PLoS ONE: tumorceller Positive og negative for den fælles Cancer Stem Cell Markers er stand til at initiere tumorvækst og Generering Begge afkom

Abstrakt

cancer stamceller (CSC) model skildrer at tumorer hierarkisk organiseres og vedligeholdes af CSCS ligger i spidsen. CSCS er “identificeret” i en række tumorer gennem tumor-dannende assay, hvori tumorceller udmærker sig ved en vis celleoverflademarkør (kendt som en CSC markør) blev separat transplanteret til immundefekte mus. I sådanne analyser, tumorceller positiv, men ikke negativ for CSC markør (hermed defineret som CSC

+ og CSC

– celler, henholdsvis) har mulighed for tumor-dannende og genererer begge afkom. Her viser vi imidlertid, at CSC

+ og CSC

– celler udviser lignende spredning i de indfødte stater. Ved hjælp af en celle sporing metode, vi viser, at CSC

– celler udviser lignende tumorigenese og spredning som CSC

+ celler, når de var co-transplanteret ind immunsvækkede mus. Gennem seriel encellede afledt sublinie konstruktion, vi yderligere påvist, at CSC

+ og CSC

– celler fra CSC markør udtrykker tumorer kunne uvægerligt generere både afkom, og deres karakteristika bevares blandt forskellige generationer uanset oprindelsen (CSC

+ – afledt eller CSC

– afledt). Disse resultater viser, at tumorigene celler ikke kan skelnes ved fælles CSC markører alene og vi foreslår, at der bør tages forholdsregler, når du bruger disse markører selvstændigt at identificere kræft stamceller på grund af den fænotypiske plasticitet af tumorceller

Henvisning:. Huang SD, Yuan Y, Tang H, Liu XH, Fu CG, Cheng HZ, et al. (2013) tumorceller Positive og negative for den fælles Cancer Stem Cell Markers er stand til at initiere tumorvækst og Generering Begge afkom. PLoS ONE 8 (1): e54579. doi: 10,1371 /journal.pone.0054579

Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA

Modtaget: November 3, 2011; Accepteret: December 13, 2012; Udgivet: 21 januar 2013

Copyright: © 2013 Huang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (tilskud 30471718, 30.801.094, og 30.872.552), og Shanghai Municipal Natural Science Foundation (tilskud 10140902300). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Et grundlæggende spørgsmål inden for tumor forskning er hvilke celler kan initiere tumorer. To modeller er blevet fremført for at forklare indledningen af ​​tumorer [1], [2]. Den klonale evolution model (også kendt som den stokastiske model) indebærer, at tumorer omfatter celler med lige tumorigene potentiale, og at enhver funktionel heterogenitet skyldes tilfældige eller stokastiske påvirkninger (indre eller ydre), der kan ændre adfærden af ​​individuelle celler i tumoren. Derimod kræft stamceller (CSC) model (også kendt som hierarkiet model) hævder, at, ligesom normale væv, som er cellulære hierarkier vedligeholdes af stamceller, kan tumorer forklares ved hierarkiske organisationer, hvori CSCS liggende ved toppunktet holde kapaciteten for tumor initiering, selvfornyelse, og generering af fænotypisk forskellige celler med ingen eller begrænset proliferativ kapacitet. Fortalere for CSC-modellen foreslår, at CSCS kan tegne sig for tumor adfærd såsom metastaser [3], [4] og resistens mod kemoterapi eller strålebehandling [5] – [9]. Derfor kan CSC-målrettet terapi være den fremtidige retning for tumor behandling [10] – [13].

