PLoS ONE: intratumor Hypoxi Fremmer immuntolerance ved at inducere Regulatory T-celler via TGF-β1 i gastrisk Cancer

Abstrakt

Regulatory T-celle (Treg) -medieret immunosuppression repræsenterer en af ​​de afgørende tumor immun unddragelse mekanismer og er en største hindring for vellykket tumorimmunterapi. Hypoksi, et fælles træk af faste tumorer, har været forbundet med potenseret immunosuppression, nedsat terapeutisk respons, malign progression og lokal invasion. Desværre forbliver forbindelsen mellem hypoxi og Treg-medieret immun tolerance i mavekræft dårligt forstået. I vores undersøgelse blev tregs og hypoxi inducerbar faktor-1α sig at være positivt korreleret med hinanden og blev forøget med tumorprogression. En efterfølgende

in vitro

undersøgelse viste, at supernatanter afledt af mavekræft celler under hypoksisk tilstand, kunne inducere ekspressionen af ​​Foxp3 via TGF-β1. Disse resultater bekræftede afgørende rolle tregs som terapeutisk target i mavekræft terapi og forudsat nyttige tanker for udformningen af ​​immunterapi til mavekræft i fremtiden

Henvisning:. Deng B, Zhu JM, Wang Y, Liu TT, Ding YB, Xiao WM, et al. (2013) intratumor Hypoxi Fremmer immuntolerance ved at inducere Regulatory T-celler via TGF-β1 i Gastric Cancer. PLoS ONE 8 (5): e63777. doi: 10,1371 /journal.pone.0063777

Redaktør: Nupur Gangopadhyay, University of Pittsburgh, USA

Modtaget: 10. januar, 2013; Accepteret: April 6, 2013; Udgivet: May 27, 2013 |

Copyright: © 2013 Deng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Shanghai Videnskab og Teknologi Kommissionen (10410709400, 10411950100), National Nature Science Foundation of China (81000968, 81101540, 81101637 og 81172273) og National Clinical Key Special Emne Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft repræsenterer en af ​​de mest almindelige årsager til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [1]. Trods betydelige fremskridt inden for diagnostiske og terapeutiske metoder i løbet af de seneste årtier, prognosen for mavekræft forbliver dystre grund af dens høje tilbagefald og metastaser [2]. Immunocytter har længe været anerkendt som en faktor, der fremmer tumorvækst i tumormikromiljøet [3], men det underliggende molekylære grundlag stort set gådefuld. En bedre forståelse af de mekanismer i mavekræft vil være gavnligt at udvikle effektive terapeutiske ordninger.

intratumor hypoxi er et fælles træk ved solide tumorer, som kan påvirke udviklingen af ​​tumorer ved at aktivere de vigtigste biokemiske og cellulære veje [4 ], [5], [6]. Undersøgelser viste også, at hypoxi spiller en central rolle i tumor-medieret immunsuppression, der bidrager til at opretholde den immunologiske udslip af tumorer [7], [8]. For nylig, er der etableret en bekræftet forbindelse mellem tumor hypoxi og immun tolerance gennem rekruttering af regulatoriske T-celler (tregs) i kræft i æggestokkene [9]. Således har en hypotese blevet præsenteret, at hypoxi kan give hindringer for terapeutiske immune interventioner.

Øget tregs er blevet rapporteret i omsætning og tumorvæv fra patienter med forskellige kræftformer, herunder mavekræft, kolorektal cancer, hepatocellulært carcinom og pancreascancer [10]. Akkumulerende data viste også, at tilstedeværelsen af ​​tregs resulterede i en øget risiko for udvikling af kræft [11], [12], [13]. Desuden er Treg-medieret immunsuppression anses for at være en af ​​de afgørende immun unddragelse mekanismer i tumor, hvorved de er i stand til at overvinde den antitumoraktiviteten af ​​CD8 cytotoksiske celle, dendritisk celle og naturlig dræber cellen [14]. Således vil belysningen af ​​mekanismen bag Treg berigelse i gastrisk cancer være værdifulde ved målretning tregs for en gavnlig klinisk resultat. Selvom de mekanismer ikke er godt forstået, har nogle undersøgelser vist, at TGF-β1 er involveret i det [15].

