PLoS ONE: Luteolin Undertrykker Cancer Cell Proliferation ved Målretning Vaccinia-relaterede kinase 1

Abstrakt

Ukontrolleret spredning, en vigtig funktion af kræftceller, ofte udløst af fejl i cellecyklus regulatorer såsom proteinkinaser. For nylig har cellecyklus-relaterede proteinkinaser blevet attraktive mål for anti-cancer terapi, fordi de spiller fundamentale roller i cellulær proliferation. Men de protein kinase målrettet medicin, der er blevet udviklet hidtil ikke vise imponerende kliniske resultater og også vise alvorlige bivirkninger; derfor er der utvivlsomt et behov for at undersøge nye lægemidler rettet mod andre proteinkinaser, der er kritiske i cellecyklusprogression. Vaccinia-relateret kinase 1 (VRK1) er en mitotisk kinase, der fungerer i cellecyklusregulering ved phosphorylering cellecyklus-relaterede substrater såsom barriere-til-autointegration faktor (BAF), histon H3, og cAMP responselementet (CRE) -bindende protein (CREB). I vores undersøgelse identificerede vi luteolin som inhibitoren af ​​VRK1 ved screening af et lille-molekyle naturlige forbindelsesbibliotek. Her har vi vurderede effekten af ​​luteolin som VRK1 målrettet inhibitor for at udvikle en effektiv anti-cancer-strategi. Vi bekræftede, at luteolin reducerer VRK1-medieret phosphorylering af cellecyklussen-relaterede substrater BAF og histon H3, og interagerer direkte med det katalytiske domæne af VRK1. Desuden luteolin regulerer cellecyklusprogression ved modulering VRK1 aktivitet, hvilket fører til undertrykkelse af cancercelleproliferation og induktion af apoptose. Derfor er vores undersøgelse, at luteolin-induceret VRK1 inhibering kan bidrage til at etablere en hidtil ukendt cellecyklus-målrettet strategi for anticancerterapi

Henvisning:. Kim YS, Kim SH, Shin J, Harikishore A, Lim JK , Jung Y, et al. (2014) Luteolin Undertrykker Cancer Cell Proliferation ved Målretning Vaccinia-relaterede kinase 1. PLoS ONE 9 (10): e109655. doi: 10,1371 /journal.pone.0109655

Redaktør: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, USA

Modtaget: April 24, 2014 Accepteret: September 2, 2014; Udgivet: 13. oktober 2014

Copyright: © 2014 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle paavirkede data er inden for papir og dens Suppoting Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Research Foundation Korea (NRF) (2013 til 056.085), den næste generation Biogreen 21 Program (nr PJ009503), Udvikling af Landdistrikterne Administration, Republikken Korea. Dette arbejde blev også støttet af Brain Sydkorea 21 program af den koreanske ministerium for uddannelse, videnskab og teknologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

tumorigenese er forbundet med en dysregulering af celledeling, som ofte udløst af fejl i reguleringen af ​​protein modulatorer, der spiller kritiske roller i cellecyklus checkpoints og progression [1]. Blandt de proteiner, der udgør cellecyklus maskiner, har nyere terapeutiske strategier forsøgt at drage fordel af at målrette adskillige cellecyklus proteinkinaser kan forbedre drug selektivitet og terapeutisk effektivitet [2], [3]. Følgelig har sådanne cellecyklus-relaterede proteinkinaser blevet attraktive mål for anti-cancer terapi, på grund af deres grundlæggende funktioner til kontrol af cellevækst. Der blev f.eks små molekyler inhibitorer af DNA beskadigelse checkpoint proteiner Chk 1 og 2 anvendes med den hensigt at forårsage cellecyklus og apoptose under interfase [4] – [6]. Desuden har nogle mitotiske inhibitorer er målrettet mod cyclin-afhængig kinase (CDK) familie, Aurora-kinaser, og Polo-lignende kinaser blevet udviklet til at fremprovokere hindret mitotisk post, mitosestandsning, og mitotiske katastrofer ved at forårsage mangler i kromosomkondensering, kromosom alignment, spindeldannelse, og spindlen samling kontrolpunkt [1] – [3]. I flere lovende hæmmere har kliniske forsøg allerede blevet udført for at udvikle en ny klasse af anticancerlægemidler. I de kliniske stadier forsøg desværre deres kliniske effektivitet viste ikke imponerende resultater, men snarere fremkaldte begrænsede responser eller endda uventede alvorlige bivirkninger [3]. Ikke desto mindre er effektiv inhibering af visse fase af cellecyklus fortsat som en værdifuld strategi til behandling af cancer, således identifikation af hidtil ukendte, cellecyklus-specifik, druggable målproteiner og udviklingen af ​​deres selektive inhibitorer, der kan have potentiale til at blive kemoterapeutiske midler er utvivlsomt påkrævet.