Gennem tumor-dannende assay, hvor fænotypisk forskellige celler blev separat transplanteret ind immunsvækkede mus, CSC var først “identificeret “i human akut myeloid leukæmi (AML) da kun CD34

+ CD38

– fandtes celler at have evnen tumor initiering, selvfornyelse, og generere celler i andre undergrupper under en sådan tilstand [14]. Siden da har xenotransplantation forsøgsmodel været meget anvendt i CSC undersøgelser. Ved hjælp af forskellige celleoverflademarkører, har en stor mængde litteratur publiceret tyder eksistensen af ​​CSCS i en række tumorer, såsom kronisk myeloid leukæmi (CML) [15], [16], akut promyelocytisk leukæmi (APL) [17], [18], brystkræft [19], glioblastom [20] – [23], tyktarmskræft [24] – [26] og melanom [27] – [30].

der er dog urolig kontrovers hvorvidt det tumor-dannende evne hos humane tumorceller blev afspejlet korrekt i tidligere undersøgelser [31], [32]. Eftersom effektiviteten af ​​xenotransplantation i de fleste tilfælde er betydeligt lavere end for syngene transplantationer, Kelly et al. foreslog, at tumor-dannende evne hos humane tumorceller kan blive alvorligt kompromitteret i milieu mus grundet artsspecifikke forskelle i affinitet (eller anerkendelse) af cytokin og vækstfaktor-receptorer for deres beslægtede ligander [33]. Desuden, Quintana et al. ansat en mere stærkt immunkompromitterede musestamme (NOD /SCID interleukin-2 receptor gamma-kæde null [ll2rg – /-]) for xenotransplantation assay og fandt, at dette kan dramatisk øge påviselige frekvens af celler med tumorigent potentiale i humant melanom, hvilket antyder, at tumor-dannende evne hos humane tumorceller blive kraftigt kompromitteret på grund af immun indflydelse i det fremmede miljø [34]. Disse førte os til at spørge, om den proliferative og tumorigen kapacitet humane tumorceller, specielt det “ikke-CSCS” kunne have været undervurderet i de tidligere undersøgelser.

I den foreliggende undersøgelse, vi evaluerede spredning og apoptose af de formodede CSCS (CSC

+ -celler) og ikke-CSCS (CSC

– celler) i primære tumorer samt tumorcellelinier ved flowcytometri. I modsætning til de tidligere rapporter fra konventionelle xenotransplantation assays (transplantation CSC

+ og CSC

– celler separat), hvor CSC

– celler viste sig at have ingen eller begrænset proliferativ kapacitet [1], [35] , [36], vi fandt ingen signifikante forskelle i proliferation og apoptose mellem de to delmængder i den native tilstand. Vi yderligere ansat en celle sporing teknik til at følge den spredning, tumorgenicitet af CSC

+ og CSC

– celler. Vi valgte at studere celler fra flere tumorcellelinier stedet for primære tumorer, som kan omfatte genetisk afvigende celler [27], [37]. Det blev konstateret, at CSC

– celler udviste lignende proliferativ og tumorigene kapaciteter som CSC

+ -celler, når de to delmængder levede. Desuden kunne begge delmængder give anledning til CSC

+ samt CSC

– afkom, mens egenskaberne af CSC

+ (eller CSC

-) celler blev holdt mellem forskellige generationer uanset deres oprindelse (CSC

+ – afledt eller CSC

– afledt). Vores resultater tyder på, at CSC markører bør anvendes med omtanke for at differentiere cancer stamceller fra andre tumorceller på grund af deres fænotypisk plasticitet.

Resultater Salg

Ekspression af CSC markører varierer enormt i humane primære tumorer og tumorcellelinier

Tidligere undersøgelser tydede på, at leukæmogent /tumorigene celler var begrænset til en sjælden population af tumorceller, der udtrykker visse CSC markører [35], [36]. Ved hjælp af en trypsin-fri dissociation protokol (for at bevare epitop integritet), vi har registreret den procentdel af CSC markør positive celler (fx CD34

+ CD38

– for AML, APL, og CML, CD44

+ CD24

– for brystkræft, CD133

+ for glioblastom og tyktarmskræft, og CD271

+ for melanom) i humane primære tumorer samt tumorcellelinier ved flowcytometrisk analyse. Vi fandt, at et betydeligt antal primære tumorer eller tumorcellelinier ikke udtrykker disse CSC markører (figur 1A), hvilket er i overensstemmelse med nogle andre rapporter [38], [39]. Desuden har vi udført kvantitativ RT-PCR og fandt, at celler (både CSC

+ og CSC

-) fra CSC markør udtrykker tumorer, men ikke celler fra CSC markør ikke-udtrykkende tumorer, udtrykker CSC markør mRNA (figur 1B-F og fig S1), hvilket antyder, at CSC markør udtrykkende og ikke-udtrykkende tumorer kan stamme fra forskellige typer af tumorceller. I primære tumorer og tumorcellelinier, som udtrykker disse CSC markører, procentdelen af ​​CSC markør-positive celler varierede enormt, lige fra 0,4% i en AML til så højt som 82,7% i en coloncancer (figur 1A).

