PLoS ONE: Grape Seed Extract Dosis-responsivt Fald sygdommens sværhedsgrad i en rotte model af mucositis; Samtidigt Forbedring Kemoterapeutisk Effektivitet i Colon Cancer Cells

Abstrakt

Målsætning

Mucositis er en alvorlig lidelse i mave-tarmkanalen, at resultaterne fra cancer kemoterapi. Vi undersøgte virkningerne af den voksende vindruekerneekstrakt doser af sværhedsgraden af ​​kemoterapi i en rotte model og dens sammenfaldende indvirkning på kemoterapeutisk effektivitet i tyktarmen kræftceller.

Design

Female Mørk Agouti rotter blev tvangsfodret med druekerneekstrakt (400-1000 mg /kg) eller vand (dag 3-11) og blev injiceret intraperitonealt med 5-fluorouracil (150 mg /kg) eller saltvand (kontrol) på dag 9 for at inducere mucositis. Daglige metaboliske data blev indsamlet og rotterne blev aflivet på dag 12. Intestinal væv blev indsamlet til histologiske og myeloperoxidase analyser. levedygtighed Caco-2 celler blev undersøgt i afhængighed af druekerneekstrakt i kombination med 5-fluoruracil af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) assay.

Resultater

Sammenlignet med 5-fluorouracil kontrol, vindruekerneekstrakt (400-1000 mg /kg) faldt betydeligt den histologiske skader score (

P

0,05) i jejunum. Vindruekerneekstrakt (1000 mg /kg) øgede jejunal krypt dybde med 25% (

P

0,05) i 5-fluoruracil behandlede rotter i forhold til 5-fluorouracil kontroller, og svækkede den 5-fluoruracil induceret reduktion af slimhinde tykkelse (25%,

P

0,05). Vindruekerneekstrakt (600 mg /kg) faldt myeloperoxidaseaktiviteten med 55% (

P

0,01) sammenlignet med 5-fluorouracil kontroller. Vindruekerneekstrakt var mere effektiv til lindring af 5-fluorouracil inducerede tarm skade, med effekter mest udtalt i den proksimale jejunum. Vindruekerneekstrakt (10-25 ug /ml), væsentligt forbedret de vækstinhiberende virkninger af 5-fluoruracil med 26% (

P

0,05) i Caco-2 celler og var mere potent end 5-fluorouracil på 50-100 mg /ml.

Konklusion

Vindruekerneekstrakt kan repræsentere en ny terapeutisk mulighed for at mindske symptomerne på tarm mucositis mens samtidigt påvirker levedygtigheden af ​​tyktarmskræft celler.

Henvisning: Cheah KY, Howarth GS, Bastian SEP (og 2014) Grape Seed Extract Dosis-responsivt Fald sygdommens sværhedsgrad i en rotte model af mucositis; Samtidigt Forbedring Kemoterapeutisk Effektivitet i Colon Cancer Cells. PLoS ONE 9 (1): e85184. doi: 10,1371 /journal.pone.0085184

Redaktør: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland

Modtaget: Juni 20, 2013; Accepteret: December 3, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Cheah et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Professor Gordon Howarth understøttes af en South Australian Sundhed og Medicinsk Research Institute Cancer Råd Senior Research Fellowship. Ingen finansielle aftaler er på plads. Denne forskning blev støttet af The University of Adelaide, at være medlem af Wine Innovation Cluster, Waite Campus, Adelaide, South Australia. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mucositis er en alvorlig, invaliderende konsekvens af kræftbehandling, hvilket reducerer livskvaliteten hos kræftpatienter [1]. Mucositis er en smertefuld tilstand associeret med inflammation og ulceration af mave-tarmkanalen; mest almindeligt påvirker mundens slimhinde (oral mucositis) og tyndtarmen (intestinal mucositis). Intestinal mucositis er kendetegnet ved reduceret enterocytterne proliferation og forøget apoptotisk sats af kryptceller, hvilket resulterer i malabsorption og forstyrret barrierefunktion [2], [3]. Symptomer på mucositis omfatter intens smerte, diarré, kvalme, opkastning og anoreksi. Ofte er der en øget risiko for bakteriel infektion med dødeligheden og sygeligheden [1]. Nogle gange kan gastrointestinal toksicitet føre til en reduktion eller endda afbrydelse af kemoterapien regimen [4]. På grund af dette, kemoterapi dosis indgivet til kræftpatienter ofte være optimale; dermed nye regimer, der reducerer bivirkninger, vedligeholdelse effektivitet søges. Aktuelle mucositis behandlinger er stort set ineffektive som de er rettet mod kun symptomerne, men ikke patogenesen af ​​tilstanden [5]. Således er det vigtigt at søge nye alternative behandlinger, som ikke kun er målrettet mucositis men også forbedre kemoterapeutisk tiltag uden at kompromittere trivsel af patienten. På nuværende tidspunkt er den optimale kombination af midler, som vil kunne øge både kemoterapeutiske cytotoksicitet mod cancerceller og har minimal indflydelse på normale celler, er endnu ikke fastlagt.