i den forbindelse undersøgte vi, om vaccinia-relateret kinase 1 (VRK1) kan være et passende molekylært mål i overensstemmelse med cellecyklus målretningsstrategi. VRK1, som specifikt phosphorylerer serin og threoninrester, er en mitotisk kinase, der spiller en vigtig rolle i cellecyklusprogression ved at deltage i mange forskellige celledeling processer [7], [8]. VRK1 ekspression er specifikt rigelige i stærkt proliferative celler, såsom føtale væv og tumorvæv, og viser især en tendens til at opregulere under den mitotiske fase i cellecyklussen [9], [10]. I G1 /S faser, VRK1 fremmer cyclin D1 (CCND1) ekspression at inducere G1 /S overgang ved phosphorylering cAMP responselementet (CRE) -bindende protein (CREB) og derved forbedrer bindingsaffiniteten af ​​CREB til CCND1 promotoren [11 ]. Desuden VRK1 deltager i nukleare kuvert (NE) dynamik som NE montering /demontering via fosforylering af barriere-til-autointegration faktor (BAF) under interfase og mitotisk indgang /udgang [12]. BAF er en chromatin-associeret protein fungerer som et bindeled mellem DNA og NE [13]. Den dynamiske status BAF under cellecyklusprogression er stramt reguleret af VRK1 aktivitet; BAF fosforylering af VRK1 stimulerer kromatin udgivelse fra NE, og rekrutterer NE-associerede proteiner i kerneområde under telofase [12], [14]. I den mitotiske fase, VRK1 påvirker histon modifikation af phosphorylering histon H3 [10]. Phosphorylering af histon H3 Ser10 af VRK1 og andre flere mitotiske kinaser er en velkendt histon kode overtalelse kromatin kondensering på mitotisk indgang eller G2 /M faseovergang. I cellecyklus, er VRK1-medieret histon H3 phosphorylering påvirket af andre regulatorer. Mitogenaktiveret proteinkinase phosphatase 2 (MKP2), en dual-specificitet phosphatase som inaktiverer MAP-kinaser (MAPK’er), spiller en rolle som en negativ regulator af VRK1-medieret histon H3 phosphorylering ved den mitotiske fase [15]. Under interfase, Makro histon H2A1.2 (MacroH2A1), en kerne histon variant undertrykker tilgang VRK1 til histon H3 ved binding [16].

Derudover seneste undersøgelser også har vist betydningen af ​​VRK1 i proces af celleproliferation. VRK1 har en kritisk rolle ikke kun somatisk celledeling, men også i kimcelle udvikling [17], [18]. Desuden VRK1 spiller også en rolle i vedligeholdelsen af ​​telomer ved phosphorylering hnRNP A1, som stimulerer telomerase og binder til telomer DNA-sekvens [19]. VRK1 er påkrævet for G0 exit, Golgi fragmentering, DNA beskadigelse-induceret apoptose, og stressreaktioner, som er nødvendige for at opretholde cellecyklusprogression [20] – [24]. Således overvejer cellecyklus-relaterede karakteristika VRK1, er identifikationen af ​​VRK1 inhibitor kræves for anti-behandlinger mod kræft. Selv om det er rapporteret, at nogle lægemidler til at hæmme andre proteinkinaser kunne bremse kinase aktivitet VRK1 [25], de hæmmende mekanisme og anti-cancer effekter gennem VRK1 hæmning var stadig undvigende.

