PLoS ONE: MicroRNA Expression og identifikation af formodede miRNA mål i kræft i æggestokkene

Abstrakt

Baggrund

MikroRNA’er (miRNA) repræsenterer en klasse af små ikke-kodende RNA, der styrer genekspression ved at målrette mRNA og udløser enten translation undertrykkelse eller RNA-nedbrydning. Emerging tyder det potentielle inddragelse af ændret regulering af miRNA i patogenesen af ​​kræft, og disse gener menes at fungere som både tumor undertrykkere og onkogener.

Metodologi /vigtigste resultater

Brug microRNA microarrays identificerer vi flere miRNA afvigende udtrykt i human ovariecancer væv og cellelinier.

miR-221

skiller sig ud som en meget forhøjet miRNA i kræft i æggestokkene, mens

miR-21

flere medlemmer af

Lad-7

familie findes nedreguleres. Offentlige databaser blev brugt til at afsløre potentielle mål for de højt differentielt udtrykte miRNA. For eksperimentelt identificere udskrifter, hvis stabilitet kan blive påvirket af de differentielt udtrykte miRNA, vi transficeret precursor miRNA i menneskelige kræftceller og brugte oligonukleotid mikroarrays til at undersøge ændringer i mRNA-niveauer. Interessant, der var lidt overlapning mellem det forudsagte og de eksperimentelle mål eller veje, eller mellem eksperimentelle mål /veje opnået ved hjælp af forskellige cellelinjer, fremhæver kompleksiteten af ​​miRNA target udvælgelse.

Konklusion /Betydning

Vores resultater identificere flere differentielt udtrykte miRNA i kræft i æggestokkene og identificere potentielle mål udskrifter, der kan reguleres ved disse miRNA. Disse miRNA og deres mål kan have en vigtig rolle i initiering og udvikling af kræft i æggestokkene

Henvisning:. Dahiya N, Sherman-Baust CA, Wang T-L, Davidson B, Shih I-M, Zhang Y, et al. (2008) MicroRNA Expression og identifikation af formodede miRNA mål i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 3 (6): e2436. doi: 10,1371 /journal.pone.0002436

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: Januar 4, 2008; Accepteret: 6 maj 2008; Udgivet: 18 Jun 2008

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:.. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for NIH, National Institute on Aging

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

MikroRNA’er (miRNA) er 21-23 nukleotid regulatoriske RNA behandlet 70-100 nukleotid hårnål pre-miRNA [1], [2]. MiRNA er inkorporeret i en Ribonukleoproteinkompleks kaldet RNA-induceret silencing kompleks (RISC) og lede RISC til mål-mRNA’et [3]. Binding af miRNA til målet mRNA 5’UTR kan nedregulere genekspression gennem hæmning af translation eller øget RNA-nedbrydning. Desuden nye oplysninger tyder på, at miRNA også kan opregulere oversættelse under visse omstændigheder [4]. Hundreder af miRNA er blevet identificeret i forskellige arter, herunder

C. elegans

, mennesker, og planten

Arabidopsis thaliana

. Det menes, at mammale miRNA har potentiale til at regulere mindst 20-30% af alle humane gener [5]. Hver miRNA kan målrette op til 200 transkripter direkte eller indirekte, og flere miRNA kan målrette et givet gen [6]. Derfor mulighed regulerende kredsløb gives af miRNA er yderst kompliceret. Ekspressionen af ​​flere miRNA har vist sig at være udviklingsmæssigt reguleret og flere undersøgelser har vist, at miRNA er ansvarlige for fastsættelsen celle skæbne. Disse resultater viser, at miRNA spiller en stor rolle i grundlæggende cellulære processer, herunder timingen af ​​cellulære udvikling, hæmatopoiese, fedtstofskiftet, organogenese, apoptose, celleproliferation og differentiering. Der er også stærke beviser for, at miRNA er impliceret i opståen og udvikling af mange sygdomme, herunder kræft [3].