(A) procentdelen af ​​CSC markør-positive celler fra humane primære tumorer (n = 10 for hvert type) og tumorcellelinier. Enkeltcellesuspensioner blev fremstillet, efterfulgt af flowcytometrisk analyse. Prikker repræsenterer procentdelen af ​​CD34

+ CD38

– celler i AML, APL, og CML, CD44

+ CD24

– celler i brystkræft, CD133

+ celler i glioblastom og tyktarmskræft og CD271

+ -celler i melanom prøver. (B-F) CSC markør mRNA-ekspression niveau af celler (CSC

+ og CSC

– celler fra CSC markør udtrykkende tumorcellelinjer, og celler fra ikke-udtryk tumorcellelinier) blev analyseret ved QRT-PCR og normaliseret til

GAPDH

. Niveauet for CD34-mRNA i KG-1 CSC

+ -celler, CD44 mRNA i MCF-7 CSC

+ -celler, CD133 mRNA i SHG-44 og Caco-2 CSC

+ -celler, CD271 mRNA i A375 CSC

+ celler, blev arbitrært betegnet som 1,0 for leukæmi, brystcancer, glioblastom, coloncancer, melanom prøver. Billedet viser RT-PCR-produkter og histogrammer viser CSC markør-mRNA-ekspression niveau af celler fra leukæmi (B), brystcancer (C), glioblastoma (D), coloncancer (E), og melanom (F) cellelinier. Bemærk, at celler fra CSC markør ikke-tumor cellelinier (U37, U81, COLO320, LoVo, LS174T) ikke udtrykker CSC markør mRNA

CSC

-. Tumorceller udviser lignende spredning som CSC

+ tumorceller i de indfødte statslige

for at undersøge udbredelsen af ​​de formodede CSCS (CSC

+ celler) og ikke-CSCS (CSC

– celler) i native tilstand, vi målte procentdelen af ​​prolifererende og apoptotiske celler i de to undergrupper i CSC markør udtrykkende primære tumorer (f.eks AML, APL, CML, brystcancer, glioblastom, coloncancer, og melanom) ved flowcytometri. Som vist i figur 2A og 2B, procentdelen af ​​Ki-67 positive celler, og procentdelen af ​​Annexin V

+ 7-AAD

– celler var ikke signifikant forskellig mellem de to delmængder. Lignende resultater blev opnået i

in vitro

(figurerne 2C og 2D) og

in vivo

(fig 2E og 2F) undersøgelser af CSC markør udtrykker humant tumorcellelinier. Disse resultater antyder, proliferative kapacitet CSC

– celler ligner den af ​​CSC

+ celler i native tilstand

(A, B) CSC markør udtrykker delprøve blev udvalgt til at gennemgå. Ki-67-ekspression og apoptose analyse. Data repræsenterer middel ± SEM; n = 10 for hver type leukæmi, n = 8 for glioblastom og for coloncancer, n = 9 for brystkræft og for melanom. (A) Ki-67 udtryk for CSC

+ og CSC

– celler fra humane primære tumorer. Enkeltcellesuspensioner af humane primære tumorer blev farvet med antistoffer specifikke for de CSC markører og Ki-67-FITC, efterfulgt af flowcytometrisk analyse. (B) Apoptose assay af CSC

+ og CSC

– celler fra humane primære tumorer. Enkelt celle suspensioner af humane primære tumorer blev farvet med antistoffer specifikke for de CSC markører og Annexin V-FITC /7-ADD, efterfulgt af flowcytometrisk analyse. (C-D) Ki-67-ekspression (C) og apoptose (D) assay af CSC