I vores undersøgelse, vi screenede en lille-molekyle naturlig forbindelse bibliotek og identificerede luteolin (3 ‘, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone) som små molekyler til at inhibere VRK1 kinaseaktivitet. Luteolin er et naturligt forekommende flavonoid, der er almindeligt udbredt i planter og er kendt for at virke som en potent antioxidant [26]. I traditionelle asiatiske midler, har luteolin-rigelige urter blevet anvendt som traditionelle lægemidler til behandling af mange lidelser, såsom smertefulde tilstande, inflammatoriske sygdomme, hypertension og kræft [27]. I dag har mange linjer af beviser demonstreret talrige farmakologiske virkninger af luteolin herunder anti-cancer, anti-inflammation, og anti-allergi aktiviteter [27], [28]. Selv om det er blevet konstateret, at de anti-cancer egenskaber af luteolin er forbundet med pro-apoptotiske virkninger, anti-proliferative virkninger, og inhibering af angiogenese og metastase, de molekylære mekanismer bag dets anti-cancer aktiviteter er ikke fuldstændigt klarlagt [29] , [30].

Her har vi bekræftet, at luteolin viser signifikant reduceret phosphorylering af cellecyklussen-relaterede substrater histon H3 og BAF, og interagerer direkte med VRK1, specifikt docking på dens katalytiske domæne. Endvidere demonstrerede vi, at luteolin kunne inducere standsning af cellecyklus ved at inhibere VRK1 kinaseaktivitet, hvilket fører til undertrykkelse af cancercellevækst og apoptose. Derfor foreslår vi, at luteolin er en inhibitor af VRK1, som er en af ​​gode kandidater til behandling af kræft.

Materialer og metoder

Kemikalier og reagenser

Luteolin var analytiske kvalitet og indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Eupatilin og Wogonin blev leveret fra Dr. Baek Lab i Kyung-Hee University. Disse forbindelser blev fremstillet i DMSO (Sigma-Aldrich). [

32P-γ] ATP blev indkøbt fra Perkin Elmer /NEN (Waltham, MA, USA) og rekombinante histon H3 blev indkøbt fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Andre rekombinante proteiner såsom glutathion sulfotransferase (GST), GST-VRK1, GST-aurora kinase B (AURKB) og Hans-BAF blev udtrykt i

E.coli

(BL21) og blev oprenset ved affinitetskromatografi. Lamin B, glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) og GST-antistof blev købt hos Santa Cruz Technology (Santa Cruz, CA, USA) og histon H3 phospho-Ser10-antistof blev købt hos Abcam (Cambridge, UK), og dem mod histon H3, phospho-CREB og CREB blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). VRK1 og phospho-BAF (gave fra Robert Craigie, NIH, USA) antistof blev dannet i kaniner ved anvendelse af oprensede VRK1 proteiner. Hoechst 33342 blev købt fra Sigma-Aldrich. CNBr-Sepharose 4B blev indkøbt fra Sigma-Aldrich.

Cellekultur og transfektion

BEAS-2B-celler blev opnået fra ATCC (Manassas, VA). Tidligere beskrevne HeLa [31], HEK293A [16], SH-SY5Y [32], U2OS [32], og A549 [31] celler blev anvendt i denne undersøgelse. Den humane cervikale adenocarcinom cellelinie HeLa, blev humane embryoniske nyrecellelinie HEK293A, den humane bronchiale epitelcellelinie BEAS-2B og den humane neuroblastom-cellelinje SH-SY5Y dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Den humane osteosarcomcellelinie U2OS og den humane lunge adenocarcinom cellelinie A549 blev dyrket i RPMI1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin. Disse cellelinier blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2. Transient transfektion af HeLa og U2OS celler blev udført ved anvendelse af en MP-100 mikroperforator (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens protokol.

Protein kinase assay

En in vitro kinase assay blev udført i overensstemmelse med de tidligere beskrevne fremgangsmåder [31]. Kort fortalt, blev et in vitro kinaseassay udført i kinasepuffer indeholdende GST-VRK1, GST-AURKB, His-BAF, histon H3, og [32P-γ] ATP. Kinaseanalysen Blandingerne blev inkuberet ved 30 ° C i 30 minutter og radioaktivt inkorporering blev detekteret ved autoradiografi. De mængder proteiner, der anvendes i kinaseassays blev målt ved anvendelse af sølvnitrat (Sigma-Aldrich) eller coomassie blå (Sigma-Aldrich).