Vindruekerneekstrakt (GSE) er bredt indtages som et kosttilskud på grundlag af dets potente anti-oxidant [6], anti-inflammatorisk [7] og formodes, anti-neoplastiske [8] egenskaber. Procyanidiner (pc’er) er en klasse af polyphenolforbindelserne sammensat af flavan-3-ol underenheder (oligomerer og polymerer) [9]. PC’er er almindeligt i andre fødevarer kilder såsom te, æbler og rødvin og menes at være de centrale bioaktive bestanddele i GSE [10], [11]. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at absorptionen og biotilgængeligheden af ​​pc’er i tarmen er afhængig af deres kemiske struktur og polymerisationsgrad [12]. Pc’er (polymerisationsgrad = 7 eller højere) tilbage i tarmkanalen og derved øge kontakttiden med gut enterocytter at fremme intestinal sundhed [10]. Fundet studier GSE i kombination med 5-fluoruracil (5-FU) i normale dyr er begrænset. Desuden har ingen undersøgelser blevet offentliggjort at undersøge kombinationen af ​​5-FU og GSE i tyktarmskræft modeller.

Tidligere vi demonstreret i en foreløbig undersøgelse, at GSE (400 mg /kg) var i stand til at reducere tarm skader både i rottemodeller af intestinal mucositis [13] og ulcerativ colitis [14]. Men den dosis, der kræves for at opnå maksimal terapeutisk effekt, dosis-respons og sikkerhed GSE forblev udefineret. Derfor undersøgte vi GSE tværs af en række doser for dens potentiale til optimalt og sikkert reducere sværhedsgraden af ​​intestinale mucositis i en rottemodel. Stigende doser af GSE yderligere forhindret 5-FU-induceret mucositis skader, og disse behandlinger blev godt tolereret af dyrene som blev observeret ingen metaboliske ændringer i forhold til de raske kontroller. Derudover har vi også undersøgt virkningerne af kombinationen af ​​GSE med 5-FU kemoterapi på colon neoplasi i en

in vitro

model sammenlignet med effektiviteten af ​​5-FU alene. Kombinationen af ​​GSE og 5-FU yderligere forstærket toksicitet i tyktarmen kræftceller.

Materialer og metoder

Kemikalier

catechin, epicatechin, methanol, phloroglucinols, ascorbinsyre hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB), natriumbicarbonat og

o

-dianisidine blev indkøbt fra Sigma Chemical Co. Ltd, St. Louis, MO. Folin-Ciocalteau reagens og

13C sucrose blev købt fra AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Australien. Vævskultur løsninger omfatter Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM), føtalt kalveserum (FCS), antibiotika (penicillin, gentamicin og streptomycin), Dulbeccos phosphatbufrede saltvand, dimethylsulfoxid (DMSO) og 3- (4,5-Dimethylthiazol- 2yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) blev indkøbt fra Gibco BRL, Life Tehnologies Pty Ltd, Australien. De kemoterapi narkotika, 5-fluorouracil (5-FU) blev købt fra MaynePharma Pty. Ltd., Australien).

