PLoS ONE: Fund af en 29-Gene Panel i perifert blod mononukleære celler til påvisning af kolorektal cancer og adenomer Brug High Throughput Real-Time PCR

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag af cancer-relaterede dødsfald i de udviklede lande. Tidlig påvisning af CRC fører til nedsat CRC dødelighed. En blod-baserede CRC screening test er meget ønskeligt på grund af begrænsede invasionsevne og høj accept blandt patienter sammenlignet med i øjeblikket anvendes fækal okkult blod test og koloskopi. Her beskriver vi opdagelsen og validering af en 29-gen panel i perifere mononukleære blodceller (PBMC) til påvisning af CRC og adenomatøse polypper (AP). Blodprøver blev prospektivt indsamlet fra et multicenter, case-kontrol studie. Først, vi profileret 93 prøver med 667 kandidatlande og 3 referencepunkter gener ved højt gennemløb real-time PCR (OpenArray system). Efter analyse blev 160 gener bevares og testet igen på 51 yderligere prøver. Lave udtrykte og ustabile gener blev kasseret giver en endelig datasæt af 144 prøver profileret med 140 gener. For at definere, hvilke gener, alene eller i kombinationer havde det største potentiale til at skelne AP og /eller CRC fra kontroller blev data analyseret ved en kombination af univariate og multivariate metoder. En liste med 29 potentielt diskriminant gener blev udarbejdet og evalueret for sin prædiktive nøjagtighed ved straffet logistisk regression og bootstrap. Denne metode diskrimineret AP 1 cm og CRC fra kontroller med en følsomhed på 59% og 75%, henholdsvis med 91% specificitet. Opførslen af ​​29-gen panel blev valideret med en LightCycler 480 real-time PCR-platform, der almindeligvis er vedtaget af kliniske laboratorier. I dette arbejde identificerede vi et 29-gen panel udtrykt i PBMC, som kan bruges til at udvikle en hidtil ukendt minimalt invasiv test til nøjagtig detektion af AP og CRC anvendelse af en standard realtids-PCR platform

Henvisning:. Ciarloni L, Hosseinian S, Monnier-Benoit S, Imaizumi N, Dorta G, Ruegg C, et al. (2015) Opdagelsen af ​​en 29-Gene Panel i perifert blod mononukleære celler til påvisning af kolorektal cancer og adenomer Brug High Throughput Real-Time PCR. PLoS ONE 10 (4): e0123904. doi: 10,1371 /journal.pone.0123904

Academic Redaktør: Antonio Moschetta, IRCCS Istituto Oncologico Giovanni Paolo II, ITALIEN

Modtaget: 8. december 2014 Accepteret: 27 februar 2015; Udgivet: 13 April, 2015

Copyright: © 2015 Ciarloni et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Diagnoplex SA. Den bidragyder ydet støtte i form af lønninger til forfattere LC, NI, SMB, SH, men havde ikke nogen ekstra rolle i dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i forfatter bidrag «sektion

Konkurrerende interesser:. LC SH SMB NI var medarbejdere i Diagnoplex SA på tidspunktet for undersøgelsen. Også, de ejer aktieoptioner i Diagnoplex SA. CR er medstifter, advisory board medlem og ejer aktier i Diagnoplex SA. GD har fungeret som taler, konsulent og advisory board medlem i Diagnoplex SA, og har modtaget forskningsmidler fra Diagnoplex SA. Dette ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform og anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald blandt mænd og kvinder i Europa [1]. Vigtigere er det, CRC er ofte helbredes, når diagnosticeret på tidlige stadier. Desuden detektering og fjernelse af adenomatøs polypose (AP) forhindrer CRC dannelse og mindsker dødeligheden på grund af CRC. Flere lande har allerede vedtaget screening modaliteter for CRC og kliniske retningslinjer anbefaler, at gennemsnitlig risiko individer begynde regelmæssig screening på 50 år [2, 3]

