PLoS ONE: En Gene Expression og Pre-mRNA splejsning Signature der markerer Adenom-Adenocarcinom Progression i kolorektal cancer

Abstrakte

Det er almindeligt accepteret, at de fleste tarmkræft (CRC’er) skyldes kolorektale adenomer (kreditvurderingsbureauer), men transkriptom data karakteriserer progression fra kolorektal normal slimhinde til adenom, og derefter til adenocarcinom er knappe. Disse overgangsmetaller trin blev undersøgt ved anvendelse af mikroarrays, både på niveauet af genekspression og alternativ præ-mRNA-splejsning. Mange gener og exons var unormalt udtrykt i kreditvurderingsbureauer, endnu mere end i CRCs, sammenlignet med normale slimhinder. Kendte biologiske veje involveret i CRC blev ændret i CRA, men flere nye berigede veje blev også anerkendt, såsom komplement og koagulationskaskader. Vi identificerede også fire tværsektorielle transkriptionelle signaturer, der kunne skelne kreditvurderingsbureauerne fra normal slimhinder eller CRC’er, herunder en underskrift af 40 gener forskelligt liberaliseret i både CRA og CRC prøver. Et flertal af disse gener var blevet beskrevet i forskellige cancere, herunder

FBLN1

eller

INHBA

, men kun få i CRC. Flere af disse ændringer blev også observeret på proteinniveau. Desuden 20% af disse gener (

dvs CFH

,

CRYAB

,

DPT

,

FBLN1

,

ITIH5

,

NR3C2

,

SLIT3

og

TIMP1

) viste ændrede præ-mRNA splejsning i kreditvurderingsbureauer. Som en global variation forekommer da CRA scenen, og vedligeholdes i CRC kan udtryk og splejsning ændringer i denne 40-gen sæt markere risikoen for kræft forekomst fra analyse af CRA biopsier

Henvisning:. Pesson M, Volant A, Uguen A, Trillet K, De La Grange P, Aubry M, et al. (2014) En genekspression og Pre-mRNA splejsning Signature der markerer Adenom-Adenocarcinom Progression i kolorektal cancer. PLoS ONE 9 (2): e87761. doi: 10,1371 /journal.pone.0087761

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: September 24, 2013; Accepteret: December 30, 2013; Publiceret: 6 feb 2014

Copyright: © 2014 Pesson et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansieret af Inserm, Brest Universitet, Brest Universitetshospital Cancéropole Grand Ouest, Ligue contre le Cancer, OSEO – BioIntelligence Program, ARC, og region Bretagne. MP var modtager af et stipendium fra Région Bretagne. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest udbredte cancerformer i de udviklede lande, og er en væsentlig førende årsag til kræft dødelighed på verdensplan. Den mest almindelige type af CRC er adenocarcinom ( 95%), hvilket er en invasiv neoplasme af kirtelepitel i colon eller rectum. Det er accepteret, at adenokarcinomer sandsynligvis kan opstå fra kolorektale adenomer (kreditvurderingsbureauer), som udledes fra bestemte fænotypiske funktioner, såsom størrelse og histologi.

tyktarms læsioner klassificeres ved endoskopi som ikke-polypoid (flad) og polypoid, som er adskilt i rørformet, tubulovillous eller villøs, med forskellige kvaliteter af dysplasi. Kreditvurderingsbureauerne omtales ofte som adenomatøse polypper, som repræsenterer de læsioner hyppigst associeret med neoplastisk resultat, og det blev vist, at deres fjernelse var knyttet til et fald i forekomsten af ​​CRC [1]. Mens rørformede adenomer er den mest almindelige, villøse adenomer er de mindst hyppige, men de kan forvandle sig til kræft med høj [2] frekvens. Desuden patienter med tidligere flere polypper havde adenomer med avancerede patologiske funktioner [3].