Vindruekerneekstrakt (GSE) forberedelse

Vindruekerneekstrakt er venligst doneret af Tarac Techologies (North Adelaide, South Australia, batch nr: 02VIN03) og opbevares i en lufttæt, lysægte pack indtil blive opløst i destilleret vand før brug. Den GSE stammer fra kondenseret tannin fremstillet af australsk hvidvin marc (resterende skind og frø fra vinfremstilling). Ernæring profil af GSE er anført i tabel 1. GSE anvendes i den aktuelle undersøgelse blev opnået fra samme kilde med samme batchnummer der er beskrevet af Cheah et al [13]. Indholdet polyphenolisk blev målt tidligere ved Folin-Ciocalteau assay [13], og den kemiske profil blev kvantificeret ved phloroglucinolysis beskrevet nedenfor.

Folin-Ciocalteau assay

Det totale indhold af phenolisk GSE er tidligere kvantificeret ved Folin-Ciocalteau assay [13]. Kort fortalt blev GSE prøver tilsat i tre eksemplarer til ikke-sterile 96 brønds plader og inkuberet med Folin-Ciocalteu reagens i 5 min. Natriumbicarbonatopløsning (7,5% vægt /volumen) blev tilsat og yderligere inkuberet i 4 timer i mørke. Pladen blev aflæst ved 740 nm ved et spektrometer (Multiskan® Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Finland) ved hjælp Skanit software 2.2. Catechin standarder blev fremstillet ud fra 1 mg /ml stamopløsning (1/2 seriefortyndinger) og anvendt til at generere en kalibreringskurve. Data blev analyseret ved hjælp af GraphPad Prism version 4.0 til Windows® (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) og udtrykt i mg /ml catechin ækvivalenter.

Kvantificering af procyanidiner (pc’er) i GSE ved phloroglucinolysis

procyanidin profil GSE var præget af phloroglucinolysis der bestemmer underenhed sammensætning, betyder polymerisationsgrad (MDP) og galloylation af pc’er. Phloroglucinolysis blev udført ifølge en tidligere beskrevet metode [15]. GSE blev opløst i methanol (10 mg /ml, v /v) og 25 pi GSE blev tilsat til et tilsvarende volumen af ​​phloroglucinol opløsning (0,2 N HCI i methanol, 100 g /l af phloroglucinol og 20 g /l ascorbinsyre ). Den phloroglucinolysis reaktionen blev udført ved 50 ° C i 25 min og analyseret ved omvendt fase-højtryksvæskekromatografi (RP-HPLC) under anvendelse af (-) -. Epicatechin som kvantitativ standard [15]

Etiske Statements

Denne undersøgelse fulgte den australske adfærdskodeks for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål og blev godkendt af både Animal Care og etiske komitéer for børn, unge og kvinders sundhed service og University of Adelaide (AE : 777-3-2011)

Dyreforsøg

Female Mørk Agouti rotter (100-140 g, n = 64) blev anbragt i individuelle metaboliske bure (Tecniplast, Exton, PA, USA. ) i et temperaturreguleret rum (22 ° C) med en lys-mørke-cyklus på 12 timer. Rotter fik

ad libitum

adgang til vand og mad (18% kasein-baseret kost) [16] i Animal Care Facility af børn, unge og kvinders Health Service, North Adelaide, South Australia.

Rotterne blev tilfældigt allokeret til 8 grupper (n = 8): Vand + Saline injektion; GSE 400 mg /kg + Saline injektion; GSE 600 mg /kg + Saline injektion; GSE 1000 mg /kg + Saline injektion; Vand + 5-FU-injektion (5-Fluorouracil: 150 mg /kg); GSE 400 mg /kg + 5-FU injektion; GSE 600 mg /kg + 5-FU injektion; og GSE 1000 mg /kg + 5-FU-injektion. Rotter blev akklimatiseret i metabolismebure fra dag 0-2, og derpå tvangsfodret med 1 ml GSE opløst i vand (400 mg /kg, 600 mg /kg eller 1000 mg /kg) eller vand fra dag 3-11. På dag 9 blev alle rotter intraperitonealt injiceret med enten 5-FU eller saltopløsning (kontrol). Daglige målinger af kropsvægt, mad og vand indtag, og urin og fækal output blev registreret. Rotter blev aflivet ved CO

2-kvælning efterfulgt af cervikal dislokation på dag 12. Alle indre organer blev vejet og kasseret. Længderne og vægte af de gastrointestinale organer (tolvfingertarmen, tyndtarmen og colon) blev registreret. Repræsentative prøver (2 cm) af gastrointestinale organer blev opsamlet og fikseret i 10% pufret formalin til histologisk analyse, mens fire cm prøver blev lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C til biokemisk analyse.