I denne undersøgelse vi hypotese, at mavekræft kan erhverve en selektiv fordel ved induktion af tregs under hypoxi via TGF-β1 signalvejen således omgå immun overvågning. At vise vores hypotese analyserede vi ekspressionen af ​​hypoxi inducerbar faktor-1α (HIF-1α) og Foxp3 i gastrisk cancer væv, vurderede effekten af ​​hypoxi på TGF-β1 produktion i cancer-cellelinjer, og endelig belyst rollen af ​​hypoxi medierende treg berigelse i mavekræft.

Materialer og metoder

patienter og Prøver

Paraffin-embedded, formalin-fikseret tumor sektioner blev opnået fra 99 patienter med mavekræft, der undergik kirurgisk resektion fra december 2006 til februar 2008 på anden kliniske Medical School i Yangzhou Universitet. Opfølgende data blev sammenfattes af oktober 2012 med en median opfølgning på 53 måneder (interval 4-70 måneder). Samlet overlevelse (OS) blev defineret som fra tidspunktet for kirurgi til sidste opfølgning eller dødstidspunktet.

Perifere blodprøver blev indsamlet fra 20 patienter med mavekræft én dag før og 10 dage efter operationen i juli 2012 til oktober 2012. Sera blev frosset ved -80 ° C umiddelbart efter centrifugering til fremtidig brug. Perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) blev isoleret umiddelbart af en Ficoll-densitetsgradient.

Ingen af ​​patienterne havde modtaget immunsuppressive lægemidler eller kemoterapi før kirurgisk resektion. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité (etiske komité af Second Klinisk Medical School of Yangzhou University, Yangzhou), og skriftlige informerede samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere.

immunhistokemisk farvning

Serial sektioner (5 um) af formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver blev foretaget. Snit blev afparaffiniseret og rehydreret i gradueret alkohol. Antigen genfinding blev udført ved behandling af objektglassene i EDTA-puffer i en mikrobølgeovn i 10 minutter. Kanin-anti-humant HIF-1α primære antistof (Bioworld, USA), muse-anti-humant TGF-β1-antistof (Santa Cruz, USA) og muse-anti-humant Foxp3 antistof (Abcam, USA) blev anvendt til de primære antistoffer. Diaminobenzidin (DAB) blev anvendt til substratet efter kontrafarvning med hæmatoxylin for enkelt farvning. Dobbelt farvning blev udført med 2 forskellige chromogener:. DAB kromogen (brun farve) for HIF-1α og hurtigt rød chromogen (rød farve) til TGF-β1 eller Foxp3

Immunreaktivitet Scoring

HIF -1α nucleus farvning blev evalueret efter den rapporterede fremgangsmåde [16], farvning score = intensiteten af ​​immunreaktivitet (IR) × andelen af ​​positivt farvede celler. IR intensitet blev stratificeret i fire kategorier: 0, ingen IR; 1, svag IR; 2, moderat stærk IR; og 3, stærk IR. Andelen af ​​positive celler blev klassificeret i fem grupper: 0, ingen farvning; 1, 2% farvning; 2, 2-10% farvning; 3, 11-29% farvning; og 4, . 30% farvning

En modificeret pointsystem blev anvendt til Foxp3

+ -celler [17]. Ti felter blev talt ved high-power for Foxp3. Det absolutte antal af lymfocytter pr high-power field (HPF 400) blev bestemt. Det gennemsnitlige antal positive farvede celler pr high-power felter blev beregnet.

Cell Kultur og Hypoxi Induktion

Humane gastriske cancer cellelinjer, AGS og BGC823, blev indhentet fra Shanghai Institute of Cell Biologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Alle celler blev opformeret i 5% CO

2 ved 37 ° C i DMEM eller RPMI 1640 (HyClone Tianjin, Kina) suppleret med 10% FBS (Gibco, Australien), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin ( HyClone Tianjin, Kina). For hypoksi eksperimenter blev celler udsået i plader med 6 brønde, vasket to gange med PBS, når de voksede til 60-80% konfluens, holdes i serumfrit AIMV medium (Invitrogen, USA) i en inkubation natten over, og derefter anbragt i en modulær inkubator kammer (Ruskinn Works, YK) i 24 timer under hypoxiske (1,0% O

2) eller normoxisk (21% O

2) betingelser, begge med 5% CO

2 ved 37 ° C. Supernatanter blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C til senere bestemmelse af koncentrationer af TGF-β1 og for co-kultur-assay. Alle

in vitro

validering eksperimenter blev udført mindst tre eksemplarer.