Flere driver mutationer er blevet identificeret under progression fra CRA til CRC [4], sammen med andre molekylære begivenheder, såsom microRNA modulation [5] eller præ-mRNA-splejsning ændringer [6]. Desuden er der rapporteret adskillige genekspressionsprofiler i CRC [7], [8]. Nogle undersøgelser adspurgte også genekspression i CRA, og analyserede afstamning med CRC [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ikke desto mindre blev de fleste analyser udføres fra et begrænset antal CRA prøver. Desuden har kun få undersøgelser set på genom-dækkende alternative præ-mRNA splejsning profiler af CRA prøver [15] og deres sammenhæng med CRC, selvom alternativ splejsning sker for en anslået 90% af gener i det menneskelige genom [16] .den Formålet med denne undersøgelse var at analysere, med mikroarrays, genekspression og alternativ splejsning i kreditvurderingsbureauer, i sammenligning med normal slimhinde, men også med CRCs. Vi rapporterer her et omfattende billede af de ændringer, der fandt sted i kreditvurderingsbureauer, hvoraf nogle var specifikke for kreditvurderingsbureauer, mens andre blev delt i CRCs. Vigtigere er det, vi identificeret en 40-gen sæt (32 down- og 8 up-regulerede gener), fra en intersektionel analyse af side-by-side sammenligninger, overvejer normale slimhinder, kreditvurderingsbureauerne og CRC’er, der kunne markere de vigtigste lovgivningsmæssige begivenheder karakteriserer trinvis progression i tyktarmskræft.

Materialer og metoder

vævsprøve Processing

En skriftlig informeret samtykkeerklæring blev udarbejdet sammen med den etiske komité i Brest Universitetshospital (ledes af Pr . JM Boles). Patienterne underskrevet skema, som blev returneret til Anatomi og Patologi afdeling af Brest Universitetshospital. Derfor blev denne undersøgelse er godkendt af den etiske komité af Brest Universitetshospital. Colon eller rectum biopsiprøver blev opnået efter kirurgisk fjernelse. Prøverne blev derefter behandlet anonymt. Vævet fragmenter stammer fra biopsier blev opbevaret i RNAlater (Ambion, Frankrig): 55 kreditvurderingsbureauer, 25 CRC’er og 27 kolorektal normale slimhinder (NOR; parret med kreditvurderingsbureauer eller CRC’er) blev indsamlet mellem 2006 og 2012, de fleste fra 2009. Fra CRA eller CRC biopsier, blev en overflade fragment opsamlet fra tumoren region, der omfatter i gennemsnit 90% tumorceller, 5% lymfocytter og 5% stromaceller. Disse procentsatser var meget homogene mellem uafhængige prøver. Tre undergrupper (A1, A2 og A3) af kreditvurderingsbureauer kunne skelnes efter histologiske data. Detaljerede patientinformation fremgår af tabel 1 og tabel S1. DNA og totalt RNA blev ekstraheret med AllPrep DNA /RNA Mini kit (Qiagen, Courtaboeuf, Frankrig) den homogeniserede vævsprøver (20 mg), ifølge producentens anvisninger. RNA renhed og integritet blev bestemt ved at måle den optiske densitet ratio (A260 /A280) og RNA integritet nummer (RIN) blev opnået ved anvendelse af RNA 6000 Nano LabChip (Agilent, Massy, ​​Frankrig) og 2100 Bioanalyzer (Agilent). Kun RNA-prøver med et 28S /18S forholdet 1,0 og RIN ≥7.0 blev brugt til microarray analyser

Hele-Genome Microarray

En analyse af 55 RNA-prøver stammer fra kolorektal. væv, der består af tre prøver grupper (NOR, CRA og CRC) med varierende antal biologiske replikater, blev udført på 44k hele humane genom microarrays (Agilent), der indeholder 41,093 prober, der dækker hele området af humane transkripter. Dobbelt-cDNA blev syntetiseret fra 500 ng af total RNA ved hjælp af Quick Amp Mærkning kit, One-farve, som anvist af fabrikanten (Agilent). Mærkning med cyanine3-CTP, fragmentering af cRNA, hybridisering og vask blev udført ifølge producentens instruktioner (Agilent). De mikroarrays blev scannet, og data blev ekstraheret med Agilent Feature Extraction Software.