+ og CSC

– celler fra humane tumorcellelinier dyrket i serumholdigt medium. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. (E-F) Ki-67-ekspression (E) og apoptose (F) assay af CSC

+ og CSC

– celler af xenotransplantater afledt af humane tumorcellelinier. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. (G) DsRed-mærket CSC

+ og EGFP-mærket CSC

– celler, der stammer fra samme tumorcellelinier blandedes ifølge deres oprindelige forhold og co-dyrket i serumholdigt medium i 20 passager. Prikker viser forholdet mellem CSC

+ – afledt til CSC

– afledt (DsRed: EGFP) celler ved forskellige passager. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 3 uafhængige forsøg

For at følge udbredelsen af ​​CSC

+ og CSC

-. Celler, vi yderligere ansat en celle sporing teknik udviklet til at simulere

in situ

miljø, hvor begge delmængder sameksistere. DsRed-mærket CSC

+ og EGFP-mærket CSC

– celler, der stammer fra samme tumorcellelinier blandedes ifølge deres oprindelige forhold og co-dyrket i serumholdigt medium i 20 passager (se Eksperimentelle Procedurer for detaljer ). Flowcytometri analyse viste, at forholdet mellem CSC

+ – afledt til CSC

– afledt (DsRed: EGFP) celler forblev stort set uændret gennem hele processen (figur 2G). Disse data tyder på, at både CSC

+ og CSC

– celler kunne udbrede udstrakt

CSC

-. Tumorceller viser lignende tumor-dannende egenskab CSC

+ tumorceller upon co -transplantation

i lyset af ovenstående resultater, vi undersøgte tumor-dannende evne CSC

+ og CSC

– celler ved co-transplantation samt konventionel xenotransplantation (transplantation CSC

+ og CSC

– celler separat). DsRed-mærket CSC

+ og EGFP-mærket CSC

– celler stammede fra samme tumorcellelinier blev blandet i deres oprindelige forhold. Forskellige antal CSC

+, CSC

-, eller blandede celler blev injiceret under nyrekapslen af ​​subletalt bestrålede NOD-SCID-mus, henholdsvis. Det blev konstateret, at begge CSC

+ og CSC

– celler kunne initiere tumordannelse når transplanteret separat, selv om hyppigheden af ​​tumor dannelse ved CSC

– celler var signifikant lavere end i CSC

+ celler (tabel S1). Når CSC

+ og CSC

– celler blev co-transplanteret blev xenotransplantater sammensat af både CSC

+ – afledt (DsRed) og CSC

– afledt (EGFP) celler, som vist i figur 3A og 3B. Vigtigt er, flowcytometri-analyse viste, at forholdene mellem CSC

+ – stammer til CSC

– afledt (DsRed: EGFP) celler i xenotransplantaterne var ikke signifikant forskellige fra forholdene mellem CSC

+ til CSC

– (DsRed: EGFP) celler i blandingerne, der var blevet injiceret (figurerne 3C og 3D, tabel 1). Vi udførte xenotransplantation ned til den tredje passage. Flowcytometri analyse viste, at forholdene mellem CSC

+ – afledt til CSC

– afledt (dsRed: EGFP) celler i xenotransplantaterne forblev stort set uændret mellem de forskellige passager (tabel 1). Disse data tyder på, at selv om CSC

+ celler kan være mere tumorigen når studeres separat, præ-isolerede CSC

– celler kan fastholdes i co-transplatation model. Undersøgelserne også indebære, at det tumor-dannende evne CSC

-. Celler kunne undervurderes, hvis de er undersøgt separat i et fremmed miljø

(A og B) dsRed-mærket CSC

+ og EGFP-mærket CSC

– celler, der stammer fra samme tumorcellelinier blev blandet til deres oprindelige forhold og co-transplanteret ind subletalt bestrålede NOD-SCID-mus. Fotografier repræsenterer fluorescerende billeder (A) og hematoxylin og eosin-farvning (B) af serielle sektioner af xenotransplantater afledt af KG-1, MCF-7, SHG44, Caco-2 og A375. Scale bar = 100 um. (C) Flowcytometrisk kontur plots viser procentdelen af ​​DsRed og EGFP celler i xenotransplantaterne. (D) Histogrammer viser forholdet mellem CSC