13C-sucrose udåndingsluften (SBT)

SBT er et indirekte mål for intestinal sucrase aktivitet og blev udført i overensstemmelse med den af ​​Tooley

et al.

[17] kort , rotter var oro-gastrisk tvangsfodret med 1 ml saccharose, der indeholder

13C (250 mg /kg) og ånde prøver blev indsamlet på 15 min intervaller i 120 min. Breath prøver blev analyseret for

13CO

2 indhold med isotop-ratio massespektrometri (IRMS) udstyret med en V410 dataindsamlingssystem (Europa Scientific, ABCA 20/20, Crewe, Storbritannien). Dataene blev udtrykt som procent kumulativ dosis på 90 min (% CD90) ved at beregne ændringen i vejret

13CO

2 niveauer fra baseline for hvert tidspunkt af ånde kollektion under hele intervallet prøveudtagning. SBT bestemmelser blev udført på dag 3 (før GSE behandling), dag 9 (før 5-FU injektion) og dag 12 (før kill).

Myeloperoxidase (MPO) assay

Små tarm væv prøver (4 cm) af jejunum, samledåser af jejunum og ileum (JI) og ileum blev tøet på is og homogeniseret med 1,5 ml phosphatbuffer (10 mM, pH 6,1) i 60 sekunder, indtil opløsningen var homogen. Homogenaterne blev holdt nedfrosset ved -80 ° C indtil anvendelse.

MPO er et enzym til stede i de intracellulære granula af neutrofiler, som en akut inflammation markør. Niveauet af MPO i tyndtarmen blev bestemt ved en mindre ændring af assayet beskrevet af Krawisz

et al.

[18] Vævshomogenater blev tøet på is og centrifugeret ved 13000 g i 13 min. Supernatanten blev kasseret, og cellepellets blev resuspenderet i hexadecyltrimethylammoniumbromid (0,5%, pH 6,0). Prøverne blev vortexet i 2 minutter og yderligere centrifugeret ved 13000 g i 3 minutter. Supernatanter blev omsat med

o

-dianisidine og absorbansen målt ved 450 nm med 1 minuts intervaller i en periode på 15 minutter under anvendelse af en mikropladelæser (Sunrise Microplate Reader, Tecan Austria GmbH, Grödig, Østrig). MPO-aktivitet blev udtrykt som enheder MPO-aktivitet pr gram væv.

Histologiske analyser Salg

Gut vævsprøver (2 cm) blev indlejret i paraffinvoks og 4 um snit blev farvet med haemotoxylin og eosin. Den overordnede histologiske sygdommens sværhedsgrad score (ODS) af intestinale sektioner blev bedømt semikvantitativt (0-3) baseret på 11 uafhængige histologiske kriterier ifølge en protokol beskrevet af Howarth

et al.

[19] villus højder og krypt dybder (40 villi og 40 krypter pr sektion) blev bestemt i tyndtarmens sektioner herunder jejunum, krydset af jejunum og ileum (JI) og ileum, som beskrevet i Howarth

et al.

[19] Den kombinerede måling af villus højder og krypt dybder forudsat en tilnærmelse af den samlede slimhinde tykkelse i hver lille tarm prøve. Alle mikroskop-baserede analyser blev udført i et blindet måde ved hjælp af et lysmikroskop (Nikon, ProgRes®CS, Tokyo, Japan) og image ProPlus softwareversion 5.1 (Media Kybernetik, Silver Spring MD, USA).

Cell kultur

den humane coloncancer cellelinie Caco-2 blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Caco-2-celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2 – 95% luft og 90% relativ fugtighed i Dulbeccos modificerede Eagles minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% (v /v ) føtalt kalveserum (FCS) og 1% antibiotika (penicillin, gentamicin og streptomycin) (v /v). Cellerne blev dyrket i 75 cm

2 ventilerede vævskulturkolber, dyrkningsmedium blev ændret to gange om ugen, og celler blev passeret når de var 80-90% sammenflydende.