Gene Expression Analysis

Rå genekspression data blev importeret til GeneSpring GX 11.0.2 software program (Agilent). Side-by-side sammenligninger blev udført for genekspression ændringer: CRC

vs

parret NOR, CRA

vs

NOR, og CRC

vs

CRA…. Gener med manglende værdier i mere end 25% af prøverne blev udelukket fra analysen. Disse data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO serien tiltrædelse numre GSE50114, GSE50115 og GSE50117. En 2-fold cut-off forskel blev anvendt til at vælge op- og ned-regulerede gener (P-værdi ≤0.01 ved

t

-test med Benjamini-Hochberg falsk opdagelse sats, FDR). Hierarkisk klyngedannelse af udtrykket data blev udført ved hjælp af euklidiske afstand med gennemsnitlig kobling.

Gene Set Berigelse Analyse

offentligt tilgængelige software, Database til anmærkning, Visualisering og integreret Discovery [17], blev anvendt at analysere gensæt berigelse med kolorektale læsioner. En 2-fold cut-off forskel blev anvendt til at vælge listen over deregulerede gener (P-værdi ≤0.01 af

t

-test med FDR). Kun veje fra Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) blive beskrevet [18].

Alternative splejsning Analyse

En samlet RNA, analyseret i to eksemplarer fra 3 kolorektal normale slimhinder og 24 CRA RNA-prøver blev analyseret på menneskelige Exon 1.0 ST arrays (Affymetrix, Paris, Frankrig), der gjorde det muligt analyse af både genekspression og alternativ splejsning. Microarray hybridisering blev udført ved Curie Institute facilitet (Paris, Frankrig). De rå data blev analyseret ved GenoSplice teknologi. Disse data er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE50592. En 1,5-fold cut-off forskel blev anvendt til at vælge den op- og ned-regulerede gener og exons (P-værdi ≤ 0,05).

Real-Time Polymerase Chain Reaction Validering

Som en validering trin af microarray resultater blev kvantitativ RT-PCR udført på tre grupper (NOR, CRA og CRC) på mindst 8 prøver, herunder nogle af prøverne hybridiseret på mikroarrays, eller på en uafhængig sæt af 14 kreditvurderingsbureauer og 8 parrede tumor -Normal CRC prøver. Total RNA (200 ng) blev anvendt til første streng cDNA syntese med High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Kvantitativ RT-PCR blev udført ved anvendelse af Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) ifølge producentens instruktioner med et ABI 7000 eller 7300 real-time PCR-system (Applied Biosystems). Alle bestemmelser blev udført i to eksemplarer og normaliseret mod

beta

-2-mikroglobulin som en intern kontrol-gen. Resultaterne blev udtrykt som den relative genekspression ved anvendelse af ΔΔCt metoden [19]. Alle de testede gener blev udvalgt baseret på mikroarrayet analyser med henblik på at validere biologisk vej berigelse og et gen signatur i kreditvurderingsbureauer og CRCs. Primersekvenserne og reaktionsbetingelser vil blive ydet efter anmodning. Derudover blev en PCR-array setup (Qiagen) anvendt til at analysere, i NOR og CRC prøver, ekspressionen af ​​gener med primerne stede blandt PCR Array flerbrøndsplader (apoptose, Cancer Pathway Finder, lægemiddelmetabolisme, lipoprotein signal- og cholesterolmetabolisme,

Wnt

signalvej).

Resultater

Sammenligning af tyk- og adenom Morfologiske undergrupper

Flere mutationsmønstre vartegn er blevet beskrevet i progression til kolorektal cancer, såsom som

KRAS

,

BRAF

PI3K

mutationer [4], [20], og blev analyseret i vores prøver (Støtte Information). Desuden blev mikrosatellit ustabilitet status (Støtte Information) bestemt i 12 CRA prøver, men alle var negative. Wien klassifikation lov til at gruppere adenomer i to klasser: en mindre gruppe af lavere kvalitet (3) med 11 (22%) prøver og en stor gruppe af 40 (78%) prøver af højere lønklasse ( 3) (tabel S1) . Denne klassificering matchede ikke med rørformede /villøse /tubulovillous læsion typer, da kreditvurderingsbureauerne med både lav kvalitet og høj kvalitet dysplasi jævnt fordelte i tubullovillous og rørformede grupper (kun en CRA var fra villøs type). Denne adskillelse i rørformede, villøs eller tubulovillous blev derfor ikke vedtaget. Vi besluttede at stole på en præcis morfologi analyse og anvendt en anatomisk gruppering, som førte til den sondring af tre morfologiske undergrupper: adenomer med områder af mikro-invasiv adenokarcinomer (A1; 10 prøver), degenererede adenomer,

dvs.

