af ​​inflammation, proliferation og invasion [annexin A1 (ANXA1), interleukin enhancer-bindende faktor 3 (ILF3), alfa-1-antitrypsin (AAT), makrofag capping protein (CAPG) og cathepsin B]. Adskillige rapporter har vist indflydelsen af ​​østrogenreceptoren (ER) og p53 om ekspression af disse proteiner, som berettiger verifikation af disse observationer i EMCA væv i større målestok. Blandt de proteiner, der er identificeret i denne undersøgelse, har vi tidligere rapporteret ændret udtryk for AAT, CAPG, pyruvat kinase M1 /​​M2, og creatinase kinase B. To af disse proteiner (pyruvat kinase M2 og creatinase kinase B) er medtaget her til overvejelse, som ekstra manuel undersøgelse af data viste, at mens udtrykket forholdet ændringer for disse to proteiner var lige under 50% (pyruvat kinase M1 /​​M2, 1,43, og creatinase kinase B, 0,69), de gjorde mødes de to andre kriterier (se Materialer og fremgangsmåder). Desuden en uafhængig undersøgelse ved hjælp af immunhistokemi på en væv microarray (n = 148 patienter) båret af vores gruppe demonstrerede den bemærkelsesværdige potentiale AAT og PKM2 som diagnostiske biomarkører for EMCA [18] – [20]. Det er bemærkelsesværdigt, at forøget mængde tumor PKM2 også er rapporteret i tumorceller og EDTA-plasma af patienter med kræft i nyre, lunge, bryst, cervix og mavetarmkanalen, såvel som i afføringsprøver fra patienter med kolorektal og mavekræft [21]. Således kan PKM2 virke som en generel indikator for malignitet, snarere end at være specifik for EMCA. Denne forening med tumorigenese i almindelighed er måske forståeligt i lyset af PKM2 funktion [21]. Kontakten til M2 isoform af pyruvatkinase i tumorceller er nødvendig for at inducere Warburg virkning. Forøget ekspression af PKM2 bidrager til et metabolisk miljø, der er modtagelig for celleproliferation under hypoxiske betingelser og fremmer tumorcellevækst [22], [23]. Således PKM2 virker som en metabolisk sensor, som gør det muligt tumorcellen at tilpasse dets metabolisme af variationer i tilførslen af ​​næringsstoffer. Interessant IdhA viste også overekspression i EMCA væv i denne undersøgelse, og PKM2 er kendt for fortrinsvis shuttles pyruvat til lactat dehydrogenase [24]. Tyrosinphosphorylering af lactatdehydrogenase letter proteinbinding til PKM2, hvorved kanalisere produktet af pyruvatkinase til lactat [25]. Dette hjælper med at skabe nikotinamidadenindinukleotid (NAD

+), der kræves for at opretholde høj glycolytiske flux i tumorceller. Denne metaboliske omdannelse gør glykolyse selvforsynende, så længe forhøjet glukoseoptagelse er muligt. En høj glycolytiske sats tilvejebringer syntetiske mellemprodukter til hurtigt prolifererende tumorceller, der kræves for at replikere cellebiomasse og genom ved hver celledeling [24], [26].

En anden vigtig gruppe af proteiner fundet at være dereguleret i EMCA væv omfatter fire calcium-bindende proteiner: S100A6, calcyphosine (CAPS), calumenin (CALU), og annexin A1 (tabel 2). S100A6 er overvejende en cytoplasmatisk protein, men i nærvær af Ca