koloskopi er “gold standard” for AP og CRC diagnose, men det er ikke den foretrukne metode til masse-screening på grund af omkostningerne, invasionsevne, lav overholdelse og begrænset tilgængelighed. Aktuelt anbefales ikke-invasive metoder til masse-screening omfatter immunokemiske og guaiac fækal okkult blod test (iFOBT, gFOBT). Endnu, overholdelse af fecal test er stadig ikke optimal i lande med et FOBT screeningsprogram [4, 5, 6]. Derfor er der stadig et stort udækket behov kræver et ikke- eller minimalt invasiv, kompatibel, omkostningseffektiv og nøjagtig screening test til påvisning AP og CRC på tidlige stadier. En blod-baserede screeningtest er meget attraktive på grund af sin minimale invasionsevne og høj accept blandt patienter. Især har vi og andre rapporterede signaturer afledt af mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) genekspressionsprofiler forbundet med fordøjelsessystemet [7, 8, 9, 10], bryst [11], renal [12, 13], pulmonal [14] og blære kræft [15]. Disse tests er begrebsmæssigt forskellige fra klassiske tumor biomarkør tests, da de er baseret på påvisning af værtens respons på tumor-afledte signaler [16, 17] snarere end på markører oprindelse fra selve svulsten.

Når du søger for forskelle i genekspression og identifikation af RNA-transkripter, der efterfølgende anvendes som potentielle biomarkører, almindeligt anvendte metoder omfatter microarray-baserede DNA-hybridisering platforme eller RNA-baseret sekventeringsteknikker [18, 19]. Selvom kraftfuld, disse metoder er komplekse, tidskrævende og dyrt, og generere store mængder af data, der kræver specialiseret bioinformatiske værktøjer og kompetencer for deres analyse. Desuden identificerede gener af interesse kræver yderligere validering af mere præcise og følsomme metoder, såsom real-time qPCR, før de kan omsættes til klinisk anvendelige tests [20]. Som alternativ til disse teknikker, demonstrerede højt gennemløb realtid qPCR platforme til at klare sig godt, når kandidat-gen selektion var drevet af solide videnskabelige beviser, på trods af det faktum, at de tillader en analyse af kun en brøkdel af transkriptomet [21]. Vigtigere, biomarkør opdagelser baseret på qPCR lad har den store fordel, at en yderligere validering trin i betragtning af deres kliniske anvendelse ikke er påkrævet. Desuden er de væsentligt billigere end hele genomet tilgange, således at analysen af ​​en større prøve sæt og dermed øge den statistiske styrke af undersøgelsen.

Her rapporterer vi opdagelse og karakterisering af en 29-gen panel i PBMC til påvisning af kolorektale adenomer og karcinomer bruger nanoliter high throughput qPCR platform (OpenArray) [22]. Til dette formål brugte vi prøver fremadrettet indsamlet fra et multicenter, case-kontrol undersøgelse, hvor patienterne blev henvist til koloskopi eller planlagt til operation for CRC fjernelse. Vi har også påvist, at genet panelet kunne let overføres og implementeres i et medicinsk laboratorium-venlige assay, som er et vigtigt skridt i udviklingen af ​​en ny omkostningseffektiv, enkel blod-baserede kolorektal cancer screening test.

Materiale og metoder

Patienter

En case-kontrol undersøgelse (DGNP-COL-0310), herunder tre sydkoreanske og seks schweiziske centre, som er indskrevet 1665 emner ældre end 50 år, der blev henvist til koloskopi af praktiserende læge eller var planlagt til operation, blev gennemført fra juni 2010 til april 2013. undersøgelsen blev specielt udtænkt og designet til udvikling og validering af en ny test for CRC screening. Den biomarkør opdagelse fase fandt sted i løbet af første halvdel af patientrekruttering. Til dette formål, en delmængde af 144 forsøgspersoner, afsat til at styre, CRC og AP-grupper (tabel 1), blev tilfældigt udvalgt, og anvendes til genekspression profilering af high throughput qPCR.