Cellelevedygtighed

inhiberingen af ​​Caco-2 celler levedygtighed blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid) (MTT) assay ifølge en tidligere beskrevet fremgangsmåde ved Huynh-Delerme

et al.

[20] celler (5 x 10

3 celler /brønd) blev podet på 96-brønds vævskulturplader i 48 timer for at tillade binding. GSE blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO) og fortyndet med DMEM og længere filtersteriliseret gennem et 0,22 um filter (Millipore, South Australia, Australien). I alle eksperimenter, koncentrationen af ​​DMSO i kontrol og behandlede prøver var mindre end 0,025%. Efter 48 timer blev dyrkningsmediet udskiftet med serumfrit medium indeholdende GSE ved forskellige koncentrationer (pg /ml) og 5-FU (uM) og yderligere inkuberet i enten 24 eller 48 timer. MTT-opløsning blev fremstillet i Dulbeccos phosphatbufrede saltvand (1 mg /ml) og steril-filtreret for at fjerne eventuelle biologiske kontaminanter. Dernæst blev 50 pi MTT-opløsning tilsat til hver brønd og inkuberes yderligere ved 37 ° C i 4 timer. Medium blev erstattet med 100 pi DMSO til ekstraktion af formazanprodukt. Pladerne blev anbragt på en rysteinkubator i 15 minutter og læses af spektrometer ved 570 nm. Data blev udtrykt som antallet af levedygtige celler som en procentdel af kontrolceller behandlet med serumfrit medium alene.

Statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved anvendelse PASW 18 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) og XLSTAT udgave 2011/04/02 (Addinsoft SARL, Frankrig). Alle parameterdata herunder kropsvægt, daglige metaboliske data, SBT, MPO, villushøjde og kryptdybde og cellelevedygtighed blev sammenlignet under anvendelse envejs variansanalyse (ANOVA) med en Tukeys

post-hoc

test. Den samlede sygdommens sværhedsgrad score (ODS) blev sammenlignet ved en Kruskal-Wallis test med en Mann Whitney U-test for at identificere signifikans mellem grupperne. Data blev betragtet som signifikante ved

P

. 0,05

Resultater

Karakterisering af procyanidiner ved phloroglucinolysis

GSE havde lav masse konvertering (23,8% w /w), MDP (5.9) og molekylmasse (1871 g /mol), som målt ved phloroglucinolysis (tabel 2). De PC terminal underenheder i GSE meste domineret af (-) -. Epicatechin-3-

O

-gallate

Daglige metaboliske parametre og kropsvægt

Oral administration af GSE (400, 600 eller 1000 mg /kg) mellem dag 3 og 9 påvirkede ikke signifikant kropsvægten, føde- eller vandindtagelse og urin eller fækal output sammenlignet med rotter, der modtog vand (tabel 3). 5-FU injektion signifikant forøget vandindtagelse og urinproduktion og reduceret legemsvægt, fødeindtagelse og fækal output sammenlignet med rotter, der modtog saltvand injektion mellem dag 10 og 12 (tabel 4). GSE 600 og 1000 mg /kg i 5-FU behandlede rotter signifikant returneres fækal output (

P

0,01), tilbage mod værdierne for normale saltvandsinjicerede kontrolrotter

Visceral organer

5-FU injektion betydeligt reduceret thymus vægt med 51% (

P

0,001) og milt vægt med 20% (

P

0,05). Sammenlignet med normale kontroller

Saccharose udåndingsluften (SBT)

5-FU injektion signifikant (

P

0,001) nedsatte SBT (% CD90) med 70% i forhold til værdierne i vand + saltvandsbehandlede rotter, indirekte angiver 5-FU injektion havde sprængte brush border sucrase-aktivitet (figur 1). Der var ingen signifikante forskelle i% CD90 blandt nogen af ​​de 5-FU-behandlede rotter, der fik GSE sammenlignet med 5-FU behandlede-kontrolrotter. Derudover blev der ikke observeret nogen signifikante forskelle i% CD90 mellem GSE og vandbehandling, hvilket indebærer ingen af ​​GSE doser havde påviseligt påvirket børste grænsen sucrase aktivitet hos raske rotter (figur 1).