Cellelevedygtighed assay

Celler blev behandlet i 24 timer eller 48 timer med flavonoider (luteolin, eupatilin, og wogonin) eller med dimethylsulfoxid (DMSO) som kontrol. Cellelevedygtighed blev vurderet ved anvendelse af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetarazolium (MTT) assay ifølge producentens protokol. Den halvmaksimal inhiberende koncentration (IC50) blev bestemt ved anvendelse af Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, USA).

forberedelse Luteolin-Sepharose 4B og in vitro pull-down assay

Sepharose 4B bead pulver blev suspenderet i aktivering opløsning til koblingsreaktionen. Aktiveret Sepharose 4B-perler blev inkuberet i koblingen opløsning med luteolin på et roterende rysteapparat ved 4 ° C natten over. Til in vitro pull down assay blev GST-VRK1 og GST inkuberet med luteolin-Sepharose 4B-perler i reaktionsopløsningen i 12 timer. Proteiner bundet til perlerne blev analyseret ved immunblotting. Vi gennemførte de detaljerede procedurer, der tidligere blev beskrevet [33].

Surface (SPR) assay

De kinetiske parametre for interaktionen mellem VRK1 og luteolin blev evalueret af en SPR under anvendelse det automatiske SR7500DC systemet (Reichert Technologies, Depew, NY, USA). Til fremstilling af VRK1-konjugeret guld chip blev VRK1 immobiliseret på en CMDh chip (# 13.206.066) og derefter luteolin, eupatilin og wogonin blev injiceret på overfladen af ​​chippen i de angivne koncentrationer, fortyndet i 10 mM phosphat-bufret saltvand (PBS ) indeholdende 1% DMSO som en løbebuffer. Analyse af de indsamlede data blev udført ved scrubber2 software (BioNavis, Tampere, Pirkanmaa, Finland).

ligand docking assay

En homologi udviklet fra X-ray struktur VRK1 var ansat til vurdere den molekylære interaktion og den bindende tilstand af nyligt identificerede VRK1 leads. I den foreliggende undersøgelse, den model var energi-minimeret til 5.000 trin af charmen force-felt og konjugat gradient metode i Discovery Studio 3.0 suite [34]. De 3-D koordinater for luteolin blev fremstillet ved anvendelse Forbered ligand modul og energi-minimeret til 2.000 trin ved hjælp af Smart Minimizer algoritme i Discovery Studio 3.0 suite. Den molekylære docking program GOLD 5,0 blev anvendt til at vurdere bindende tilstand af VRK1 kundeemner. Vores tidligere NMR-bindingsundersøgelser har identificeret de centrale rester, der er forstyrret ved ligandbinding; disse blev anvendt til at definere det aktive sted [34]. Standardindstillinger og scoring funktioner, GOLD PLP og GOLD scoring funktion, var ansat til at score docking interaktioner og deres sandsynlige docking form for binding.

flowcytometriassayet

Til cellecyklus analyse, HeLa-celler blev transficeret med GFP, GFP-VRK1, GFP-BAF og derefter behandlet med DMSO (vehikel) og 10 uM luteolin. Bagefter blev cellerne fikseret med 70% ethanol indeholdende 0,4% Tween-20 og farvet med propidiumiodid i PBS. cellecyklus og cellulær DNA-indhold de blev analyseret ved flowcytometri på en FACSCalibur flowcytometer (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). Dataopsamling blev udført med Cell Quest-programmet (BD Biosciences). For apoptose analyse blev HeLa-celler behandlet med luteolin i en koncentrationsafhængig måde og dobbelt farvet med propodium iodid og Annexin-V allophycocyanin. Celler blev analyseret ved flowcytometri.