. adenomer med områder af

in situ

(intra-slimhinde) adenokarcinomer (A2; 17 prøver), og adenomer med områder af dysplasi (A3; 24 prøver). For at bestemme, om kreditvurderingsbureauer også kunne skelnes fra andre molekylære midler, blev en envejs ANOVA udført for at sammenligne CRA undergrupper til CRC og NOR grupper, med “vævstype” som ANOVA faktor (data ikke vist). Analysen viste, at CRA undergrupperne var meget tæt med hinanden. Der var ingen forskel mellem undergrupper A2 og A3, og blev fundet det maksimale antal deregulerede sonder for undergruppen A1

vs

. undergruppe A2 sammenligning (49 sonder, svarende til 0,12% af det samlede antal sonder, P-værdi ≤0.01). Desuden mens sammenligninger mellem CRA undergrupper og normale slimhinder viste det største antal markante sonder (op til 4.382 sonder i undergruppe A2

vs

. NOR), er sammenligninger mellem CRA undergrupper og CRC’er viste, den mindste (op til 1.424 sonder i CRC

vs

. undergruppe A2). Kreditvurderingsbureauer som helhed var således mere adskiller sig fra normale slimhinder end fra CRCs. De tre CRA undergrupper blev også sammenlignet med hinanden, og blev ikke observeret nogen forskel i side-by-side sammenligninger (P-værdi på ≤0.01 af

t

-test med FDR). Derfor blev kreditvurderingsbureauer betragtes kollektivt som en enkelt gruppe for yderligere side-by-side sammenligninger af Students

t

-test.

genekspressionsprofilering i kolorektal Læsioner i Sammenligning med normal slimhinder

for at identificere gener, der kunne deltage i udviklingen fra normal slimhinde til CRA, vi udførte en CRA

vs

. NOR sammenligning, og fandt, at 2.393 sonder blev dereguleret i kreditvurderingsbureauer (≥2.0 fold-ændring (FC), P-værdi på ≤0.01 af

t

-test med FDR), svarende til 32% op- og 68 % ned-regler. CRC

vs

. NOR sammenligning viste, at 1.805 sonder blev dereguleret i CRC’er (≥2.0 FC, P-værdi ≤0.01 af parret

t

-test med FDR), svarende til 46% op- og 54% ned-regler. Varmen kort over de deregulerede sonder med en fold-ændring ≥3.0 og en P-værdi ≤0.001 er vist i figur 1A (CRA

vs

. NOR) og 1B (CRC

vs

. NOR), og figur S1 (CRA

vs

. NOR, fuld billede). Komplette lister over det differentielt udtrykte sonder i CRA

vs

. NOR og CRC

vs

. NOR er vist i tabel S2 og S3, hhv. Et sæt af deregulering begivenheder i CRA

vs

. NOR blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR, og valideringen på Agilent microarray resultater var 78% (50 ud af 64 udskrifter, Tabel S4). Desuden blev udført Qiagen PCR array-eksperimenter på et uafhængigt sæt 96 CRC og 20 NOR prøver (fra Brest tumor bank). Blandt de liberaliserede sonder i CRC

vs

. NOR på mikroarrays, 41 primerpar svarende til de samme gener, der var til stede i PCR-arrays. Otteogtyve blev også dereguleret i PCR arrays (≥2.0 FC, P-værdi ≤0.01), svarende til 68% krydsvalidering (tabel S5).

Heat kort af udtrykket data blev konstrueret ved anvendelse euklidiske afstand med gennemsnitlige binding. Varmen kort over de deregulerede sonder med en fold-ændring ≥3.0 og en P-værdi ≤0.001 er vist for kreditvurderingsbureauer

vs

. NOR (A, komplet varme kortet i figur S1), for CRC

vs

. NOR (B), og CRC

vs

. CRA (C).