Sammenligning mellem menneskelige kræft og deres normale modparter har afsløret forskellige miRNA udtryk profiler. Faktisk en række undersøgelser har rapporteret forskelligt regulerede miRNA i forskellige typer kræft som brystkræft [7], lungekræft [8], kronisk lymfatisk leukæmi [9], tyktarmskræft [10], thyreoidea carcinomer [11], bugspytkirtelkræft [12], hoved- og halscancer [5], prostatacancer [13], hypofyseadenomer [14], og ovariecancer [15] – [18]. Kollektivt, disse undersøgelser viser, at nogle menneskelige miRNA konsekvent dereguleret i human cancer, hvilket tyder på en rolle for disse gener i tumorigenese. Specifikke overekspression eller underekspression af visse miRNA er blevet vist at korrelere med bestemte tumortyper [19]. Overudtrykt miRNA potentielt kunne målrette tumorsuppressorgener, mens nedreguleret miRNA teoretisk ville regulere onkogener. For eksempel

Lad-7

miRNA, der er ned reguleret i lungekræft, kan have en negativ regulerer onkogener RAS og HMGA2, giver en mekanisme til opregulering af disse onkogener [8], [20], [ ,,,0],21]. Således medlemmer af

Lad-7

familie funktion biologisk som tumorsuppressorer og deres tab forventes at fremme transformation og tumorprogression. Omvendt den menneskelige miRNA klynge

miR-17-92

fungerer som et onkogen i B-celle lymfom [22] og lungekræft [23], og kan samarbejde med

myc

[22] .

Unique miRNA ekspressions underskrifter er blevet fundet at være associeret med bio-molekylære og prognostiske karakteristika af human lungekræft og kronisk lymfatisk leukæmi [8], [24], hvilket indikerer, at miRNA signaturer kan anvendes til at definere biologisk eller kliniske funktioner i menneskelige kræftformer. Udviklingen af ​​nye miRNA-markører i den nærmeste fremtid vil udgøre et af de vigtigste mål i molekylær medicin som miRNA udtryk profiler måske bedre klassificerer dårligt differentierede tumorer i forhold til de udskrift-baserede klassificører [19].

Der er et begrænset antal undersøgelser i litteraturen om de roller, miRNA i kræft i æggestokkene. Zhang et al. rapporteret højfrekvente genomiske forandringer involverer miRNA gener i 227 humane æggestokkene, brystkræft og melanom prøver [15]. I en anden undersøgelse blev 84 væv (15 normale og 69 maligne) og 5 cellelinier analyseret for ændringer i miRNA profil [16]. Endelig en undersøgelse med en analyse 10 ovarietumorer og 10 forskellige normale kontroller blev for nylig rapporteret [17]. I denne rapport beskriver vi en række forsøg for at belyse ændringerne i miRNA udtryk i kræft i æggestokkene og til at indkredse mulige relevante kandidat miRNA.