Emner havde nogen første grads familiehistorie med CRC eller en kendt CRC disposition, tidligere historie af polypper eller kræft, herunder CRC, ingen hepatobiliære, urogenitale, autoimmune og inflammatoriske sygdomme, herunder inflammatoriske tarmsygdomme, infektionssygdomme og feber inden for 4 uger før koloskopi. Kroniske sygdomme fælles i den gamle befolkning, såsom diabetes, hypertension, hyperkolesterolæmi, hjertesvigt, blev ikke anset som udelukkelseskriterier. En kontrol emne blev defineret som en person uden nogen fortid og nutid historie kolorektale læsioner eller sygdomme (fx små adenomer, hyperplastiske polypper, kræft). AP inkluderede individer diagnosticeret med en adenom større end 1 cm, baseret på den endoskopiske måling. CRC-gruppen omfattede patienter med carcinom på alle fire TNM etaper. Endelig diagnose var baseret på koloskopi og histopatologiske vurdering.

Etisk godkendelse

Undersøgelsen protokol (DGNP-COL-0310) blev godkendt af de kompetente anmeldelse boards og etiske komiteer til forskning på menneskelige emner af Canton Bern, Schweiz (Kantonale Etikkommission Berne, No KEK 139/10), Canton St. Gallen, Schweiz (Ethikkommission des Kantons St. Gallen, No. EKSG 10/091 /1B), Canton Vaud, Schweiz (Kommissionens Cantonale d’éthique de la recherche sur l’être menneske, No. VD 77/10), Canton Basel, Schweiz (Ethikkommission Beider Basel, No. EKBB 242/10), af Severance Hospital, Yonsei University College of Medicine, Sydkorea (nr 4-2010-0128) og af Institutional Bioetik Review Board of Seoul National University Hospital, Sydkorea (IRB nr H-1004-020-315). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle undersøgelsens deltagere klæber til de lokale etiske retningslinjer.

Blood indsamling og behandling

Perifert blod fra alle fag blev udarbejdet enten op til 30 dage før eller op til 12 uger efter koloskopi og forud for enhver polyp eller cancer resektion eller præoperativ kemoterapi. Blodprøver blev opsamlet i 4×4 ml BD Vacutainer CPT-rør (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Fyldte CPT rør blev holdt ved stuetemperatur og PBMC adskillelse udføres inden for 6 timer efter producentens anvisninger. PBMC blev resuspenderet i RNA

senere

Solution (Life Technologies, Carlsbad, CA) og opbevaret ved -80 ° C.

RNA-præparat

Automatiseret rensning af totalt RNA var udført på QIAcube af RNeasy Mini kit (Qiagen, Venlo, Holland) og omfattede en DNase-behandling. RNA-koncentrationen blev målt ved NanoDrop spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, MA) og RNA integritet blev analyseret ved Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Prøver med et RIN 7 blev anset af ringe kvalitet og kasseret. I gennemsnit RNA viste en RIN på 9 ± 0,5. Isolerede totalt RNA blev alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C. For at opfylde de høje RNA-koncentrationen kræves af RT-protokol blev RNA-prøver systematisk udfældet efter en standard 100% ethanol /3M natriumacetat metode.

Screening design og datasæt generation

For at finde relevante blod biomarkører for CRC, vi udførte genekspression screening på 144 prøver, der stammer fra patienter med AP eller CRC og kontrolpersoner. Screeningen blev udtænkt i 2 faser (fig 1). Først, vi profileret 93 prøver med et stort gen panel. Panelet omfattede 667 kandidat, hvoraf 42 biomarkører tidligere identificeret ved vores laboratorium [8] og 625 ny kandidat valgt fra litteraturen (S1 tabel). blev også tilføjet tre referencepunkter gener for qPCR data normalisering. Søgningen litteratur fokuseret på gener, molekylære veje og biologiske processer, der anses for at være relevante i tumoren-host reaktion, såsom inflammation og immunreaktion, tumorinvasion og metastase, hæmatopoiese, signaltransduktionsveje (navnlig NF-kB-vejen), chemokiner og cytokiner (især IL-1, IL-2), ekstracellulære matrixproteiner, adhæsionsmolekyler og celleoverflademarkører. For hver kandidat gen blev et TaqMan assay valgt fra en kommerciel repository (Life technologies, Carlsbad, CA) (S1 tabel) og fordeles i tre 224-assay Open Array plader, der hver måler 12 prøver parallelt. Derfor, for at fuldt profil 12 prøver, tre 224-assayplader, termocykliseret parallelt, blev anvendt. For at kontrollere for inter-plade variation og reproducerbarhed blev henvisningen gen RPLP0 analyseret for hver prøve på alle 3 plader. RPLP0 standardafvigelse (SD) analyse af de 3 prøver replikater viste en median SD af 0,21 Ct, med en inter-kvartil intervallet fra 0,14 til 0,34, hvilket indikerer, at prøven måling var nøjagtige og meget reproducerbar tværs af 3-plade serie. I denne fase vi fokuseret på at fange den bredeste emne biologiske variabilitet i stedet minimere teknisk, derfor systematiske prøve replikater blev ikke udført, at tillade profilering af et maksimalt antal prøver.