CRA

vs

. NOR sammenligning viste flere forskelle end CRC

vs

. NOR sammenligning, og der var mere nede-regler (68% i CRA

vs

. 54% i CRC) end up-regler (32% i CRA

vs

. 46% i CRC) . En intersektionel analyse af probe niveau ændringer blev udført (figur 2A), der viser en signatur af 954 prober dereguleret i både CRA og CRC prøver sammenlignet med normale slimhinder (tabel S6 og figur S2) svarende til 40% og 53% dereguleret prober i CRA og CRC hhv. Alle almindeligt deregulerede prober fulgte samme type variation i begge sammenligninger,

dvs..

Var op- eller nedreguleret på lignende måde.

En intersektionel analyse af probe niveau ændringer blev udført. Afskæringsværdierne var P-værdi ≤0.01 og fold-change ≥2. Den CRA

vs

. NOR sammenligning viste det største antal probe niveauspring (2.393 deregulerede prober), mens CRC

vs

. CRA sammenligning viste de laveste (669 deregulerede sonder). De sonder, der viste ændringer i to eller i de tre sammenligninger var af interesse. (A) Underskrift af 954 sonder liberaliseret i både CRA og CRC læsioner i forhold til NOR. (B) Underskrift af 172 sonder liberaliseret i CRC i forhold til både CRA og NOR. (C) Underskrift af 265 sonder liberaliseret i CRC i forhold til CRA, som niveauer var allerede unormale i CRA i forhold til NOR. (D) Underskrift af 44 sonder viser ændringer i de tre sammenligninger (CRA

vs

. NOR, CRC

vs

. CRA og CRC

vs

. NOR). Forkortelser: NOR: kolorektal normal slimhinde; CRA: kolorektal adenom; CRC:. Kolorektal cancer

Pathway Berigelse af colorectal Læsioner i Sammenligning med normal slimhinder

Kegg pathway analyse viste 25 gen sæt skelne CRA fra NOR, og 20 skelne CRC fra NOR ( P-værdi ≤0.05, tabel 2), overvejer dereguleret sonder med et 2-fold cut-off (P-værdi ≤0.01 af

t

-test med FDR). Supplement og koagulationskaskader, cytokin-cytokin receptor interaktion og kemokin signalveje var blandt toppen af ​​berigede veje i CRA

vs

. NOR, mens cellecyklus og DNA-replikation var veje mest berørt i CRC

vs

. NOR ifølge P-værdi. Syv veje blev beriget i både CRA

vs

. NOR og CRC

vs

. NOR sammenligninger, blandt hvilke p53 signalvejen var en del af allerede beskrevne berigede veje i CRA [14]. Nitrogen stofskifte var også en almindeligt beriget sti mellem de to analyser, og omfattede de kulsyre anhydrases (

CA1

CA4

), som var en del af de mest ned-regulerede sonder i CRA og CRC.

Hvis en 1,1-fold cut-off forskel i stedet for 2,0 blev anvendt til at vælge deregulerede prober (P-værdi ≤0.01),

dvs

. hvis alle deregulerede sonder blev anset (5 733 sonder), 18 gen sætter i stedet for 25 blev ændret i CRA

vs

. NOR ifølge Kegg (P-værdi ≤0.05; Tabel S7). Kun supplere og koagulationskaskader sti var almindeligt mellem begge de 18 og 25 gen lister. Derfor blev 17 nye veje beriget med CRA, såsom DNA-replikation, cellecyklus, spliceosome eller mismatch reparation.

genekspressionsprofilering i kolorektal adenokarcinomer i Sammenligning med ende- og tyktarm

En analyse af forskelligt fundne sonder mellem CRC og CRA identificeret 669 deregulerede sonder (≥2.0 FC, P-værdi på ≤0.01 af

t

-test med FDR), svarende til 55% op- og 45% ned-regler. Varmen kort over de deregulerede prober med en fold-change ≥3.0 og en P-værdi ≤0.001 er vist i figur 1C. Den komplette liste over forskellen sonde signaler i CRC

vs

. CRA er vist i tabel S8. CRC

vs

. CRA sammenligning viste færre sonde niveauforskelle med meget lavere fold-ændringer end CRC

vs

. NOR og CRA

vs

. NOR sammenligninger. Den intersektionel analyse af probesignaler viste en underskrift af 172 prober dereguleret i CRC sammenlignet med både CRA og NOR prøver (figur 2B, Tabel S9 og fig S3), svarende til 26% deregulerede prober i CRC

vs

. CRA, og mindre end 10% deregulerede sonder i CRC

vs

. HELLER IKKE. Da disse ændringer ikke var til stede i CRA, kunne de være markører for CRC aggressivitet.