2+, kan det forbinder med plasmamembranen og kernemembranen. Vores immunhistokemisk analyse viste cytoplasmatisk og /eller nuklear farvning af S100A6, overvejende tumorceller af endometrioide EMCA. Dette understøttes yderligere af tilstedeværelsen af ​​S100A6 protein i cytoplasmaet og kerner af lunge, hud og pankreatiske duktale adenocarcinomceller [27] – [29]. S100A6 spiller en vigtig rolle i cytoskelet reorganisering, invasion, overlevelse og proliferation ved at regulere funktioner af flere molekylære mål, herunder p53, β-catenin, annexiner, tropomyosin, calponin, calcyclin-bindende protein /Siah-1-interagerende protein (CacyBP /SIP ), og Hsp90 /Hsp70-organisering protein (Hop) [30] – [33]. Overekspression af S100A6 er blevet forbundet med dårlig prognose i lunge, mave og pancreascancer [27], [31], [33]. Af de fire Ca

2 + regulatoriske proteiner fundet at være differentielt udtrykt i denne undersøgelse, kun calcyphosine er tidligere blevet rapporteret at være associeret med dårlig prognose i EMCA patienter [34]. Annexin A1 (ANXA1), fundet at være overudtrykt i EMCA væv i denne undersøgelse, er et endogent antiinflammatorisk protein. Annexiner er en familie af Ca

2 + /lipid-bindende proteiner involveret i forskellige cellulære funktioner, såsom membran aggregering, inflammation, fagocytose, proliferation og apoptose [35]. Sammen disse resultater tyder på, at calcium-phosphatidylinositol og cykliske AMP kaskader kan spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellernes funktion, proliferation og differentiering i endometrie carcinogenese.

Især vores undersøgelse viser også en vigtig rolle for betændelse lovgivningsmæssige og RNA-bindende proteiner i høj kvalitet EMCA. Opregulering af den førnævnte annexin A1 sammen med nedregulering af apolipoproteiner, fibrinogens og haptoglobin antyder undertrykkelse af den inflammatoriske proces i væv, der omgiver tumoren. Interleukin enhancer-bindende faktor 3 (ILF3 eller NF90) og heterogene ribonukleoprotein A1 (hnRNP A1) er RNA-bindende proteiner, som regulerer ekspression af flere proteiner involveret i overlevelse og proliferation af tumorceller [36] – [38]. Blandt andet overekspression af serpin H1, F-actin capping proteinunderenheden beta (CAPZB), makrofag capping protein (CAPG), er villin 2 (EZR), og cathepsin B (CTSB) kendt for at fremme cellemotilitet og invasion i tumorvæv [ ,,,0],39] – [42]. Blandt de potentielle molekylære markører, der kunne hjælpe i diagnose eller prognose af EMCA, har nogle som PKM2, IdhA og cathepsin B allerede blevet udforsket for deres terapeutiske potentiale i andre kræftformer. Inhibering af PKM2 og IdhA anvendelse lille interfererende RNA (siRNA) eller inhibitorer, viste reduceret celleproliferation grund af induktion af oxidativt stress resulterer i apoptose [43] – [47]. Endvidere siRNA-medieret nedregulering af PKM2 sensibiliserede lungecancerceller til cisplatin og doxorubicin. Potentialet af disse proteiner til at tjene som mål for nye molekylære target-baserede terapier, derfor skal bestemmes inden for rammerne af endometriecancer så godt.

I denne undersøgelse drill-down tilgang forbedret antallet af proteiner identificeret, selv om en kerne af peptider blev påvist i alle kørsler af en given prøve. Disse eksempler på gentagne påvisning kan henføres til forskydninger i retentionstiden, peak hale, flere afgifter, og modifikationer (fx de-amidering og methionin oxidation). Ifølge analysen af ​​det første iTRAQ sæt, vi forbedret præcisionen af ​​fraktionen indsprøjtning og udvidet udelukkelseskriterierne vinduer for både tid og