Immunofluorescens

Cellerne (1 × 10

5 /brønd) blev udsået på dækglas i en plade til en 24 timer kultur 24 brønde. Efterfølgende blev de fikseret i kold methanol i 30 min til permeabiliseres med 0,5% Triton X-100 i yderligere 30 minutter. Celler blev vasket tre gange, blokeret med 10% gedeserum i PBS i 30 min, og inkuberet med anti-humant TGF-β1-antistof (Santa Cruz, USA) og anti-humant HIF-1α antistof (Epitomics, USA) i en fryser ved 4 ° C natten over. Det primære antistof blev påvist via Alexa488-konjugeret andet antistof (Invitrogen, USA) og Alexa Fluor 594-konjugeret andet antistof (Invitrogen, USA) hhv. Dækglassene blev undersøgt under OLYMPUS fluorescens mikroskopi.

RNA Extraction og kvantitativ real-time PCR (qPCR)

Hver af de to cellelinjer beskrevet ovenfor blev dyrket i tre brønde under normoxisk eller hypoxiske betingelser som beskrevet ovenfor. Totalt RNA blev straks isoleret fra normoksiske eller hypoxiske celler ved afslutningen af ​​forsøget, under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, USA). Totalt RNA (5 ng) blev revers transkriberet under anvendelse af cDNA revers transskription kits (Takara, Dalian, Kina), i henhold til producentens anvisninger. qPCR blev udført på en SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Dalian, Kina). Fold ændringer i ekspressionen af ​​hvert TGF-β1 mRNA i forhold til GAPDH blev beregnet baseret på tærsklen cyklus (Ct) som 2

-Δ

(ACt), hvor ACt = Ct

target – Ct

GAPDH og Δ (ACt) = ACt

hypoxi – ACt

normoxi. De TGF-p1-primere var: forward, 5′-GCCAG AGTGG TTATC TTTTG ATG-3 ‘; omvendt, 5’AGTGT GTTAT CCCTG CTGTC AC -3 “, og GAPDH primere var: fremad, 5’GGACC TGACC TGCCG TCTAG AA-3 ‘; omvendt, 5’-GGTGT CGCTG TT GAAGT CAGAG-3 ‘. qPCR blev udført tre gange.

enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA)

Koncentrationen af ​​TGF-β1 i kultursupernatanterne, og sera blev bestemt ved anvendelse af et ELISA-kit (eBioscience, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner.

Isolering og dyrkning af T-celler

PBMC’er fra donorer blev indirekte mærket med biotin-antistof bocktail og anti-biotin mikroperler. CD4

+ T-celler blev separeret ved negativ udvælgelse i overensstemmelse med producentens instruktioner (Miltenyi Biotec, Tyskland). CD4

+ T-celler blev direkte mærket med CD25 mikroperler og CD4

+ CD25

– T-celler blev isoleret ved negativ selektion i overensstemmelse med producentens instruktioner (renhed 95%; Miltenyi Biotec, Tyskland) . De indsamlede fra dyrkede AGS celler under normoxiske eller hypoxiske betingelser supernatanter blev fortyndet med frisk AIMV medium (01:03), kaldet normoxisk medium og hypoxisk medium hhv. I alt 1,0 x 10

6 /ml CD4

+ CD25

– T-celler blev stimuleret med anti-CD3 /CD28-overtrukne perler (01:05; Invitrogen, USA) ± IL-2 (200 U /ml; PeproTech) i 72 timer i AIM-V serumfrit medium (kontrolmedium), normoxisk medium eller hypoksisk medium. I nogle eksperimenter rekombinant human TGF-β1 (2 ng /ml, R 0,05