Data udtrykt som gennemsnit ( % CD90) ± SEM. *** Angiver

P

. 0,001 sammenlignet med vand + Saline

myeloperoxidaseaktiviteten (MPO)

Efter 5-FU injektion, var der en signifikant (

P

0,001) stigning i MPO-aktivitet i den proksimale jejunum, krydset af jejunum og ileum (JI) og ileum af vand + 5-FU behandlede rotter (1092%, 357% og 297% henholdsvis) sammenlignet med vand + saltvand behandling (figur 2). GSE 600 mg /kg signifikant (

P

0,01) reducerede MPO aktivitet med 55% i JI i forhold til vand + 5-FU behandlede rotter (Figur 2B). Der var ingen signifikant forskel i MPO-aktivitet mellem GSE og vandbehandling i raske rotter (figur 2), hvilket indikerer, at GSE administration ikke påvirkede MPO aktivitet hos raske dyr.

Data er udtrykt som middelværdi (MPO-enheder /g væv) ± SEM. * Angiver

P

0,05, ** angiver

P

0,01 og *** angiver

P

0,001 sammenlignet med rotter, der fik vand og saltvand injektion. ## Viser

P

. 0,01 sammenlignet med rotter, der fik vand og 5-FU injektion

Samlet sygdommens sværhedsgrad scoringer

Administration af 5-FU steget markant sygdomssværhedsgrad score i den proksimale jejunum, når de vurderes ved den semikvantitative histologisk alvorlighed score analyse (figur 3 og 4). 5-FU kontroller opnået den højeste skader score (median score = 30) og var signifikant større end vand + saltvandsbehandlede rotter (median score = 1,

P

0,01). GSE behandling reducerede signifikant sygdommens sværhedsgrad score i 5-FU behandlede rotter i en dosis-lydhør måde (GSE 400 = 21 (15,5-25,5),

P

0,01; GSE 600 = 15,75 (9-24) ,

P

0,01 og GSE 1000 = 11,75 (7-19),

P

0,01) sammenlignet med 5-FU styrer. blev ikke observeret nogen signifikant forskel i sygdommens sværhedsgrad score mellem GSE og vandhunde behandlet som fik saltvand injektion (figur 3), hvilket indikerer, at GSE ikke havde forstyrret tarm integritet i raske dyr.

De hårdhed regnskabs blev bedømt baseret på 11 parametre på forskellige lag af tarmvæv baseret på tidligere beskrevet protokol Howarth

et al.

[19] de box plots repræsenterer forskellige sygdommens sværhedsgrad score og de vandrette linjer repræsenterer medianen sygdommens sværhedsgrad score. ** Angiver

P

0,01 i forhold til vand + Saline. ## Viser

P

. 0,01 i forhold til vand + 5-FU

(. Original forstørrelse 40 ×)

Villus højde, krypt dybde og slimhinde tykkelse

5-FU injektion resulterede i afkortning af villi i jejunum (38%,

P

0,001), JI (39%,

P

0,001) og ileum (26%,

P

0,01) sammenlignet med vand (Figur 5). 5-FU injektion også reduceret krypt dybde i jejunum (38%,

P

0,001), JI (23%,

P

0,05) og ileum (15%,

P

0,05). I jejunum, GSE behandlinger tendens til dosis-responsivt forbedre villushøjde og kryptdybde, selvom kun GSE ved en dosis på 1000 mg /kg signifikant (

P

0,05) forøget kryptdybde sammenlignet med 5-FU kontroller (figur 5A). Vigtigt er det, at ingen af ​​de GSE behandlinger påvirkede negativt villushøjde og kryptdybde raske dyr. 5-FU injektion betydeligt reduceret slimhinde tykkelse i jejunum (38%,

P

0,001), JI (45%,

P

0,001) og ileum (29%,

P

0,01) sammenlignet med vand (Figur 6). GSE behandlinger tendens til dosis-responsivt forøge mucosal tykkelse i jejunum, selvom kun GSE 1000 mg /kg signifikant forøget mucosal tykkelse (25%,

P

0,05) sammenlignet med 5-FU (Figur 6A) .