Pathway Berigelse i kolorektal adenokarcinomer i Sammenligning med ende- og tyktarm

Kegg pathway analyse viste fem gen sæt adskiller CRC fra CRA (P-værdi ≤0.05, tabel 2), overvejer dereguleret sonder med et 2-fold cut-off (P-værdi ≤0.01 af

t

-test med FDR). To beriget veje var specifikke for CRC

vs

. CRA sammenligning: arginin og prolin metabolisme, og TGF

beta

signalvejen, der allerede er beskrevet som en ændret pathway mellem CRA og CRC [9]. Desuden CRA

vs

. NOR og CRC

vs

. CRA sammenligninger havde tre almindeligt beriget veje, blandt hvilke omdrejningspunkt vedhæftning og ECM-receptor interaktion var en del af allerede indberettede veje beriget med kolon carcinogenese [21]. Disse veje kan spille en vigtig rolle i udviklingen af ​​CRC, fordi de blev beriget fra NOR til CRA, og derefter fra CRA til CRC.

Intermediate underskrift Progression fra kolorektal adenom til kolorektal adenocarcinom

de beviser for progression fra NOR til CRA, og derefter til CRC, blev undersøgt med en intersektionel analyse af sonde niveau ændringer. En underskrift 265 sonder, svarende til 215 gener, blev identificeret (figur 2C, tabel S10 og figur S4), som var tilfældigt i listerne over de 2.393 og 669 deregulerede sonder, svarende til CRA

vs

. NOR og CRC

vs

. CRA sammenligninger henholdsvis. Den omfattede deregulerede sonder i CRC

vs

. CRA, som allerede var tydelig i CRA

vs

. NOR analyse. Fordelingerne af op- og ned-regulerede begivenheder i CRC

vs

. CRA var 69% og 31%, hhv. En berigelse analyse af undertegnelsen af ​​265 sonder blev udført ved hjælp af Kegg veje, og afslørede, at 41 gener var en del af otte berigede gen-apparater, herunder omdrejningspunkt vedhæftning, ECM-receptor interaktion eller TGF

beta

signalvejen (tabel S11). Desuden blev identificeret, en mellemliggende genekspression underskrift 44 prober (svarende til 40 gener) (Figur 2D og tabel 3), som var tilfældigt i de tre lister over deregulerede sonder, og derefter var en del af alle underskrifter, som vi tidligere beskrevne (signaturer 954, 172 og 265 prober). Den svarede til 8 op- og 32 nedregulerede gener i både CRA og CRC prøver, sammenlignet med normale slimhinder. Otte sonder demonstrerede progressivt signaler fra NOR til CRA, og derefter til CRC; 23 sonder afsløret gradvist faldet signaler. Desuden blev 13 sonder mindre undertrykt i CRC end i CRA, sammenlignet med NOR.

Klassificering af kolorektal adenomer hos Sammenligning med normal slimhinder og Colorectal adenokarcinomer

En klassificering af kolorektale væv blev udført ved anvendelse hierarkisk gruppering af probesignalet ændringer svarende til de fire underskrifter tidligere beskrevne. Kun to grupper blev skelnes overvejer undertegnelsen af ​​954 prober (Figur S2): den ene bestod af normale slimhinder, og den anden indeholdt en blanding af kolorektale læsioner. Derimod klyngedannelse overvejer underskrift af 172 sonder lov til at skelne mellem de tre typer af kolorektale væv (Figur S3): én gruppe blev kun sammensat af CRC’er, og den anden blev opdelt i et kreditvurderingsbureau undergruppe og en NOR undergruppe. Tilsvarende blev klyngedannelse med underskrivelsen af ​​265 sonder aktiveret for at skelne mellem de tre prøvetyper (Figur S4), men en gruppe kun består af kreditvurderingsbureauer, og den anden grupperet de NOR og CRC prøver, der blev fordelt i to adskilte undergrupper. Endelig underskrift af 44 sonder viste, at flertallet af kreditvurderingsbureauer grupperet med CRC’er, bliver et par kreditvurderingsbureauer (viser den mindst påvirket histologi) grupperet med NOR prøver (Figur 3). For hovedparten af ​​prøverne blev der ikke nøje overensstemmelse mellem histologiske (morfologiske undergrupper eller lokalisering) og molekylære data anerkendt vedrørende fordelingen af ​​kreditvurderingsbureauer i undergrupper. Ligeledes blev detaljerne i CRC klyngedannelse ikke forklares ved tumor lokalisering (tabel S1). Molekylære data kunne således give supplerende oplysninger til at klassificere de kolorektale læsioner.