Immunfluorescensfarvning

HeLa-celler blev transficeret med rødt fluorescerende protein (RFP), RFP-VRK1, GFP, og GFP-BAF hjælp mikroperforering, og derefter behandlet med 10 uM luteolin i 24 timer. Efterfølgende blev cellerne fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 minutter og blokeret med 10% FBS i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Celler blev farvet med Hoechst 33342 i PBS i 20 minutter ved stuetemperatur og ses med en konfokal laser-scanning-mikroskopi (FluoView FV1000, Olympus, Tokyo, Japan). HeLa-celler blev behandlet med eller uden luteolin (10 uM) i 24 timer. Efterfølgende gennemførte vi detaljerede procedurer, der blev beskrevet, og derefter cellerne blev farvet med lamin B antistof og ses med Zeiss fluorescensmikroskop (Carl Zeiss Ltd., Jena, Tyskland) eller konfokal laser-scanning mikroskopi.

kvantitativ revers transskription (RT) -PCR

Totalt RNA fra HeLa-celler blev fremstillet under anvendelse af TRI middel (Molecular Research center, Cincinnati, OH, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner, og derefter revers transskriberet til generering komplementært DNA. Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green PCR-blandingen (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) og et realtids detektorsystemet (Applied Biosystems, Foster City, CA USA). GAPDH niveau blev brugt til at normalisere transkriptniveauer.

Resultater

Luteolin er en potent hæmmer af VRK1 kinase aktivitet

For at undersøge, om luteolin effektivt kunne undertrykke den enzymatiske aktivitet af VRK1, vi udførte en

in vitro

kinase assay og sammenlignet de inhiberende virkninger af luteolin med de andre flavonoid-lignende forbindelser. Luteolin inhiberede signifikant VRK1-medieret phosphorylering af BAF og histon H3 på en dosis-afhængig måde. Desuden blev auto-phosphorylering aktivitet af VRK1 svækket ved behandling med luteolin på en dosis-afhængig måde (Fig. 1A og B). Selvom eupatilin og wogonin, flavonoid-lignende kemiske forbindelser, der viser strukturel lighed med luteolin (fig. 1C), svagt inhiberer VRK1 kinaseaktivitet (fig. 1 D og E), luteolin viste de mest fremtrædende inhibitoriske virkninger på BAF phosphorylering og VRK1 auto-phosphorylering , hvilket tyder på specificitet luteolin. Specificiteten af ​​luteolin for VRK1 blev yderligere bekræftet af sine normaliserede hæmmende effekt på BAF phosphorylering og VRK1 auto-fosforylering (fig. 1 F og G). Disse resultater indikerer, at luteolin er en potent inhibitor af VRK1 kinaseaktivitet, som er nødvendig for modulering af cellecyklusprogression.

(A) og (B),

in vitro Salg kinase aktivitetsmålinger for VRK1 med BAF (A) eller VRK1 med histon H3 (B) blev udført ved stigende koncentrationer af luteolin (0,0, 1,0, 10, 50, 100, og 250 uM), og derefter VRK1 og substratproteiner blev farvet med sølvnitrat. (C), kemiske strukturer og molekylvægte af luteolin, eupatilin, og wogonin. (D) og (E),

in vitro

kinaseassay for VRK1 med BAF blev udført ved stigende koncentrationer (0,0, 1,0, 10, 50, 100 og 250 uM) af eupatilin (D) eller wogonin ( E), og derefter VRK1 og BAF proteiner blev farvet med sølvnitrat. (F) og (G), Kvantificering af VRK1 auto-phosphorylering (F) eller BAF phosphorylering (G) beskrevet i (B), (D) og (E). Data i (F) og (G) repræsenterer hjælp af tre uafhængige forsøg ± SEMs.

Luteolin direkte interagerer med VRK1

Fordi luteolin undertrykt virkningen af ​​VRK1 over for sine substrater, vi hypotese, at luteolin kan hæmme kinase aktivitet gennem direkte binding til VRK1. For at undersøge interaktionen mellem luteolin og VRK1 gennemførte vi en pull-down assay under anvendelse af luteolin-konjugeret sepharoseperler. GST kunne ikke binde til enten luteolin-konjugeret sepharoseperler eller kontrol perler. Imidlertid GST-VRK1 held bundet til luteolin-konjugeret sepharose perler, men bandt ikke til at styre perler, der ikke var konjugeret til luteolin (Fig. 2A). Dernæst udføres en pull-down assay med SH-SY5Y cellelysater at inspicere, om luteolin binder til endogent VRK1 foruden rekombinant VRK1 (fig. 2B). Endogen VRK1 kunne også binde til luteolin-konjugeret sepharoseperler. Disse resultater tyder på, at luteolin direkte interagerer med VRK1

in vitro

.