data er udtrykt som middelværdi (um) ± SEM. * Angiver

P

0,05, ** angiver

P

0,01 og *** angiver

P

0,001 sammenligne med vand + Saline. # Indikerer

P

0,05 sammenlignet med vand + 5-FU

Data er udtrykt som middelværdi (um) ± SEM.. * Angiver

P

0,05, ** angiver

P

0,01 og *** angiver

P

0,001. # Indikerer

P

. 0,05 sammenlignet med vand + 5-FU

Effekter af 5-FU på levedygtighed Caco-2 celler

dosisreaktionerne af 5-FU (0-100,000 uM) på Caco-2-celler i 24 timer og 48 timer er vist i figur 7. 5-FU doser blev også testet ved 72 timer (data ikke vist). Cellelevedygtigheden af ​​Caco-2-celler blev inhiberet af 5-FU på en tids- og dosisafhængig måde. På 24 timer, 5-FU 100 uM væsentligt reduceret levedygtighed i Caco-2 celler til 88% (

P

0,05) af kontrolværdier og en yderligere reduktion af cellelevedygtighed blev observeret til 70% (

P

0,05) af kontrolværdier på 48 t. En 100 uM koncentration af 5-FU blev udtaget til næste eksperiment, fordi denne dosis var i stand til at reducere levedygtigheden Caco-2 celler (70-85%), hvilket afspejler gastrointestinal toksicitet ofte hos kræftpatienter efter kemoterapi.

Data er udtrykt som procent af cellelevedygtighed i forhold til levedygtighed ubehandlede kontroller. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM for 2-3 uafhængige forsøg. Bar data ikke deler det samme bogstav er signifikant forskellige

P

. 0,05

Virkninger af GSE og 5-FU på Caco-2 cellernes levedygtighed

I for at fastslå cytotoksiciteten af ​​GSE på Caco-2-celler, GSE (10-100 ug /ml) blev anvendt på celler i enten 24 eller 48 timer (figur 8). GSE behandling inhiberede cellelevedygtighed på en dosis- og tidsafhængig måde. GSE behandlinger signifikant (

P

0,05) reducerede cellernes levedygtighed (IC

50 = 50,24 mg /ml) ved 24 timer og blev mere giftige for Caco-2 celler ved 48 h (IC

50 = 37,84 ug /ml). Når cellerne blev udsat for en kombination af GSE (10-100 ug /ml) og 5-FU (100 uM), større antal døde celler var tydelige sammenlignet med celler udsat for 5-FU alene (figur 8). Efter 24 timer, 5-FU signifikant reduceret cellelevedygtighed til 84% (

P

0,05) af styreværdier. Interessant, når Caco-2-celler blev udsat for en kombination af GSE og 5-FU, de væksthæmmende effekter af 5-FU blev signifikant forøget med 26% (GSE = 25 ug /ml;

P

0,05; kombineret behandling vs. begge midler alene) på 24 timer. GSE ved højere doser (50-100 ug /ml), der udøves større vækstinhibering sammenlignet med 5-FU alene. På 24 timer, GSE induceret signifikante væksthæmmende effekter på Caco-2 celler (GSE 50 = 33% og GSE 100 = 27%;

P

0,05) sammenlignet med 5-FU-styring (84% af kontrol værdi) (figur 8A). Desuden GSE alene signifikant (

P

0,05) faldt levedygtighed Caco-2 celler (GSE 50 = 31% og GSE 100 = 29%;

P

0,05) sammenlignet med 5-FU-styring (64% af kontrolværdien) ved 48 timer (figur 8B).

data udtrykkes som procent af cellelevedygtighed i forhold til ubehandlede kontroller. Data er præsenteret som middelværdi ± SEM for 4 uafhængige eksperimenter. Bar data ikke deler de samme bogstaver er signifikant forskellige

P

. 0,05

Diskussion

Den foreliggende undersøgelse er den første rapport af GSE dosis-responsivt reducerende sværhedsgraden af ​​mucositis. Vores resultater tyder på, at højere doser af GSE er mere effektiv til at reducere sværhedsgraden indikatorer for tarm mucositis hos rotter, og at disse GSE-inducerede effekter er stort set dosisafhængig og mere tydeligt i den proksimale jejunum sammenlignet med den distale tyndtarm.