Filialer repræsenterer individuelle kolorektale prøver. Forskellige farver blev anvendt til at identificere prøven grupper: rød, gruppe af normale slimhinder (N: normal); grøn, gruppe af adenomer (A: adenom); blå, gruppe af adenokarcinomer (C: kræft). Den første prøve anmærkning svarer til prøven gruppen. De undergrupper af adenomer er specificeret: A1, adenomer med områder af mikro-invasive adenokarcinomer; A2, adenomer med områder af intra-slimhinde adenokarcinomer; A3, adenomer med områder af dysplasi. Den anden prøve anmærkning svarer til antal stikprøver.

Exon-Level Analysis i ende- og tyktarm

En CRA

vs

. NOR sammenligning blev udført på human Exon 1.0 ST arrays (Affymetrix), og viste, at 1.484 gener blev dereguleret i CRA (590 op- og 894 ned-regulerede gener, ≥1.5 FC, P-værdi ≤0.05; Tabel S12). En tilsvarende zonekort er vist i figur S5. Et sæt af liberaliserede udskrifter i CRA

vs

. NOR blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR, og valideringen på Affymetrix microarray resultater var 83% (24 ud af 29 udskrifter, også valideret til Agilent analyse). Hertil kommer, at CRA

vs

. NOR sammenligning viste omfattende ændringer i alternative splejsning profiler: 1.852 exons blev liberaliseret i CRA (862 op- og 990 nedreguleres exoner, ≥1.5 FC, P-værdi ≤0.05, Tabel S13). Et offentligt tilgængelige microarray udtryk datasæt fra 10 parret tumor-normal CRC prøver [6] blev hentet fra Affymetrix website for at sammenligne alternative splejsning profilering i CRA og CRC. Den CRA

vs

. NOR og CRC

vs

. NOR sammenligninger havde 100 deregulerede exons til fælles. Mens 47 op- og 47 nedregulerede splejsningsbegivenheder fulgte samme type variation i de to sammenligninger, få bestemmelser var modsat i CRA og CRC, svarende til 6% af fælles deregulerede exoner (data ikke vist). Vi fandt, at 296 dereguleret (102 op- og 194 nedreguleret) sonder i CRA

vs

. NOR fra Agilent analyse viste deregulerede exoner i Affymetrix analyse (data ikke vist). En masse af gener, der var en del af ændrede veje havde deregulerede exons. Blandt de 40 gener fra Agilent transkriptionel underskrift 44 sonder, 8 (

CFH

,

CRYAB

,

DPT

,

FBLN1

,

ITIH5

,

NR3C2

,

SLIT3

og

TIMP1

),

dvs

. 20% havde deregulerede exons (tabel S14).

Diskussion

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge, på hele-transkriptomet niveau, omfanget af variationer, der opstår i humane kolorektale adenomer i sammenligning med adenocarcinomer, idet den normalt epitel som reference. Mange ændringer var tydelige i CRA

vs

. NOR, i endnu højere grad end i CRC

vs

. HELLER IKKE. Derfor CRA, som en slags mellemmand læsion, allerede udstillet stærke tegn på ændringer. Fra de molekylære ændringer dokumenteret i CRA, er det klart, at kreditvurderingsbureauerne ikke blot akkumulere ændringer, der vil alle findes i CRCs. Eventuelt, udviklingen til CRCs følger en mere strengt klonal ekspansion, hvilket kan føre til selektion for gen-ændringer er vigtige for klonal vækst og samtidig fjerne mindre relevante modifikationer. Ifølge denne hypotese kan kreditvurderingsbureauerne have forskellige udfald, nogle udvikler sig i retning af kræft, mens andre kan være tilbøjelige til at forsvinde. Vi identificerede fire underskrifter adskiller de typer af kolorektale væv, og viste, at en 40-gen sæt kunne være af særlig interesse, mærkning de molekylære forandringer, der adskiller den normale slimhinde fra CRA og CRC. Vigtigt er det, flere alternative præ-mRNA-splejsning begivenheder var også karakteristisk for kreditvurderingsbureauer til CRC progression.