Resultater

miRNA Expression mønstre i æggestokkene væv

mirna udtryk profiler blev bestemt til 34 ovariecancer væv (tabel 1) samt 10 ovarie cancer cellelinjer. En immortaliseret human ovarie overflade epitel-cellelinje blev anvendt som ikke-transformerede kontrol. Udtrykket profiler blev bestemt ved hjælp af miRCURY ™ LNA miRNA Arrays. LNAs er en klasse af konformationelt begrænsede nukleotidanaloger der øger affiniteten af ​​et oligonukleotid til dets komplementære RNA- eller DNA-mål. Den Exiqon miRNA array er i øjeblikket den mest omfattende sonde sæt til rådighed på et array platform og giver mulighed for en dybdegående analyse af miRNA udtryk. Efter RNA-hybridisering og array analyse blev prøver grupperet efter deres miRNA profil ved hjælp af hierarkiske clustering algoritme af JMP 6.0.0 software. Figur 1A viser hierarkisk clustering analyse af tumorvæv og cellelinier baseret på den samlede miRNA udtryk. De viste profiler er i forhold til æggestokkene overflade epithelceller (slangelignende B-celler). Prøverne opdeles i tre hovedgrupper. Den midterste klynge består udelukkende af tumorer (17 prøver), mens den venstre klynge indeholder 2 cellelinjer og 7 primære tumorer. Den rigtige klynge er beriget i cellelinjer og indeholder 8 cellelinjer ud af 18 medlemmer i klyngen. Den hierarkiske klyngedannelse blev derefter gentaget baseret på et meget mindre antal gener og omfattede kun 70 stærkt differentielt udtrykte miRNA i ovariecancer væv og cellelinier. Denne clustering analyse gav anledning til flere klynger, men igen, cellelinierne samlet i 2 forskellige klynger, mens de primære væv blev grupperet sammen (figur 1B), hvilket tyder på specifikke forskelle i miRNA ekspression mellem ovariecancer væv og cellelinier.

Tree genereret af cluster-analyse af kræft i æggestokkene væv og cellelinier baseret på (A) alle testede miRNA i væv og cellelinjer, og (B) forskelligt regulerede miRNA (Fold forandring 2,0 eller 0,5 i mere end 60 % af prøverne) i væv og cellelinier i forhold til de normale kontrolprocedurer SLANGE-B-celler.

Brug principal komponent analyse (PCA) fandt vi, at den globale miRNA udtryk kunne skelne æggestokkene kræftsvulster fra æggestokkene cancercellelinier (figur 2). Den ikke-tumorigen kontrol SLANGE-B udviste også et unikt udtryk mønster, skelnes fra begge cellelinier og væv.

To-dimensionelle PCA viser, at de globale miRNA ekspressionsmønstre er forskellige i æggestokkene cancer cellelinjer (angivet med blåt ), kræft i æggestokkene væv (angivet med grønt), og de ikke-tumorigene SLANGE-B-celler (i rødt).

differentielt udtrykte miRNA

vi så identificerede miRNA, der var forskelligt udtrykt mellem ikke-neoplastiske og neoplastiske prøver (figur 3A, tabel 2). Kun miRNA, der er blevet omformet mindst 2 gange hos mindst 60% af prøverne blev betragtet som signifikante kandidater. Ved hjælp af disse strenge kriterier, vi identificeret 25 opreguleret og 31 nedreguleret miRNA mellem kontrol- og kræft væv. Ligeledes vi identificeret 5 opreguleres og 23 nedreguleret miRNA i æggestokkene cancercellelinjer sammenlignet med ikke-neoplastiske SLANGE-B-celler. 14 miRNA blev dereguleret i både væv og cellelinier og er opført i figur 3A. Antallet af miRNA, der viste nedregulering i tumorprøver (n = 31) samt i cancercellelinier (n = 23) var højere end antallet af opreguleret (n = 25 i tumorvæv, n = 5 i cellelinjer) miRNA . Dette er i overensstemmelse med tidligere publicerede miRNA profilering undersøgelser, hvoraf de fleste har vist nedregulering af miRNA til at være mere udbredt end opregulering i kræft [8], [13], [19], [25], [26].

(A) Venn-diagram viser de numeriske miRNA differentielt udtrykte i æggestokkene cellelinjer, i kræft i æggestokkene væv og i både. For hver kategori er de miRNA forhøjede (angivet med rødt) og nedreguleret (angivet med grønt) angivet nedenfor diagrammet. (B) Den Venn-diagram viser antallet af differentielt udtrykte miRNA er identificeret i den aktuelle undersøgelse, og antallet af miRNA der identificeres i 3 tidligere æggestokkene undersøgelser kræft. De miRNA i fælles er angivet nedenfor diagrammet og farvekodede (rød: forhøjet; grøn: nedsat)

miR-221

var den mest forhøjede miRNA. i både væv og cellelinier (9 gange og 7 gange), mens