I første screening fase udførte på OpenArray systemet, blev 670 gener profileret på 93 prøver. Ud af disse blev 163 gener udvalgt og yderligere testet i fase 2 på yderligere 51 prøver. Den endelige datasæt indeholdt 144 prøver profileret med 163 gener. En 29-gen panel blev udarbejdet på grundlag af højeste effekt til at skelne AP /CRC fra kontrol af univariate og multivariate analyse. Endelig blev 29-gen panel valideret med en LightCycler480 platform, der almindeligvis anvendes i kliniske laboratorier.

Ud af 670 gener analyseret, 133 viste ingen udtryk eller en dårlig PCR-amplifikation. De resterende 534 kandidatgener og 3 referencepunkter gener generelt godt udtrykkes med en median Ct af 22,94 (inter-kvartil interval: 21,28-25,24) og en median SD på 0,7 (inter-kvartil interval: 0,59-1,04) (S2 tabel). Gene profiler passeret gennem en lys filtrering trin, hvor de skulle opfylde mindst et af følgende kriterier for mindst et af analysen forskelsbehandling (

jeg

.

e

. Kontrol versus CRC eller kontrol versus AP): en p-værdi mindre end 0,1 eller en fold-ændring større end 1,5 (lineær skala). Desuden biomarkører tidligere identificeret i vores laboratorium [8] blev bibeholdt i denne fase, uanset deres p-værdi eller fold ændring for at blive vurderet i et større prøvesæt og ved hjælp af en multivariat statistisk metode. I alt blev 160 gener udvalgt, sammen med de tre referenceår gener for anden fase af screeningen. Denne gang de 163 gener, målt ved 168 assays (5 gener med meget lav udtryk havde en anden assay til at validere den opnåede foranstaltning), blev tildelt i en enkelt plade (S3 tabel). Yderligere 51 prøver blev profileret i to eksemplarer med denne reducerede gen panel for at øge stikprøvestørrelsen og statistiske styrke i de efterfølgende analyser. Også 40 prøver allerede profileret i fase 1, blev re-analyseret for at sikre reproducerbarheden af ​​målingerne på tværs fase 1 og fase 2 og den anden plade format (224-

vs

. 168-assay-format). Ekspressionsniveauerne opnået i begge faser af disse 40 prøver var stærkt korreleret (R

2 = 0,993) (S1 Fig), hvilket fik os til at kombinere de 93 og 51 prøver, profilerede for de 163 gener, i en enkelt endelig datasæt ( fig 1). For at kompilere datasæt blev de middelværdier for de 40 målte prøver i dubletter brugt.

nanoliter high throughput qPCR

Ni hundrede ng af total RNA blev revers transkriberet i 20 pi lydstyrken ved hjælp af høje -kapacitet cDNA Reverse Transcription kit (Life Technologies, Carlsbad, CA) med tilfældige primere, ifølge producentens instruktioner.