Flere gener impliceret i CRC blev dereguleret i CRA

vs

. HELLER IKKE. De højeste stigninger i sonde, der indgår

KIA1199 Hoteller, som allerede var blevet fundet dereguleret i kreditvurderingsbureauer [22], eller matrixmetalloproteinase

MMP7

som overekspression er kendt for at påvirke tidlig kolorektal carcinogenese [23 ]. Femten gen-apparater, såsom dem, der er involveret i cytokin-cytokin receptor interaktion, chemokin signalvejen eller celleadhæsionsmolekyler, var specifikke for kreditvurderingsbureauer

vs

. HELLER IKKE. Vigtigere blev flere nye berigede biologiske veje identificeret, blandt hvilke supplement og koagulationskaskader pathway var den mest væsentligt påvirket i Agilent analyse, og blev også identificeret som ændres i Affymetrix analyse (data ikke vist). Dette er enig i en nylig rapport tyder på, at komponenter fra koagulationskaskaden kan påvirke kræft progression [24].

En række gener blev også udtrykkes forskelligt i CRC

vs

. CRA. De fleste af disse gener er ikke blevet beskrevet i tidligere microarray studier, selv om flere af de vedtagne ændringer til tidligere rapporter, herunder variationer i ekspressionsniveauerne af AMN, THBS2, SPP1 eller TIMP1 [25], [26], [27]. Desuden 58 prober (19 op- og 39 ned-reguleret) fra CRC

vs

. CRA sammenligning var blandt en liste over 248 prober tidligere identificeret [11], herunder for

AURKA

, som koder for et cellecyklus-kinase involveret i CRC [28], og blev overudtrykt i CRC, som i forhold til CRA og NOR. Hertil kommer, blandt vores top dereguleret sonder,

SPON2

,

RGS16

,

SFRP4

CTHRC1

er allerede fundet blandt de mest opreguleret sonder i CRC i forhold til CRA, og

FAM55D

,

ATOH8

,

RETNLB

,

ID4

,

UGT1A6

, og

VSIG2

, blandt de mest ned-regulerede sonder [11]. Det blev allerede vist, at nogle af disse gener blev dereguleret i epitelial kræft eller associeret med, såsom

SFRP4

,

SPON2

[29],

RGS16

[30], eller

UGT1A6

[31].

Specifikke genekspression ændringer i begge typer af kolorektale læsioner blev identificeret, takket være tværsektorielle analyser (figur 2). For det første, 1.218 (51%) deregulerede sonder var specifikke for NOR til CRA overgang, og så kunne markere lav risiko CRA, fordi der ikke var nogen sammenhæng med CRC. For det andet, 723 (40%) deregulerede sonder var specifikke for CRC

vs

. NOR, og så kunne markere specifikt CRC. Endelig 276 (41%) deregulerede sonder var specifikke for kreditvurderingsbureauer til CRC overgang. Sidstnævnte probe sæt kunne være interessant at definere begivenheder specifikke for de sidste trin for kræft progression.

underskrift 954 sonder svarede til gener, der viser udtryk ændringer i både CRA og CRC prøver, i forhold til normal slimhinder. Da disse deregulerede sonder i CRC blev også unormalt udtrykt i CRA, de var usandsynlig kandidat markører for progression fra CRA til CRC. Derfor har den hierarkiske klyngedannelse ikke tillade at skelne kreditvurderingsbureauer fra CRCs. Underskrivelsen af ​​172 sonder, svarende til gener dereguleret i CRC i forhold til både CRA og NOR, kunne markere specifikt CRC og støtter denne hypotese, den hierarkiske klyngedannelse identificeret CRC’er som en enkelt gruppe. Underskrivelsen af ​​265 prober svarende til gener dereguleret i CRC

vs

. CRA, der allerede var unormalt udtrykt i CRA

vs

.