miR-21

blev signifikant reduceret i begge prøvetyper (3-fold og 9-fold, henholdsvis) (tabel 2). Blandt de forskellige

lad-7

familiemedlemmer,

Lad-7e

Lad-7f

viste mere end 2 gange deregulering i mindst 60% af tumorprøver . Den anden

Lad-7

familiemedlemmer (

Lad-7 g

,

Lad-7d

,

Lad-7c

,

lad-7a -e

,

lad-7i

,

lad-7a

,

lad-7b

ikke var nedreguleret så konsekvent, men hver enkelt af dem blev fundet faldt 2 fold eller mere i mindst 20% af tumorerne. Samlet set 94% af tumorerne havde mindst én

lad-7

familiemedlem nedreguleret mindst 2-fold. Cellelinjer udviste nedregulering af

lad-7

familiemedlemmer også.

lad-7f

blev nedreguleret mere end 4 gange i cellelinjer, mens

lad-7d

lad-7a- e

var også faldet væsentligt (mere end 2,3 gange og 2 gange, henholdsvis).

Vi sammenlignede derefter forskelligt regulerede æggestokkene miRNA identificeret i denne undersøgelse med dem rapporteret i tre tidligere undersøgelser [15] -.. [17] Ud af i alt 136 miRNA fundet dereguleret i de tidligere undersøgelser, 16 blev også identificeret i vores undersøgelse (figur 3B) af disse 16 miRNA, 9 blev nedreguleret (

lad-7d

,

miR-106b

,

miR-122a

,

miR-141

,

miR-183

,

miR-195

,

miR-200a

,

miR-335, mir424

) og 7 blev opreguleret (

miR-100

,

miR-199a

,

miR -296

,

miR-29a

,

miR-29c

,

miR-99a, mir-494

). Interessant, rapporterer vi 56 miRNA, der ikke tidligere har været fundet dereguleret i ovariecancer (figur 3B).

Forventet gen mål for miRNA gener

miRNA kan regulere et stort antal målgener og flere databaser baseret på forskellige algoritmer er tilgængelige til at forudsige målene i udvalgte miRNA. Target Skan 3.0 og PicTar blev anvendt til at forudsige genmål om uregulerede miRNA identificeret i denne undersøgelse. Tabel 2 viser den øverste 3 forudsagte mål i henhold til både Target Scan og PicTar for hver differentielt udtrykte miRNA. Der var lidt overlap mellem de mål, der er konstateret med de to forskellige databaser og kun 7 mål (FAM44B, BACH1, BCL6, HMGA2, Calu, FGF2, og TNKS2) i 7 miRNA (

Lad-7

familie,

miR-98

,

miR-155

,

miR-195

,

miR-346

,

miR-206

,

miR-335

) blev delt mellem disse to databaser, når de øverste 3 mål blev undersøgt.

Eksperimentel identifikation af miRNA mål

for yderligere at undersøge de potentielle mål for centrale æggestokkene miRNA, vi overudtrykt

miR-34c

,

miR-98

,

miR-424

, og

lad-7f

i 2 æggestokkene cancer cellelinjer (BG -1 og UCI-101).

miR-424

Lad-7f

blev nedreguleret i både væv og cellelinier (figur 3A), mens

miR-34c

miR-98

fandtes nedreguleret i ovariecancer væv og i cellelinier hhv. Figur 4 viser den vellykkede over-ekspression af miRNA 72 timer efter transfektion. Vi derefter brugt Illumina microarrays til at undersøge mRNA niveauovergange efter overekspression af disse kandidater. Tabel 3 og 4 liste udskrifter, der blev ændret mest markant efter overekspression af miRNA i BG-1 og UCI-101-cellelinjer, hhv. Interessant, disse tabeller omfatter gener, såsom

GPX3, MCM7, MSN

som tidligere har været impliceret i ovariecancer. Blandt de markant ændrede gener (absolut Z-forholdet 1,5), er der 10 kendte kræft gener (