Resultater

HIF-1α og Foxp3 Expression i Gastric Cancer væv

Efter histologisk bekræftelse af gastrisk cancer (fig. 1A, øverste venstre og ned-venstre), undersøgte vi ekspressionen af ​​HIF-1α og Foxp3 ved immunohistokemi i 99 patienter. HIF-1α med lav ekspression (fig. 1A, øvre) og høj ekspression (fig. 1A, ned) viste sig overvejende i cytoplasmaet og kernen af ​​cancerceller ved tumor margin, og kun nuklear HIF-1α farvning blev scoret. Det er interessant at bemærke, at i nogle tilfælde, lymfocytter viste også stærk ekspression af HIF-1α. Foxp3 med lav udtryk (fig. 1A, øverste højre) og høj ekspression (fig. 1A, ned-højre) blev set i kernen af ​​lymfocytter, hvoraf de fleste blev placeret på tumoren margen.

( A) Foxp3 og HIF-1α ekspression i gastrisk cancer prøver (serielle sektioner) blev bestemt ved H × 400 (mellemværker); Værdier repræsenterer middel ± SEM. *

P

. 0,001

Dernæst udtryk for HIF-1α og Foxp3 i tumorvæv blev sammenlignet hos patienter med nonnmetastatisk (n = 52) og metastatisk (n = 47) gastrisk cancer. Både den gennemsnitlige score for HIF-1α og antallet af Foxp3

+ celler i metastatiske patienter var højere end i nonnmetastatisk patienter (HIF-1α, 7,69 ± 0,45 vs 5,41 ± 0,40,

P

0,001 fig 1B, til venstre;. Foxp3, 14,61 ± 1,01 vs 8,07 ± 0,95,

P

0,001, figur 1B, højre)

Forholdet mellem OS og HIF-1α eller Foxp3.. i Gastric Cancer væv

Som sidste opfølgning, 50 af 99 (50,5%) patienter var i live, med en median opfølgning på 64 måneder (interval 57-70), mens 49 var død af sygdom , med en median tid til død 28 måneder (spændvidde 4-64). At belyse forholdet mellem ekspressionen af ​​HIF-1α eller Foxp3 og OS, blev HIF-1α kategoriseret som negative (n = 34; scores ≤4) eller positiv (n = 65; scores 4), mens Foxp3 blev kategoriseret som lav (n = 51F) eller høj (n = 48) under anvendelse middelantallet (8,6 celler /HPF) som cutoff. I vores undersøgelse OS i Foxp3-low-gruppen var signifikant højere end i Foxp3-high gruppe (

P

= 0,017, fig. 1C, venstre), mens HIF-1α-negative gruppe var signifikant højere end HIF -1α-positive gruppe (

P

= 0,009, Fig.1C, højre).

associering mellem HIF-1α eller Foxp3 og Clinicopathologic Karakteristik

sammenhængen mellem klinisk-patologiske træk og ekspression af HIF-1α eller Foxp3 blev efterfølgende evalueret (tabel 1). Ingen korrelation blev fundet mellem HIF-1α eller Foxp3 udtryk og alder eller køn af patienter, samt tumorstørrelse. Men der var en stigning i den positive sats for HIF-1α med dybden af ​​tumor invasion (

P =

0,013). En lignende tendens blev også fundet mellem ekspression af HIF-1α (

P

0,001) eller Foxp3 (

P

= 0,008) og tumor stadie. Desuden blev en signifikant sammenhæng fundet mellem lymfeknude metastaser og udtryk for HIF-1α (

P

= 0,029) eller Foxp3 (

P

0,001).

Forholdet mellem HIF-1α og Foxp3 eller TGF-β1 i Gastric Cancer væv

ovennævnte immunhistokemisk resultat viste, at antallet af Foxp3

+ celler var stærk positiv korrelation med score på HIF-1α hos patienter med metastaser

(r

= 0,772,

P

0,001;. figur 2A, til venstre), men ikke hos patienter uden metastaser (

r =

0,461,

P

= 0,001;. figur 2A, højre). Vi udførte derefter immunohistokemisk dobbelt-farvning til at evaluere forekomsten af ​​coekspression mellem HIF-1α og Foxp3 eller TGF-β1. Resultaterne viste, at Foxp3

+ -celler overvejende samles i de steder tæt på hypoxisk tumor region med høj HIF-1α ekspression (fig. 2B). Desuden har de fleste høje HIF-1α tumorceller var høj ekspression af TGF-β1 (Fig. 2C).