+ til CSC

– (DsRed: EGFP) celler i injektioner og forholdet mellem CSC

+ – afledt til CSC

– afledt (DsRed: EGFP ) celler i xenotransplantater. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 3 uafhængige forsøg.

plasticitet CSC markør baseret hierarki i CSC markør udtrykker tumorer

uventet fandt vi, at et betydeligt antal CSC

+ celler var til stede i CSC

– afledte befolkninger både

in vitro

in vivo

og procentdelen af ​​CSC

+ celler i CSC

+ – og CSC

– afledte befolkninger var sammenlignelige efter dyrket (eller xenotransplanted) i flere passager (tabel S2), hvilket tyder på, at CSC

– celler i CSC markør udtrykker tumorer kan give anledning til CSC

+ celler . For at bekræfte, at CSC

+ celler i CSC

– afledt befolkning var faktisk afkom af CSC

– celler og ikke et resultat af forurening celle indført under cellesortering [40] målte vi (i CSC markør udtrykkende tumorcellelinjer, under anvendelse af flowcytometri) procentdelen af ​​CSC markør-positive celler i enkelt CSC

+ – stammer eller CSC

– afledt underlinjer. Som vist i figur 4 og figur S2, både CSC

+ og CSC

– celler var i stand til at frembringe enkeltcelle-afledte underlinjer og give anledning til de to delmængder. I første omgang, den procentdel af CSC markør positive celler i en enkelt CSC

– afledte underlinjer var signifikant lavere end i single CSC

+ – afledte underlinjer. Men over en længere periode kultur (ca. 20 passager, se Eksperimentelle Procedurer for detaljer), procentdelen af ​​CSC markør-positive celler i hver sublinie var statistisk svarende til den i de oprindelige tumorcellelinier. Desuden fandt vi, at klonen dannende effektivitet CSC

– celler varierede fra 36,1% i Caco-2 til 70,3% i THP-1 (figur S3). Især andelen af ​​klon danner CSC

– celler er langt højere end hastigheden af ​​forurening med CSC

+ celler (falske negative celler, normalt lavere end 0,1%) i CSC

– befolkningen som sorteres efter FACS. Disse resultater viser, at CSC

– celler kan give anledning til CSC

+ celler i CSC markør udtrykker humane tumorer

(A-E) CSC

+ og CSC

-. Celler fra den oprindelige tumor cellelinier blev udvalgt til at frembringe enkeltcelle-afledte underlinjer (SCDSLs). Procentdelen af ​​CSC markør-positive celler i den oprindelige tumor cellelinier eller SCDSLs (passage 1 og passage 20) af KG-1 (A), MCF-7 (B), SHG44 (C), HT-29 (D), og A375 (E) blev analyseret ved flowcytometri. Box plots viser procentdelen af ​​CSC markør positive celler i SCDSLs, med knurhår repræsenterer minimum og maksimum værdier, de centrale linjer repræsenterer medianen, og kasser, der repræsenterer den 25. og 75. percentil. Histogrammer viser procentdelen af ​​CSC markør-positive celler i originale tumorcellelinier og SCDSLs. Data for SCDSLs repræsenterer middelværdi ± SEM fra 100 prøver; Data for oprindelige tumorcellelinjer repræsenterer middelværdi ± SEM fra 3 uafhængige forsøg; **

P

0,01 af uafhængige

t

-test

Vi gennemførte den encellede afledt sublinie konstruktion ned til den tredje generation (figur 5A. ). Uanset generationerne eller oprindelser (CSC

+ – afledt eller CSC

– afledt), hver eneste delområde indeholdt et betydeligt antal CSC

+ celler (figur 5B og 5C, figur S4A og s4b) , og procentdelen af ​​CSC markør positive celler i det indre CSC