genekspressionsprofilering blev udført ved anvendelse af OpenArray systemet [22] (Life Technologies, Carlsbad, CA) , en nanoliter high throughput realtids-PCR-platform, hvilket tillader 3,072 reaktioner i en enkelt plade. PCR reaktioner blev udført i overensstemmelse med TaqMan OpenArray realtid plader protokol den. Kort beskrevet PCR reaktionsblandinger indeholdende 2,5 pi GeneAmp Fast PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 1 pi TaqMan OpenArray Remix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA), 0,3 pi RNase-frit vand, og 1,2 pi cDNA, blev fyldt automatisk i en enkelt eller to eksemplarer reaktion i OpenArray plader ved hjælp af et OpenArray AccuFill instrument i overensstemmelse med producentens protokoller. Den termiske cyklus-forløb bestod af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut. Ved afslutningen af ​​hver kørsel, de billeder, der er indsamlet før og under PCR-kørsel, blev visuelt at kontrollere for prøve misloading eller plader læse problemer. Ct-værdier blev beregnet ved den OpenArray analyse software ved hjælp af automatisk tærskling med Ct tillid minimum signal sæt på 300. Værdier under signal indstillingen minimum angivet et mislykket reaktion eller ingen forstærkning og manglende værdier dukkede op i de eksporterede data. Det meste af tiden en mislykket reaktion skyldtes ekspressionsniveauer ud over detektionsgrænsen. Da den maksimale Ct opdaget var ringere end 36, blev disse værdier erstattes af vilkårlige Ct værdi på 36. Manglende værdier vurderes at være forårsaget af tekniske grunde blev erstattet af de mediane Ct-værdier i det pågældende gen på tværs af alle prøver. En reference-RNA (Xpress Ref Humant Universal total RNA) (Qiagen, Venlo, Holland) var til stede som positiv kontrol mindst én gang i hver PCR-kørsel for at sikre proces og stabilitet reagens samt reproducerbarhed over forskellige PCR-kørsler. Negative kontroller, der indeholder vand i stedet for cDNA blev brugt til at udelukke mulige DNA-kontaminering.

Real-time qPCR på 384-brønds plader

To hundrede ng af total RNA blev revers transkriberet til cDNA ved hjælp SuperScript Vilo cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Realtid klar Brugerdefineret RT-qPCR assays (Roche, Basel, Schweiz) er baseret på Universal ProbeLibrary (UPL) teknologi (S4 Table), var forinstalleret i 384-brønds plader af fabrikanten. Real-time PCR-analyse på 384-brønds plader blev udført på LightCycler 480 instrument (Roche, Basel, Schweiz) på 144 prøver. PCR-reaktioner blev udført i dubletter i 384-brønds plader i et totalt volumen på 10 pi. Hver brønd blev fyldt med en automatisk pipette (Microlab starlet, Hamilton Robotics, Reno, NV) med 5 pi RealTime Ready DNA Probes Master Mix (Roche, Basel, Schweiz), og cDNA svarende til 2,5 ng totalt RNA. QPCR program bestod af 2 sekunder ved 95 ° C og 30 sekunder ved 60 ° C i 40 cykler. Positive og negative kontroller blev genereret med hver retrotransskription batch og blev inkluderet i hver qPCR køre for hvert mål assay. Den negative kontrol indeholdt hverken RNA eller cDNA for at bekræfte ingen forurening forekom. Den positive kontrol blev foretaget med en standardiseret mængde for Human Universal reference-RNA (Clontech, Mountain View, CA) alikvoteret og opbevaret ved -80 ° C. For qPCR køre validering, den negative kontrol viste ingen amplifikation eller en Crossing punkt (Cp) værdien op eller lig med 35, og den positive kontrol en Cp-værdi, for hver målgen, der faldt inden for et forudbestemt interval. Cp-værdier blev automatisk beregnet med LightCycler 480 analyse software i henhold til den

nd derivat maksimal metode 2 [23].

Statistisk analyse

PCR data fra OpenArray og LC480 platforme blev normaliseret ved ACt metoden ved hjælp af gennemsnittet af tre husholdning gener RPLP0, NACA og TPT1. Disse gener blev udvalgt, fordi de var den mest stabile i 3 PBMC-relaterede microarray datasæt tilgængelige fra GEO database [24] og også i qPCR analyse udført af os (data ikke vist).

Genekspression gange ændring, blev defineret som med, hvor er de normaliserede data.