(A), Pull-down assay under anvendelse luteolin-konjugeret sepharose 4B-perler eller kontrol sepharose 4B perler med rekombinant VRK1 protein. Renset GST og GST-VRK1 proteiner inkuberes med angivne perler, og derefter trække ned assay blev udført. Hver proteiner blev påvist ved immunoblotting med GST-antistof. (B), Pull-down assay under anvendelse luteolin konjugeret sepharose 4B-perler med SH-SY5Y cellelysat. Cellelysat inkuberes med angivne perler, og træk-ned blev udført. Proteinerne blev detekteret ved immunoblotting med VRK1 antistof. (C), SPR detektion til vekselvirkningen mellem luteolin med VRK1. Dataene blev opnået ved kinetisk titrering fremgangsmåde med sekventielt injektion af analytter uden regenerering trin. Data for eupatilin og wogonin blev opnået ved klassiske metoder.

Direkte samspil mellem luteolin og VRK1 blev yderligere analyseret ved hjælp af overflade (SPR) til at overvåge de bindende kinetik. Rekombinant VRK1 proteiner blev covalent immobiliseret på en sensorchip som en ligand; Efterfølgende blev luteolin, eupatilin og wogonin tilsat i en koncentrationsafhængig måde som en analyt (fig. 2C). Kinetiske parametre af interaktionen mellem VRK1-overtrukne sensor chip og disse analytter blev evalueret ved software og vises i tabel 1. Beregnede konstanter for disse analytter i retning VRK1 udstilling, luteolin har mest stærk bindingsaffinitet blandt dem. Tilsammen indikerer disse resultater, at luteolin direkte bindes til VRK1 med høj affinitet.

Den hæmmende effekt af luteolin medieres af sin direkte binding til det katalytiske domæne af VRK1

Til bestemme bindende region VRK1 for luteolin blev samspillet mellem luteolin og VRK1 vurderet af NMR titrering eksperimenter og

i silico

modellering. ramt af interaktion med luteolin aminosyrerester viste dramatisk forøget kemiske skift forstyrrelser (fig. 3A). Disse rester er repræsenteret i spektret af kemiske skift forstyrrelser og tildeles også på det molekylære kort over VRK1 (Fig 3B), hvilket antyder, at disse rester hovedsageligt er placeret i nærheden af ​​katalytiske domæne, som er involveret i ATP-binding [34].

(A), blev udført NMR titreringsforsøg. Spektrum af kemiske skift forstyrrelser versus aminosyrerester af den VRK1 proteinet efter binding af luteolin. (B), Kortlægning af kemiske skift forstyrrelser på VRK1 proteinet. De fleste af de forstyrrede rester (vist i rødt) er placeret tæt på det katalytiske domæne af VRK1. (C),

in silico

modellering af bindingen tilstanden af ​​luteolin til VRK1 proteinet. Luteolin forventes at passe i nærheden af ​​G-loop, katalytisk site, og α-C lap.

I

i silico

modellering af bindende form for luteolin mod VRK1 , luteolin forudsiges at passe i nærheden af ​​G-bue, katalytiske sted, og α-C lap (fig. 3C). De 2, 3-dihydroxyl dele med 2-phenylgruppen på chromen stillads interagere med E83 rest af α-C lap. Endvidere 2-hydroxylgruppen interagerer også med D197 rest af den katalytiske loop. Tilsvarende 4-ketogruppen på chromen stillads interagerer med S181 via en hydrogen-binding interaktion. Den 7-hydroxyldel på chromen stillads også gør brint-bonding interaktioner med I43 og Q45 rester fra G-loop. Bortset fra disse hydrogenbindende interaktioner, det chromen stillads har også stærke stacking hydrofobe interaktioner med F48 rest af G-loop og de hydrofobe rester omgiver det aktive sted (ikke vist). Luteolin har de fleste af sine vigtigste interaktioner med G-loop og katalytiske site rester, som fast stabiliserer luteolin molekylet i det aktive site og hæmmer dens kinase aktivitet.