+ – afledt (eller CSC

– afledt) underlinjer var sammenlignelig blandt alle generationer (figur 5D og 5E, figur S4C og S4D). Konkret kunne begge delmængder uvægerligt generere CSC

+ og CSC

– afkom i alle generationer, og ingen underlinjer udelukkende bestod af CSC

+ eller CSC

– celler. Desuden har vi undersøgt proliferation og tumorigenese af CSC

+ (eller CSC

-) celler fra forskellige generationer (figur 6A). Som vist i figur 6B, 6C og figur S5, procentdelen af ​​Ki-67 positive celler, procentdelen af ​​Annexin V

+ 7-AAD

– celler, og hyppigheden af ​​tumorigene celler var statistisk ens på tværs af alle generationer på trods af oprindelsen. Disse resultater viser, at CSC

-. Celler er i stand til at generere CSC

+ celler og antyder, at der er betydelig plasticitet af disse fælles CSC markører i disse tumorer

(A) Skematisk diagram viser konstruktionen af serielle encellede afledte underlinjer (SCDSLs). CSC

+ og CSC

– celler fra de oprindelige tumorcellelinier blev udvalgt til at generere SCDSLs og vilkårligt klassificeret som generation 1 SCDSLs (herunder G

1

+ og G

1

-). CSC

+ og CSC

– celler fra G

1 SCDSLs blev udvalgt til at generere G

2 SCDSLs (herunder G

1

+ G

2

+, G

1

-G

2

+, G

1

+ G

2

– og G

1

-G

2

-). Vi gentog proceduren, indtil G

3 SCDSLs blev opnået. (B-E) Procentdelen af ​​CSC markør-positive celler i SCDSLs fra KG-1, MCF-7, SHG44, Caco-2 og A375 blev analyseret ved flowcytometri når cellen mængde nåede ca. 1 × 10

6. Box plots viser procentdelen af ​​CSC markør positive celler i single CSC

+ – afledt (B) og CSC

– afledt (C) underlinjer fra forskellige generationer, med knurhår repræsenterer minimum og maksimum værdier, den centrale strækninger, der repræsenterer medianen, og kasserne repræsenterer den 25. og 75. percentil. Histogrammer viser procentdelen af ​​CSC markør-positive celler i enkelt CSC

+ – afledt (D) og CSC

– afledt (E) underlinjer fra forskellige generationer. Dataene repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 100 prøver, hver fra en uafhængig seriel SCDSL konstruktion.

(A) Skematisk diagram viser cellen klassifikation baseret på generering og CSC markør udtryk. Celler fra den oprindelige tumor cellelinier blev vilkårligt klassificeret som generation 1 (G

1) celler og sorteret i CSC markør positive (G

1

+) og negative (G

1

– ) celler. G

1

+ og G

1

– celler blev derefter formeret (fra 1 × 10

2 til ca. 1 x 10

8) til at generere G

2 ( herunder G

1

+ G

2

+, G

1

+ G

2

-, G

1

-G

2

+ og G

1

-G

2

-) celler. Vi gentog proceduren, indtil G

3 celler blev opnået. (B og C) CSC

+ og CSC

– celler fra forskellige generationer blev anvendt til proliferative og tumorgene assays. Histogrammer viser procentdelen af ​​Ki-67 positive celler, procentdelen af ​​Annexin V

+ 7-AAD

– celler, og hyppigheden af ​​tumorigene celler af CSC

+ -celler (B) og CSC

– celler (C) fra forskellige generationer i KG-1, MCF7, SHG44, Caco-2 og A375. Hyppighed af tumorigene celler blev beregnet under anvendelse Extreme begrænsende fortynding Analysis software. Andre data er udtrykt som middelværdi ± SEM fra 3 uafhængige forsøg.