m /z

, fra ± 5 til ± 7 min, og fra 100 mDa til 120 ppm henholdsvis at afbøde nogle af disse udfordringer. Vi valgte ikke at udelukke ioner baseret på forskelle i ladning eller ændring, da det ville have øget liste udelukkelse ud over en praktisk størrelse, og desuden vi begrundet, at nogle redundans baseret på forskelle i afgift eller modifikation kan tjene til at øge tilliden til identifikation. Således den iterative analyser vi ansat en balance mellem dybden af ​​analysen og medgørlighed. denne identifikation via flere peptider betød dog, at antallet af identificerede proteiner nok steget i et langsommere tempo end det ville have været muligt havde vi implementeret udelukkelsen af ​​samme opladningstilstand og ændringer. Interessant, det samlede antal af proteiner identificeret i denne undersøgelse var sammenlignelige med dem, der i vores tidligere undersøgelse (1529 versus 1388 proteiner henholdsvis), på trods af at arbejde her med kun halvdelen af ​​mængden af ​​udgangsmateriale (100 versus 200 pg /anvendte prøve tidligere ) [18].

det kan konkluderes, vores analyse tydeligt afslører betydningen af ​​drill-down proteomisk tilgang i kombination med iTRAQ identificere biomarkører kandidater til endometriecancer. Denne undersøgelse held afslører roman differentielt udtrykte proteiner, der kunne tjene som molekylære mål i diagnose og /eller prognose af endometrioide EMCA væv. Nogle af disse proteiner udviser potentialer som molekylære mål for terapi.

Materialer og metoder

Etik Statement

Endometriale væv blev hentet fra en in-house, dedikeret forskning endometrie væv bank som beskrevet tidligere [18]. Indsamling og brug af disse materialer blev godkendt af forskningsetik bestyrelser York University, Mount Sinai Hospital, University Health Network, og North York General Hospital. Prøverne stammede fra patienter, der undergår hysterektomier eller andre kliniske procedurer, der involverer biopsier. Alle disse prøver blev opnået efter skriftligt informeret samtykke fra alle deltagere, der er involveret i denne undersøgelse.

Prøver og reagenser

Med mindre andet er angivet, er alle reagenser var tilgængelige fra Sigma-Aldrich (St-Louis, MO ). Til denne undersøgelse endometrioide carcinoma tilfælde (type I EMCA, n = 10) og normale proliferative endometrium (n = 10) blev udvalgt. Fem af type I EMCA vævsprøver de var fra biopsier, der var blevet undersøgt i vores tidligere undersøgelse. For proteomisk analyse blev vævsprøver opnået fra spejlet ansigt af den resterende blok bruges til histopatologisk vurdering af patologen. Vævsprøver blev vasket tre gange i -1 ml phosphatbufret saltvand (PBS) med en blanding af proteaseinhibitorer (1 mM 4- (2-aminoethyl) benzensulfonylfluorid, 10 uM leupeptin, 1 ug /ml aprotinin og 1 um pepstatin) som tidligere beskrevet [18]. Det vaskede prøve blev derefter homogeniseret i 0,5 ml PBS med proteaseinhibitorer ved anvendelse af en håndholdt homogenisator, flash-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse [18]. Efter hentning fra opbevaring ved -80 ° C, blev prøver optøet, klaret ved centrifugering, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse Bradford assay (Bio-Rad, CA). For alle iTRAQ sæt blev en referenceprøve omfatter en pulje af de ti normale proliferative prøver (100 ug lysat fra hvert væv), der anvendes. For hvert eksperiment blev 100 ug af proteiner fordøjet med trypsin og mærket individuelt med den passende iTRAQ tag. Opgaverne for de tags til prøvetyper blev randomiseret til at minimere enhver potentiel skævhed i effektivitet mærkning mellem de enkelte versioner af iTRAQ tags. I alt syv iTRAQ sæt blev undersøgt, der hver omfatter tre af de i alt 20 individuelle prøver – ten EMCA og ti normale endometrier – og henvisningen pool. Mus monoklonale antistoffer mod calumenin og HNRNPA1 var til rådighed fra Abcam, cathepsin B fra Calbiochem, og S100A6 fra Santa Cruz Biotech. Kanin polyklonale lactatdehydrogenase A (IdhA) blev også opnået fra Santa Cruz Biotech.