luteolin inducerer cellecyklusstop via hæmning af BAF fosforylering ved VRK1

Luteolin er påvist tidligere for at inducere standsning af cellecyklus ved G1 /S og G2 /M faseovergange [35] – [39]. Men den molekylære mekanisme af standsning af cellecyklus ved luteolin er ukendt, bortset fra den mulighed, at Aurora B kinase kan være en molekylært mål af luteolin at regulere cellecyklusprogression, baseret på beviser på, at Aurora B inhiberes af luteolin og spiller en rolle som en central mediator af mitotisk progression [40]. VRK1 er en anden mitotisk kinase der har været kendt til at udføre koordinerende roller i cellecyklusprogression ved phosphorylering af adskillige cellecyklus-relaterede substrater såsom BAF, histon H3, og CREB [10] – [12]. Vi evaluerede således, om luteolin inducerer cellecyklusstop ved at hæmme VRK1. PI-farvede celler behandlet med DMSO eller luteolin blev analyseret ved flowcytometri for at vurdere cellecyklussen. Ved behandling med luteolin blev populationen i G1-fasen signifikant forøget sammenlignet med den i DMSO-behandlede celler (fig. 4A, venstre panel). I modsætning hertil øgede G1-fase population forsvandt ved overekspression af GFP-mærkede VRK1 (Fig 4A, højre panel), hvilket indikerer, at luteolin forårsager standsning i de tidlige stadier af cellecyklus ved inhibering af VRK1.

( A), blev Cell cyklus analyse foretaget af flowcytometri. HeLa-celler transficeret med GFP eller GFP-VRK1 blev behandlet med luteolin i 24 timer, og 10.000 celler blev gated for analyse. Kvantitative data er under histogrammet plots. (B) og (C), at HeLa-celler behandlet med vehikel eller luteolin blev farvet med lamin B-antistof visualisere nuklear kappe og med Hoechst 33342 til visualiseret DNA. Alexa 488 farvestof-konjugeret antistof blev anvendt som sekundært antistof. Objektglassene blev visualiseret ved fluorescensmikroskopi (B), eller konfokal laser scanning mikroskopi (C). (D), fluorescerende farvning af VRK1, BAF, og DNA til analyse af phosphoryleringen-medierede re-lokalisering af BAF. Celler cotransficeret med GFP eller GFP-BAF med RFP eller RFP-VRK1 blev behandlet med DMSO eller 10 uM luteolin i 24 timer.

Som nævnt ovenfor, VRK1 deltager i phosphorylering-medieret re- lokalisering af BAF til cytoplasmaet, chromatinkondensering via histon H3 phosphorylering, og CCND1 ekspression ved CREB phosphorylering at lette cellecyklusprogression [10] – [12]. For yderligere at forklare mekanismen for cellecyklus arrest af luteolin-induceret interferens med VRK1 aktivitet, vi vurderet om luteolin forstyrrer disse processer. Fordi det er blevet påvist, at VRK1 forøger ekspressionen af ​​CCND1, som er korreleret med G1 /S progression, gennem øget aktivitet af CRE element i CCND1 promotoren ved phosphoryleret CREB binding, vi spekuleret på, at CREB phosphorylering og mRNA-niveauet af CCND1 kan blive påvirket af luteolin behandling. Der var imidlertid ingen signifikante forskelle i CREB phosphorylering og mRNA-niveauet af CCND1 mellem DMSO og luteolin behandling (fig. S1), hvilket antyder, at luteolin-induceret G1 /S standsning kan have været en følge af fejl i andre processer snarere end undertrykkelse af CREB fosforylering.

Vi næste testet mulig inddragelse af BAF i G1 /S anholdelse forårsaget af luteolin. I

Drosophila

C. elegans

er det velkendt, at BAF har grundlæggende roller i organiseringen af ​​nukleare struktur og cellecyklusprogression [13], [41]. Derudover kernelokalisering af BAF påvirker cellecyklusprogression i humane celler; VRK1, den eneste identificerede opstrømskinase af BAF, kan ændre BAF lokalisering af fosforylering at inducere frigivelse af BAF fra både DNA- og LEM-domæne proteiner såsom Lap2, emerin, og MAN1 [12], [14], [31], [42]. VRK1-medieret BAF re-lokalisering er afgørende proces for DNA frigivelse i løbet af G1 /S transition. For at afsløre eventuelle forstyrrelser forårsaget af luteolin med nukleare kuvert dynamik i cellecyklus progression, vi farvede det nukleare kuvert med den nukleare lamin B antistof. Lamin B er adskilt fra chromatin i mitose, men tab af VRK1 eller ekspression af BAF mutant forstyrrer chromatin adskillelse fra NE [12], [42], [43]. Vi observerede, om nuklear lamin B ikke blev dispergeret ved behandling med luteolin. Nuclear lamin B blev frigivet i cytoplasmaet ved sen anafase som vist i vehikelbehandlede celler, mens lamin B sidder fast i kromosomer på samme fase som vist i luteolin-behandlede celler (fig. 4B), hvilket antyder, at luteolin-induceret VRK1 hæmning forstyrrer VRK1-medieret BAF phosphorylering.