Diskussion

Spørgsmålet om, hvilke tumorceller bidrager til tumor progression har grundlæggende betydning for terapi. Hovedsagelig baseret på resultaterne, at kun tumorceller, der udtrykker bestemte celleoverflademarkører kunne iværksætte tumorvækst, når transplanteret ind immunsvækkede mus, fortalere for CSC-modellen foreslår, at tumorer hierarkisk er organiseret og dermed tumor behandling skal være rettet mod at fjerne de tumorigene celler (dvs. CSCS) [2], [41], [42]. Men her viser vi, at tidligere identificerede CSC markører (fx CD34

+ CD38

– for AML, APL, og CML, CD44

+ CD24

– for brystkræft, CD133

+ for glioblastom og coloncancer, CD271

+ for melanom), ikke nødvendigvis bortfiltrere tumorigene celler i disse tumorer, fordi både CSC

+ og CSC

– celler kan initiere tumorvækst og give både descendenter ( dvs CSC

+ og CSC

– celler). Vores data rejser interessante spørgsmål om plasticitet tumor hierarki.

CSC-modellen postulerer, at indledningen af ​​tumordannelse er drevet af CSCS mens de ikke-CSCS, der komponere hovedparten af ​​celler i en tumor, har ingen eller begrænset kapacitet til initiering af tumordannelse [1], [35], [36]. På den anden side blev der CSCS rapporteret at være mere hvilende end ikke-CSCS [41], [43]. Hvis eksisterer grundlæggende forskelle i den proliferative potentiale mellem CSCS og ikke-CSCS bør sådanne forskelle let afsløres ved immunhistokemisk eller flowcytometrisk analyse af celleproliferation. Her viste vi imidlertid, at spredning og apoptose af de formodede CSCS (CSC

+ -celler) og ikke-CSCS (CSC

– celler) var bemærkelsesværdigt ens i primære tumorer og tumorcellelinier, hvilket antyder, at den proliferative kapacitet CSC

– celler kunne have været alvorligt undervurderet i tidligere undersøgelser, hvor CSC

+ og CSC

– celler blev separat transplanteret ind i dyrene. Derfor etablerede vi en celle sporing metode designet til at simulere

in situ

miljø, hvor CSC

+ og CSC

– celler sameksistere. I modsætning til de tidligere rapporter om, at CSC

– celler havde ingen eller begrænset evne til spredning og dermed ikke initiere tumorvækst [35], [36], viste vi, at CSC

– celler udviste lignende proliferation eller bæredygtighed CSC

+ celler, når begge delmængder var samdyrket

in vitro

eller co-transplanteret til dyrene i henhold til deres oprindelige forhold. Disse data antyder kraftigt, at der ud over CSC

+ -celler, CSC

-. Celler også er i stand til proliferation og tumorigenese

CSC model afbilder en tumor som en cellulær hierarki, hvor kun CSCS liggende ved toppen har evnen til selvfornyelse og genererende celler af resten. Tilgængelige beviser til støtte for CSC-modellen for det meste kommer fra tumor-dannende undersøgelser. Som tidligere nævnt kan det tumor-dannende assay ikke være tilstrækkeligt til at påvise en hierarkisk organisation siden tumor-dannende evne tumorceller kunne drastisk påvirket af de interne og eksterne faktorer [33], [34], især når forskellige delmængder af tumorceller er undersøgt separat i et fremmed miljø. På den anden side, selv om nogle undersøgelser viste, at CSC

– (CD133

-) celler i glioblastom [38] og tyktarmskræft [39] kunne initiere tumorvækst, om der er en CSC markør baseret hierarki i disse tumorer blev ikke undersøgt grundigt. I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi skæbnen for de celler, der stammer fra formodede CSCS (CSC

+ celler) og ikke-CSCS (CSC

– celler) ved celle sporing under tilstand, hvor de to delmængder levede. Vi fandt både CSC

+ og CSC

– celler kunne påvises i afkom af CSC

+ (eller CSC

-) celler både

in vitro

i vivo

. Via seriel encellede afledt sublinie konstruktion med celler fra tumorcellelinier, vi endvidere dokumenteret, CSC

– samt CSC

+ -celler fra CSC markør udtrykkende tumorer kunne uvægerligt give både afkom, og det proliferative eller tumorigen kapacitet CSC

+ (eller CSC

-) celler blev opretholdt mellem forskellige generationer, uanset oprindelsen (CSC