Wilcoxon rank test [25] blev anvendt til de normaliserede genekspression data for at definere gener betydeligt udtrykkes forskelligt mellem grupperne. Derudover i fase 2 screening, blev Wilcoxon rank test anvendes til 500 tilfældigt udvalgte datasæt (bootstrap) og signifikans blev sat til gener opført signifikant (p-værdi 0,05) i mindst 250 bootstraps ud af 500.

Den multivariate analyse bruges til funktionen udvælgelse i fase 2 screening omfattede følgende metoder:. K-top scoring par, en parameter-fri, feature udvælgelse algoritme [26], og straffet logistisk regression metode med forskellige algoritmer [27, 28]

for at evaluere den prædiktive nøjagtighed 29-gen panel, blev straffet logistiske regressionsmodeller monteret på datasættet og valideret af ikke-overlappende bootstrap metoden [29]. Fem hundrede tilfældige datasæt blev tegnet med udskiftning fra datasæt; hver bootstrap havde samme størrelse som træningssæt. Modellen blev re-monteret ved hver bootstrap og valideret på out-of-taske prøver. De specificitet og følsomhed middelværdier 500 bootstraps blev beregnet og Receiver Operating Karakteristika (ROC) kurver blev genereret ved at afbilde følsomheden over for falske positiver (1-specificitet). Areal under kurven (AUC) blev beregnet.

Pearson korrelationskoefficient blev anvendt til at evaluere lineær korrelation mellem geners målinger ved to instrumenter.

R statistikker miljø blev anvendt til statistiske analyser.

Resultater

Definition af en 29-gen panel for tarmkræft og adenom afsløring

datasæt genereret fra fase 2 screening (163 gener og 144 prøver) blev analyseret og filtreret for lav ekspression og ustabile gener på tværs af de to faser, og 20 gener blev yderligere kasseret, at reducere antallet af kandidatgener til 140. der blev udforsket de data for at definere, hvilke gener, alene eller i kombination, havde den højeste magt til at diskriminere CRC , AP og AP sammen med tidlig fase CRC (AP + CRC i-II) fra kontrolgruppen (S3 tabel). Desuden blev CRC-gruppen sammenlignet med AP-gruppe, for at identificere specifikke gener kunne skelne mellem CRC og AP. Generelt er de fleste af generne syntes at være opreguleret i CRC og AP-grupper sammenlignet med kontrolgruppen. Den observerede genekspression fold ændringer var relativt beskeden, der ikke overstiger en faktor på 2,3 (log2 = 1,22) (figur 2). Når et filter baseret på en FC 1,3 og p-værdi 0,05 blev anvendt på alle koncernens sammenligninger (CRC /Con, AP /Con, AP + CRCI-II /Con, CRC /AP), fandt vi 28 gener, der opfyldte begge kriterier (S3 tabel). Blandt dem, 14 diskriminere CRC og 8 AP fra kontrolgruppen (figur 2), hvoraf to var fælles for begge betingelser (CES1 og IL1B). Syv var specifikke kun til adskillelse AP fra CRC og 1 til at skelne AP + CRC I-II. Gener blev bekræftet at være signifikant, når statistisk test blev anvendt til 500 tilfældigt genererede datasæt (bootstrap, data ikke vist).

vulkan plots opsummere genekspression fold-ændringer (FC) (

x-aksen

) og p-værdierne (

y-aksen

) for sammenligningerne: A, CRC versus kontrol eller, B, AP versus kontrol. P-værdi cutoff blev fastsat til 0,05 (vandret linje) og fold-change tærskel på ± 0,38 (svarende til ± 1,3 i lineær skala, lodret linje). En FC lig med 1 betyder, at genet udtrykkes i gruppen af ​​interesse i gennemsnit dobbelt så meget end i kontrolgruppen.

multivariatanalyse blev påført datasættet at diskriminere CRC, AP AP + CRC fra kontrolgruppen. Den omfattede KTS-pair [26] og fem forskellige algoritmer baseret på straffet logistisk regression metode [27, 28, 30] for variable markeringer og model montering. Gener blev rangordnet efter frekvensen af ​​selektion ved hjælp af metoden, som er sammenfattet af multivariate score. Tredive-otte gener med en score på mindst to blev tilbageholdt for at kompilere den endelige gen listen (S3 tabel).