Derudover har vi yderligere fundet, at luteolin forårsagede unormal nuklear kappe morfologi såsom invagination og bleb (fig. 4C), hvilket er et fænomen, der skal induceres ved udtømning af VRK1 [44] . Således foreslår vi, at luteolin-medieret dæmpning af BAF fosforylering kan give anledning til VRK1 udtynding-induceret unormale nukleare morfologier. For at bekræfte, at luteolin forstyrrer VRK1-medieret BAF fosforylering, vi observerede phospho-BAF niveau ved hjælp af immunoblotting. Phospho-BAF-niveau blev reduceret i 10 uM luteolin-behandlede cellelysat (fig. S2), hvilket indikerer, at VRK1 katalytiske aktivitet reduceres med luteolin

in vivo

.

En tidligere undersøgelse viste, at ektopisk ekspression af VRK1 resultater i BAF re-lokalisering til cytoplasmaet [12], [31]. Således har vi yderligere undersøgt, om fænomenet BAF re-lokalisering er påvirket af luteolin-medieret hæmning af VRK1. Når både RFP-VRK1 og GFP-BAF blev indført sammen, BAF syntes at være dispergeret gennem cellen, som er blevet rapporteret tidligere [31]. Vi har imidlertid bekræftet, at dette fænomen blev afbrudt ved behandling med luteolin (fig. 4D). Lokaliseringen af ​​GFP-BAF var begrænset til det nukleoplasma trods VRK1 overekspression, hvilket antyder, at luteolin behandling reduceres effektivt BAF phosphorylering ved at inhibere VRK1, efterfulgt af standsning af cellecyklus. For at undersøge rollen af ​​BAF under cellecyklussen, analyserede vi DNA indhold efter luteolin behandling. Ektopisk udtrykte BAF påvirker ikke cellecyklusprogression (fig. S3A). Ved luteolin administration, ektopisk udtrykte BAF kunne ikke redde luteolin-induceret G1 akkumulation (fig. S3B), tyder på, at luteolin-induceret G1 anholdelse er ikke medført af BAF hæmning, men det ved hæmning af VRK1-medieret BAF phosphorylering.

luteolin inducerer reduceret cellelevedygtighed og efterfølgende apoptose

Når den inhiberende virkning af luteolin medieret ved binding til det katalytiske domæne af VRK1 blev bekræftet, vi evaluerede dets antitumorvirkninger på tumorcelleproliferation og overlevelse. Virkningerne af luteolin på cellelevedygtigheden blev målt ved MTT-assayet ved forskellige koncentrationer. Vi observerede, luteolin behandlingen reducerede væksten af ​​tumorigene cellelinjer HeLa og U2OS sammenlignet med de ikke-tumorigene cellelinjer BEAS-2B og HEK293A (fig. 5A). IC 50 værdier i HeLa og U2OS celler bestemtes

som 15,41 uM og 36,35 uM, mens tallene i BEAS-2B og HEK293A celler blev forøget adskillige gange sammenlignet med tumorigene celler (74,41 um og 263.3 uM) . Dette resultat viser, at den inhibitoriske virkning af luteolin på celleproliferation er mere udtalt i tumorigene celler end ikke-tumorigene celler, selvom VRK1 proteinniveauet i cellelinier ikke er korreleret med tumorigenicitet (Fig. S4). Desuden luteolin hæmmer cellernes levedygtighed af HeLa-celler i en tidsafhængig måde (fig. 5B).

(A), Virkningerne af luteolin på celle levedygtighed tumorigen (HeLa og U2OS) og ikke-tumorigen (BEAS-2B og HEK293A) cellelinier.