(A) Sammenhængen af ​​HIF-1α og Foxp3 i metastatisk (til venstre) og nonnmetastatisk tumor (til højre) som bestemt ved hjælp af immunhistokemi farvning. (B) Dobbelt farvning af HIF-1α (brun, kerne af kræftceller) og Foxp3 (rød, kerne af lymfocytter). Røde pile angivet tumorceller, der udtrykker høj HIF-1α, og blå pile Foxp3

+ -celler. (C) Dobbelt farvning af HIF-1α (brun, kerne af kræftceller) og TGF-β1 (rød, cytoplasma af kræftceller). Røde pile angivet tumorceller coudtrykker høj HIF-1α og TGF-β1, og blå pilene for høj HIF-1α. Original forstørrelse × 200.

Cirkulerende tregs og TGF-β1 i Pre-kirurgi og Post-kirurgi Patienter

For at belyse forholdet mellem tregs og koncentrationen af ​​TGF-β1 i serum, CD4

+ Foxp3

+ T-celler blev analyseret i patienter med gastrisk cancer via flowcytometri (fig. 3A). Hyppigheden af ​​tregs før operation var højere end efter operationen (9,84 ± 0,40% vs. 8,47 ± 0,33%,

P

0,001, figur 3B.). TGF-p1-koncentrationer efter operationen faldt betydeligt sammenlignet med dem, før operation (6431,95 ± 629.24 vs 7581,56 ± 556.45 pg /ml,

P

= 0,005, fig. 3C). En positiv korrelation mellem treg frekvens og TGF-β1 koncentration blev fundet i serum før drift (

r

= 0,454,

P

= 0,044, Fig. 3D).

( A) Repræsentative plots viste frekvensen af ​​CD4

+ Foxp3

+ T-celler før og 10 dage efter kirurgi i det perifere blod af gastrisk cancer patient, som bestemt ved flow-cytometrisk analyse. (B) Et histogram viste frekvensen af ​​CD4

+ Foxp3

+ T-celler i perifert blod fra mavecancerpatienter før og 10 dage efter kirurgi. (C) Et histogram viste koncentrationen af ​​TGF-β1 i perifert blod fra mavecancerpatienter før og 10 dage efter kirurgi. (D) Korrelation af CD4

+ Foxp3

+ T-celler frekvens og koncentration TGF-β1 i perifert blod fra 20 patienter mavekræft før operation. Værdier repræsenterer middel ± SEM. *

P

. 0,001

TGF-β1 er stærkt opreguleret i Gastric Cancer Cell Lines under Hypoxi

For at identificere, om hypoxi inducerer udskillelsen af ​​TGF β1 i gastriske cancerceller blev TGF-p1-niveauer undersøgt i to gastriske cancer cellelinjer, AGS og BGC823, under hypoxiske eller normoxiske betingelser. MRNA ekspression af TGF-β1 under hypoksi blev forøget sammenlignet med normoksiske betingelser (fig. 4A). I overensstemmelse med qPCR, TGF-p1-niveauer i kultursupernatant viste lignende resultater (fig. 4B). Desuden blev udtrykkene for TGF-β1 og HIF-1α også detekteret ved immunfluorescens, og resultaterne viste forøget TGF-β1 og HIF-1α ekspression under hypoxiske betingelser i sammenligning med den for under normoxiske betingelser (fig. 4, C).

. (A) Et histogram viste mRNA ekspression af TGF-β1 i AGS og BGC823 cellelinier. (B) Et histogram viste TGF-β1 niveau i kultursupernatanten af ​​de to cellelinier. (C) Immunfluorescerende dobbelt farvning viste TGF-β1 og HIF-1α ekspression i de to cellelinier. Alexa fluor594 (nuklear rød), Alexa488 (indocarbocyanin grøn) og DAPI (nuklear-modfarvning blå). Oprindelig forstørrelse x 200. Værdier repræsenterer middel ± SEM. * P. 0,001

Hypoxi forøger evnen inducere tregs via TGF-β1 i gastrisk kræftcellelinjer

For at teste hypotesen om, at hypoxi-induceret TGF-β1 bidrager til forøgelse af tregs, cirkulerende CD4