Den univariate og multivariate gen lister var derefter fusioneret, hvilket resulterer i en endelig liste over 29 gener (Tabel 2). Interessant, de fleste af de univariate top-scorer gener syntes også at være de bedste-scorer gener i den multivariate analyse. Fire gener (MAP2K3, MAPK6, CD63, ITGB5), udelukket af filteret af den univariate analyse, fordi FC 1.3, men statistisk signifikant (p-værdi 0,05), blev “reddet” af den multivariate analyse. Af de øvrige 10 gener ikke statistisk signifikante, og integreret i den endelige lister takket være den multivariate tilgang (GATA2, LTF, MMP9, CXCL10, MSL1, RHOC, FXYD5), de første tre viste en FC . 1.3

Funktionel analyse udført med opfindsomheden Pathway analyse pakke (IPA, www.qiagen.com/ingenuity), viste, at panelet blev beriget i gener involveret i leukocytter migration og kemotaksi (CCR1, CXCL10, CXCL11, CXCR3, IL1B, IL8, ITGA2, MMP9, S100A8) (tabel 3). Disse cellulære funktioner er tæt relateret til immun celle menneskehandel og inflammation. Stærkt repræsenteret var også gener involveret i celledeling og differentiering (BCI3, CD63, EGR1, GATA2, jun, LTF, MAPK6, MMP11, NME1, PPARG, TNFSF13B), hvilket afspejler en mulig rolle i hæmatopoiese.

Validering af 29-gen panel

for at evaluere den kliniske relevans af vores 29-gen panel, navnlig dens prædiktive nøjagtighed, straffet logistisk regression blev anvendt på datasættet og monteret modeller blev valideret af ikke-overlappende bootstrap metode. Modeller kunne diskriminere CRC eller AP 1 cm fra kontrol med en gennemsnitlig sensitivitet på 75% og 59%, hhv. Den gennemsnitlige specificitet, defineret som antallet af kontroller korrekt klassificeret i det samlede antal kontroller, var 91%. ROC-analyse bestemmes en AUC på 0,88 (0,83-0,92, 95% CI) og 0,85 (0,78-0,91, 95% CI) for CRC eller AP-registrering, (fig 3). Når den samme fremgangsmåde blev anvendt til de 15 top-rangerede gener for CRC eller AP forskelsbehandling univariat analyse kun (tabel 2), prædiktiv nøjagtighed drastisk reduceret. Når specificitet blev fastsat til 91%, blev CRC detekteret med en følsomhed på 65% og AP med en følsomhed på 37%, med en AUC på 0,86 (0,77-0,84, 95% CI) og 0,77 (0,70-0,82, 95% CI ), henholdsvis. Dette resultat understøttes vores valg af at integrere univariate og multivariate tilgang til gen valg: gener, der ellers ville være blevet kasseret, fordi der ikke opfylder den faste p-værdi og FC kriterier, faktisk var værdifuldt for CRC og AP detektion som anses af multivariable metoder

A. Oversigt over de falske og sande positive satser for den 29-gen panel i at klassificere CRC tilfælde. B. Resumé af de falske og sande positive satser for den 29-gen panel i at klassificere AP tilfælde. Analyser blev udført ved hjælp af 500 bootstrap valideringer. De boxplots repræsenterer fordelingen af ​​de 500 bootstraps. Den sorte linje repræsenterer de middelværdier 500 bootstraps til klinisk specificitet og sensitivitet.

Assay migration til en 384-brønds plade qPCR platform

OpenArray platform vist sig at være værdifulde for høj throughput genekspression profilering og biomarkør opdagelse. Men denne platform er ikke egnet i en rutinemæssig klinisk laboratorium indstilling, ved hvilken lethed brug, fleksibilitet og lave omkostninger er foretrukne. Med henblik på at udvikle den 29-gen panel i en udbredt CRC-test, vi evalueret adfærd panel på en qPCR platform, der er almindeligt vedtaget af kliniske laboratorier. De 144 prøver blev profileret med 29-genet panel under anvendelse af en LightCycler 480 (LC480) instrument og et sæt af kommercielt tilgængelige probe assays (Universal ProbeLibrary, Roche), forudinstalleret på 384-brønds plader.