MSN, PIM1, CBL, COL1A1, COX6C, EVI1, EXT1, HLXB9, PTPN11, TCEA1

), 4 tumor suppressor gener (

HIF1A, CAV1, GADD45A, PTTG1IP

), 26 cellecyklus gener (

ACAT2, CDK5, FDPS, ID1, LLGL1, MAD2L1, ANLN, ATAD2, C12orf48, CD9, ECT2, GADD45A, GSTO1, HSPD1, IPO7, KNTC2, KRT18, MRPS17, NUDT1, PFN1, PRKCA, SFRP1, SKP2, SNRPA1, VAMP8, WEE1

), og 6 gener involveret i kromatin remodeling (

ASF1A, GCN5L2, ATAD2, CBX2 , CBX4, NCOA3

). Meget lidt overlap blev fundet mellem den forudsagte (Pictar og Target Scan) og eksperimentelle mål. Interessant, de eksperimentelle mål varierede alt efter den anvendte cellelinie, hvilket tyder på en betydelig indflydelse af den molekylære baggrund på miRNA target udvælgelse. For at validere Illumina data, blev RT-PCR udført på 8 gener fundet at være mål for

Lad-7f Hotel (

KIF1A, ASS, FDPS, NTS

i UCI-101 celler, og

TFF1, EEF1A2, ESM1, VIM

, i BG-1 celler) (figur 5). Vi fandt, at selv de absolutte værdier var forskellige, tendenserne var de samme.

KIF1A

og

ASS

blev fundet forhøjede i UCI-101, mens

FDPS

NTS

blev nedreguleret i disse celler.

TFF1

EEF1A2

blev bekræftet at være forhøjet i BG-1, mens

ESM1

VIM

blev nedreguleret.

Pre-

miR-34c

,

Pre-miR-98

, Pre-

miR-424

, Pre-

lad-7f

blev overudtrykt i BG-1 og UCI-101. Produkterne til hver af de miRNA er vist i to eksemplarer for de to anvendte cellelinier. Betydelig overekspression af miRNA er bekræftet. RT-PCR af 18S RNA er vist for hver betingelse for at demonstrere lig belastning.

Transkripter identificeret ved Illumina arrays skal ændres efter Lad-7f overekspression valideres ved RT-PCR. Fold ændringer for gener

KIF1A, ASS, FDPS, NTS

(i UCI-101 celler), og

TFF1

,

EEF1A2, ESM1, VIM

(i BG-1 celler) vises og bekræfte ændringerne identificeret ved Illumina arrays.

Brug disse eksperimentelle mål som udgangspunkt (tabel 3 og tabel 4), vi brugte Ingenuity Pathway Analysis (IPA) for at afsløre potentielle sygdomme , molekylære funktioner, fysiologiske systemer og kanoniske pathways associeret med ekspression af disse miRNA i BG-1 (tabel 5) og UCI-101 (tabel 6). Ikke overraskende analysen identificeret “cancer” som den vigtigste sygdom associeret med disse mønstre af ekspression i begge cellelinier. GI sygdom blev også almindeligt identificeret. Interessant cellulær bevægelse, cellecyklus, og kardiovaskulære funktioner blev systemer ofte fundet at være relateret til disse ekspressionsmønstre. Der var lidt konsistens i de kanoniske veje er identificeret gennem IPA og bortset integrin signalering (fundet efter miR34c eller miR98 udtryk i BG-1), blev ingen af ​​de kanoniske veje fundet mere end én gang i tabel 5 og 6. Denne analyse foreslår derfor, at mens de generelle veje ramt af

miR-34c

,

miR-98

,

miR-424

, og

lad-7f

udtryk i disse to cellelinier er relateret til kræft, de nøjagtige molekylære veje målrettede er variable og afhænger af cellelinien og på miRNA. Dette igen peger på det høje niveau af kompleksitet miRNA target udvælgelse og regulering.