+ CD25

– T-celler fra raske individer blev behandlet med supernatanter fra celler under forskellige betingelser. Dot plots viste forskellige medier inducerer ekspressionen af ​​Foxp3 i CD4

+ T-celler (fig. 5A). Den Foxp3 ekspression af T-celler i normoxisk medium, hypoksisk medium og rekombinant human TGF-β1 medium blev alle steget sammenlignet med kontrolgruppen medium (

P

0,001). Desuden Foxp3 ekspression i hypoksiske medium var signifikant højere end i normoxisk medium (13.04 ± 0,74% versus 6,76 ± 0,35%,

P

0,001, figur 5B.). Endvidere, som LY-364.947 blev sat til hver slags medium, den Foxp3 udtryk faldt åbenlyst (

P

. 0,001, figur 5C).

(A) Repræsentative parceller viste Foxp3 udtryk i CD4

+ CD25

– T-celler dyrket med forskellige medier i 72 timer. Supernatanterne af AGS-celler dyrket under normoxiske eller hypoxisk tilstand blev kaldt normoxisk medium og hypoxisk medium, hvorimod AIM-V-medium med eller uden rekombinant humant TGF-β1 (reTGF-β1) blev betegnet reTGF-β1 medium og kontrolmedium henholdsvis . (B) Et histogram viste Foxp3 ekspression i CD4

+ CD25

– T-celler dyrket med forskellige medier. (C) Et histogram viste, at TGF-β1 receptor kinase inhibitor LY-364.947 (TGF-β1 In) delvis ablaterer den indution af Foxp3 i CD4

+ CD25

– T-celler dyrket i forskellige medier. Værdier repræsenterer middel ± SEM. *

P

. 0,001

Diskussion

Gennem det seneste årti, har nye beviser foreslået, at tregs bidrage til etableringen af ​​tumorer ved at svække antitumor immune reaktion, eller endog stimulere metastase direkte [18], [19]. Beviser opnået i de seneste år påviste øget hyppighed af intratumorale tregs i gastrisk kræft, der har været forbundet med ugunstige klinisk-patologiske træk og dårlig prognose [20], [21], [22]. I overensstemmelse med disse tidligere rapporterede resultater, vores undersøgelse dokumenteret, at hyppigheden af ​​tumor-infiltrerende tregs steget med fremrykkende tumor etaper. Desuden tregs gav også en prognose faktor for post-kirurgi af mavekræft. Desuden har vi bekræftet, at antallet af tregs i metastatisk gastrisk kræft er betydeligt højere end i nonnmetastatisk mavekræft. De ovennævnte resultater støtte den forestilling, at tregs kan bidrage til tumorudvikling og kan være en potentiel terapeutisk mål for mavekræft. Vi dermed næste forsøgt at udforske den underliggende mekanisme medierende treg berigelse i mavekræft.

Tumor hypoxi er godt anerkendt som en vigtig faktor, der følger i behandling modstand og dårlig prognose for mavekræft [6], [16], [ ,,,0],23]. HIF-1α, som den primære molekylære signatur for hypoxi, er det vigtigste nedstrøms regulator af den hypoxiske respons i tumorceller [24]. Resultater fra vores undersøgelse viste, at HIF-1α korreleret med en ondartet adfærd kategori, herunder dybde af invasion, lymfeknude metastaser og fremme tumor stadie. Påfaldende, gastric cancer patienter med høj HIF-1α havde dårligere overlevelse end dem med lav HIF-1α, hvilket yderligere styrket vores forslag om, at HIF-1α, eller rettere hypoxi, er forbundet med udviklingen af ​​gastrisk cancer.

det har længe været erkendt, at tumorceller er beskyttet mod immune skader i hypoksiske tumorceller mikromiljøer; Men de underliggende mekanismer stadig under kontrol [25]. Hvad nu, er lidt om, hvorvidt der er en sammenhæng mellem hypoxi og Treg-medieret immunsuppression i tumorer. Adskillige nyere undersøgelser har studeret hypoxisk regulering af tregs, med modstridende resultater. Ben-Shoshan

et al.