Korrelation og lineær regressionsanalyse viste, at genekspressionsniveauer målt på de to platforme var meget sammenlignelige (korrelationskoefficient: 0,933) (fig 4A). Generelt viste genekspression lignende varians tværs prøverne (fig 4B). Men en gruppe af ringe udtrykte gener viste målinger med mindre standardafvigelser på LC480 platform end på OpenArray en, hvilket antyder, at analyserne på LC480 instrument er mere nøjagtige. Når vi gentog differential genekspression analyse mellem kontroller og CRC grupper med LC480 datasæt, fandt vi, at relative forekomst og statistisk signifikans for de 29 gener var ens eller med den tilsvarende tendens til, hvad der observeret på OpenArray datasæt (Fig 4C og 4D) . Men for fem gener (PTGES, MMP11, IL8, CCR1, S100A8) statistisk signifikans blev tabt, når målt på LC480.

Scatter plots sammenligner analyser udført for hvert gen på datasæt genereret på LC480 og OpenArray platforme . Følgende variabler er blevet anvendt: A. Mean normaliserede ekspressionsniveauer værdier (ACp og ACt) (R

2: 0,933), B. Mean standardafvigelser (SD) i forhold til hinanden målgenet målt, C. Genekspression fold ændringer mellem CRC og kontrolgruppen (lineære absolutte værdier), D. p-værdier fra statistisk test mellem CRC og kontrolgruppen (log transformeret). Linjer repræsenterer en p-værdi 0,05. Gene navne er blevet overlappet til graferne

Diskussion og konklusioner

I dette arbejde har vi identificeret en 29-gen panel udtrykt i PBMC, i stand til at diskriminere personer med AP 1cm eller CRC fra raske individer. Straffet logistisk regressionsanalyse klassificeret korrekt 75%, 59% (følsomhed) og 91% (specificitet) af CRC, AP og kontroller, henholdsvis.

Den fremgangsmåde vi brugte er anderledes i forhold til de eksisterende screeningtest for CRC, som den er baseret på PBMC gener udtryk profiler. Dette udnytter den veletablerede begreb tumor-host interaktion og bidrag af knogle- marv-afledte celler til tumorudvikling [16, 17]. Det er af interesse til, at AP, anses præmaligne læsioner, er også detekteret, om end med en lavere følsomhed ved 29-genet panel. Faktisk er inflammation associeret med neoplastisk colon polyp formation [31] og inflammatoriske tarmsygdomme, navnlig colitis ulcerosa, er en risikofaktor for CRC [32]. Vigtigere, ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler beskytter mod CRC udvikling [33], forhindre adenom dannelse i eksperimentelle modeller af familiær adenomatøs polypose coli [34] og revers genekspression ændringer i den normale colon til adenom sekvens [35]. Dette styrker forestillingen om, at kunne blive udviklet den foreslåede fremgangsmåde for AP og tidlig CRC opdagelse som mere effektivt alternativ til fækal okkult blod-baserede tests. Puljen af ​​670 kandidatgener, der anvendes til screening omfattede mange værtsgener og veje er involveret i inflammation, immunreaktion og tumorprogression. Vigtigere, blev disse gener ikke udvalgt på grundlag af en forudgående genom-wide screen, men baseret på eksisterende viden (dvs. litteratur og egne data) og hypoteser (dvs. rolle betændelse i kræft progression). De fleste af disse 29 gener af panelet er mediatorer /regulatorer af betændelse, cellemotilitet, celleoverlevelse, cellesignalering og proliferation (tabel 2 og 3). Dette er i overensstemmelse med den opfattelse, at tumor-mobiliseret knoglemarvafledte cirkulerende myelomoncytic cellerne er i en tilstand af aktivering som svar på tumor-frigivet faktorer.