Injektion af 5-FU indvirkninger på tyndtarmen i højere grad end tyktarmen, formentlig som følge af større celle omsætningshastighed i de mere proximale regioner i tarmen [3]. Vores resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [18], [19], [21], hvor 5-FU mucositis model resulterede i alvorlige tarm skade 72 timer efter induktion af mucositis. Denne skade var præget af en reduktion af tarm børste grænserne enzymaktiviteter [21], øget neutrofil infiltration [22], øget sværhedsgrad af sygdommen score [23] og nedsat slimhinde tykkelse [13]. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser [13] indhold, bryder af villi og forvaltningsmæssigt krypter (placering af stamceller) var de primære begivenheder i forbindelse med svær mucositis. Jejunum er den maksimale skadestedet induceret af kemoterapi og virkningen bliver mindre udtalt i de mere distale områder i tyndtarmen [13]. Dette blev demonstreret i den aktuelle undersøgelse, hvor der blev observeret mindre skade i form af MPO-aktivitet (neutrofil infiltration), villushøjde og mucosal tykkelse i den distale ende af tyndtarmen

Biotilgængeligheden af ​​pc’er i tarmen systemet er veldokumenteret i andre undersøgelser [24]. Den unikke polymeriserede struktur af pc’er hæmmer absorption over tyndtarmen, som de overholder tarmslimhinden [25]. Tsang

et al.

[26] detekteret større former af pc’er i tyndtarmen hos rotter op til 12 timer efter indtagelse. Således kan en ophobning af relativt høje koncentrationer PC forekomme i tarmlumen at beskytte den intestinale barriere. I den aktuelle undersøgelse, højere doser af GSE (1000 mg /kg) var effektiv til opretholdelse kryptdybde og mucosal tykkelse i jejunum-regionen, idet de fleste værdier nærmer værdierne af raske kontroller. Desuden er den aktuelle undersøgelse viste også forbedring af fækalt output (mindre alvorlig diarré) i kemoterapi-behandlede rotter, der fik den højere dosis af GSE (600 mg /kg og 1000 mg /kg), hvilket tyder reduceret forstyrrelse af den mucosale foring af tyndtarmen .

Selvom GSE i den aktuelle undersøgelse var mere effektiv i jejunum, stedet for større intestinal skade, bioaktivitet blev reduceret i den distale tyndtarm. Dette kan have skyldtes nedbrudte bioaktive komponenter nå det distale område af tyndtarmen [27], [28]. Spaltningen, absorption og metabolisme af GSE er vigtigt at identificere den skæbne af bioaktive stoffer i GSE. I fremtidige studier vil det være nødvendigt at identificere formen, størrelsen og bioaktivitet af procyanidiner fra GSE ansvarlige for at fremme intestinal sundhed ved brug

in vitro

og

in vivo

modeller af intestinal absorption. Derudover kunne fremtidige undersøgelser undersøge beskyttelse af GSE, eventuelt ved mikroindkapsling, eller via stikpille ansøgning, at målrette GSE og forbedre dens biotilgængelighed i de mere distale områder af tarmen. På grund af kompleksiteten af ​​GSE indhold, ville det være vanskeligt at afgøre, hvilke faktorer er ansvarlige for den observerede bioaktivitet. Derfor GSE, snarere end alternativ proteinkilde såsom bovint serum blev anvendt som sin egen kontrol. Administration af GSE på normale dyr tilladt mere præcis sammenligning med GSE-behandlede rotter, der modtog 5-FU kemoterapi.

Interessen for GSE har været primært på grund af dets høje indhold af antioxidanter. GSE er en mere potent radikaler end andre kendte antioxidanter såsom vitamin C og E [29]. I den foreliggende undersøgelse, den delvise reduktion af akut inflammation ved GSE, som angivet ved faldet i MPO-aktivitet, og reduktion i lymfocytinfiltration registreret af sygdommens sværhedsgrad score analyse, kan styrke den potentielle rolle for GSE som en kraftig antioxidant og antiinflammatorisk middel. En række undersøgelser har beskrevet GSE som et anti-inflammatorisk middel.