[26] rapporterede, at hypoxi øger antallet og suppressive egenskaber af tregs at diktere en antiinflammatorisk program. Wei

et al.

[7] bekræftede også, at hypoxi øger evnen af ​​glioblastoma multiforme at inducere tregs, og spiller således en central rolle i tumor-medieret immunsuppression. Men Dang et al. [27] fandt, at HIF-1α hæmmer treg differentiering ved at målrette Foxp3 protein til nedbrydning. I vores undersøgelse præsenterede vi en stærkt positiv korrelation mellem tregs nummer og HIF-1α ekspression, hvilket antyder, at hypoxi kan bidrage til tregs infiltration i gastrisk cancer. Det er værd at bemærke, at i vores studier, var de fleste tregs placeret i området tæt på cancerceller, der udtrykker HIF-1α. Således er der behov for yderligere belysning af, om hypoxi-associerede molekyler frigives fra kræftceller bidrager til berigelse af tregs i mavekræft.

Mens de er involveret i berigelse af tregs i tumorer mekanismer er stadig ikke godt forstået, vi og andre forskere har for nylig vist, at tumorceller kan tjene som en kilde til TGF-β1, som er nødvendig til induktion og vedligeholdelse af tregs

in vitro

in vivo

[28], [29], [30]. I den aktuelle undersøgelse, hyppigheden af ​​tregs og TGF-β1 i omløb før operation var højere end efter operationen, og de to parametre viste en positiv korrelation, hvilket antyder, at tumor-afledt TGF-β1 kan bidrage til en forøgelse af tregs i gastrisk cancer.

Hypoxi, et fælles træk ved cancerformer, kan inducere kræftceller til hemmelige immunosuppressive cytokiner, herunder TGF-β1 [7], [31]. Resultater fra vores undersøgelse viste de fleste høj TGF-p1-celler var cancerceller, der udtrykker HIF-1α i tumorer. En

in vitro

undersøgelse viste ekspressionen af ​​TGF-β1 forøgede i højere grad i gastriske cancerceller under hypoxiske kultur, hvilket også er i overensstemmelse med ovennævnte undersøgelser. Baseret på vores resultater, vi den hypotese, at cancerceller secernerer TGF-β1 til at inducere produktion af tregs i gastrisk cancer. For at teste vores hypotese, isoleret CD4

+ CD25

– T-celler fra raske individer blev dyrket i fortyndede supernatanter af tumorceller under forskellige dyrkningsbetingelser. Resultaterne viste, at Foxp3 ekspression af T-celler dyrket i hypoksiske medium var væsentligt højere end celler dyrket i normoxisk medium. Endvidere tilføjer ekstra rekombinant human TGF-β1 markant øget Foxp3 ekspression, hvorimod tilsætning LY-364.947, et TGF-β1-receptor-inhibitor, reduceret Foxp3 ekspression. Således er disse resultater etablere en direkte forbindelse mellem hypoxi, TGF-β1 og tregs i mavekræft.

Men vores indledende undersøgelse viste også, at TGF-β1 var uændret ved HIF-1α stabilisator, cobaltchlorid (CoCl

2), eller HIF-1α-inhibitor, 2-methoxyestradiol (2ME2) ​​i AGS og BGC823, selvom HIF-1α blev forøget af hypoxi (data ikke vist). Disse resultater antydede, at HIF-1α kan være ikke-associeret med induktion af TGF-β1 i gastriske cancerceller under hypoxi, hvilket er konsistent med tidligere undersøgelse [32]. Endvidere bør produktion af tregs kunne ikke helt ablateres ved at blokere TGF-β1, hvilket indikerer, at andre cytokiner eller veje også kan være involveret. Desuden cancerceller er ikke den eneste kilde til cytokiner inden for tumormikromiljøet. Således er der behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte den underliggende mekanisme af treg ophobning i mavekræft.

Som konklusion nærværende undersøgelse viste, at hypoxi forstærker evne mavekræft at unddrage sig immune overvågning af opregulering af ekspressionen af TGF-β1, hvorved der induceres tregs i tumorer. Endvidere vores data leveres også beviser for eksistensen af ​​intercellulære krydstale mellem tumorceller og tregs, som kunne regulere anti-tumor immunrespons.