Strong kationbytter (SCX) Separation

Hver iTRAQ sæt blev adskilt ved SCX hjælp af en HP1050 HPLC instrument (Agilent, Palo Alto, CA) med en 2,1-mm indvendig diameter x 100 mm længde PolyLC polysulfoethyl en søjle pakket med 5 um perler med 300-Å porer (The Nest Group, Southborough, MA) som beskrevet tidligere [18]. Kort fortalt blev iTRAQ sæt fortyndet med loadingpufferen (identisk med sammensætningen af ​​buffer A: 15 mM KH

2PO

4 i 25% acetonitril, pH 3,0) til et samlet volumen på 1,8 ml, og pH blev justeret til 3,0 med phosphorsyre. Opløsningen blev derefter filtreret under anvendelse af et 0,45 um sprøjte filter (Millipore, Cambridge, ON, Canada) før de anbringes på søjlen. Adskillelse blev udført under anvendelse af en lineær binær gradient over 1 time, plus 30 minutters kolonne re-ækvilibrering (tabel 4). Som beskrevet tidligere Buffer A var identisk med sammensætningen af ​​loadingpufferen; Buffer B var puffer A indeholdende 350 mM kaliumchlorid; og puffer C var Buffer A indeholdende 1 M kaliumchlorid. Fraktioner blev indsamlet hver 2 min ved anvendelse af en SF-2120 Super Fraction Collector (Advantec MFS, Dublin, CA) efter en indledende ventetid på 2 min til at rumme det tomme volumen. Dette resulterede i alt 30 SCX fraktioner pr iTRAQ sæt. Disse fraktioner blev tørret under anvendelse af Speed-Vac (Thermo Savant SC110 A, Holbrook, NY) og genopløst i et minimalt volumen af ​​5% acetonitril i 0,1% myresyre: typisk 8 pi for hver fraktion No. 6-9, 12 pi for Nej 10-13, 16 uL for No. 14-16, 20 uL for Nej 17-19, 25 uL for Nej 20-21, og 30 uL for de sidste fraktioner, No. 22-30. Større mængder i de senere fraktioner blev nødvendiggjort af behovet for at opløse de større salt pellets som følge af deres tilsvarende højere saltindhold. Fraktionerne No. 1-5 blev ikke analyseret som tidlige fraktioner meste indeholdt iTRAQ biprodukter.

omvendt fase (RP) LC-MS /MS

SCX fraktioner No. 6-30 af hver iTRAQ sæt blev analyseret ved online nano LC-MS /MS under anvendelse af LC Pakninger Ultimate instrument (Amsterdam, Holland) udstyret med en 10-pi prøve loop. Autosampleren blev anvendt i mikroliter pick-up mode. For hver prøve blev 1 pi opløsning påsat en 5-mm omvendt fase (RP) C18 forkolonne (LC Packings) ved 25 pl /min og vasket i 4 min før der tændes forkolonnen i overensstemmelse med separationskolonnen. Adskillelsen søjle anvendte var en 75-um-intern kapillarkolonne diameter x 150 mm længde (Integrafrit kapillær fra New Mål, Woburn, MA) pakket i-hus med 3,5-um C18 perler med 100-Å porer fra Kromasil (Akzo Nobel /EKA Chemicals inc, NY). Flowet, der anvendes til separation på RP kolonnen var 200 nL /min. Opløsningsmiddel A var 5% acetonitril i 0,1% myresyre; Opløsningsmiddel B var 95% acetonitril i 0,1% myresyre. Opløsningsmidlet gradient er nærmere beskrevet i tabel 5. En ny kolonne blev anvendt til hver iTRAQ sæt.

Online MS /MS blev udført på en QSTAR Pulsar hybrid kvadrupol /time-of-flight (QqTOF) tandem