+ – afledt eller CSC

– afledt). Disse data giver stærke beviser, at der ikke er nogen fælles CSC markør baseret hierarki i disse tumorer.

celleoverflademarkører er ofte blevet brugt til at skelne CSCS fra ikke-CSCS og de fleste af de tidligere undersøgelser antydet, at CSCS var begrænset til en sjælden population af tumorceller [35], [36]. Men vore data tyder, at ekspressionen af ​​celleoverflademarkører er mere kompleks end tidligere anerkendt. I overensstemmelse med nogle andre rapporter [38], [39], vi viste ved flowcytometrisk analyse, at procentdelen af ​​CSC markør positive celler varierede enormt (fra 0,4% i en AML til så højt som 82,7% i et kolon kræft) i CSC markør udtrykker tumorer, og at et betydeligt antal af primære tumorer eller tumorcellelinjer ikke udtrykte disse CSC markører. Gennem kvantitativ RT-PCR, vi yderligere afsløret, at celler (både CSC

+ og CSC

-) fra CSC markør udtrykker tumorer men ikke celler fra CSC markør ikke-udtrykkende tumorer udtrykte CSC markør mRNA, hvilket tyder på, at CSC markør udtrykkende og ikke-udtrykkende tumorer kan stamme fra forskellige typer af tumorceller. Især i modsætning til både CSC model og klonal evolution model, hvor den fænotypiske heterogenitet skyldes epigenetiske og genetiske ændringer, henholdsvis viser vi, at ekspressionen af ​​CSC markører i celler fra CSC markør udtrykkende tumorcellelinier kan være dynamisk. Sådan fænomen blev også bemærket af andre i nogle humane primære tumorer [44] – [46] og tumorcellelinjer [45], [46]. . Hvorvidt en sådan fænomen eksisterer i andre primære tumorer garanterer yderligere undersøgelse

De nuværende data viser, at både CSC

+ og CSC

– celler har mulighed for tumorigenese og at ekspressionen af ​​CSC markører er reversibel . Men vi ikke udelukke funktionel heterogenitet mellem de to delmængder som CSC

+ celler udviste højere tumorigenicitet end CSC

– celler, når de blev transplanteret separat i mus. Tidligere blev CSC

+ -celler rapporteret at udvise større immuntolerance (f.eks CD271

+ humane melanomceller [29]) og højere sekretion af vækstfaktorer (fx CD133

+ humane glioblastom-celler [47] ) end CSC

– celler. Derfor kan den højere tumorgenicitet af CSC

+ celler i xenotransplantation enten være på grund af deres bedre tilpasning til den udenlandske miljø og /eller deres evne til at udskille vækstfaktorer, som er kritiske for celle overlevelse og formering. Hvorvidt CSC

+ og CSC

– celler kan vise åbenlyse forskelle i tumor initiering, metastaser, og resistens over for kemoterapi eller strålebehandling i det menneskelige miljø stadig at blive undersøgt yderligere. En bedre forståelse af de underliggende mekanismer i den funktionelle heterogenitet kan give vigtige spor for udvikling og evaluering af nye anticancer behandlingsformer.

Konklusioner

Denne undersøgelse viser begrænsningen af ​​at anvende fælles CSC markører til identificere en cellepopulation (dvs. CSCS), der er

udelukkende

stand til at proliferere og initiere tumorvækst i tumorcellelinier vi undersøgt. Vores data er mere positive over for klonal evolution model, hvor de fleste af tumorcellerne er i stand til spredning og tumorigenese og den funktionelle heterogenitet af tumorceller skyldes tilfældige eller stokastiske påvirkninger (indre eller ydre). Denne konklusion er baseret på resultaterne, at sameksisterende formodede CSCS (CSC

+ celler) og ikke-CSCS (CSC

– celler) udviste lignende evne til spredning og tumorigenese og at begge delmængder kunne give anledning til CSC

+ og CSC

– afkom. Vores resultater tyder på begrænsningerne ved at bruge disse markører selvstændigt at differentiere cancer stamceller fra ikke-tumorigene celler på grund af den fænotypiske plasticitet af tumorceller.

Materialer og metoder

Etik erklæring

<