PLoS ONE: potentielle rolle ORM2 i udvikling af kolorektal Cancer

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige malignitet i verden. Risikoen for dødsfald er tæt korreleret til det stadium, CRC på tidspunktet for primær diagnose. Der er derfor et presserende behov for identifikation af blod biomarkører, der kan aktivere tidlig påvisning af CRC. Vi brugte en kvantitativ proteomisk tilgang med isobarisk mærkning (iTRAQ) at undersøge ændringer i plasma proteomanalyse af 10 patienter med CRC sammenlignet med raske frivillige. Enzym-Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) og Western blot blev anvendt til yderligere validering. I vores kvantitative proteomics analyse, vi har registreret 75 humane plasmaproteiner med mere end 95% sikkerhed ved hjælp iTRAQ mærkning i forbindelse med microQ-TOF MS. 9 opreguleret og 4 nedreguleres proteiner blev observeret i CRC-gruppen. Den ORM2 niveau i plasma blev bekræftet at være signifikant forhøjet hos patienter, der lider af CRC sammenlignet med kontrollerne. ORM2 udtryk i CRC væv var signifikant øget i forhold til, at der i tilsvarende tilstødende normale slimhinderne (

P

0,001). ITRAQ sammen med Q-TOF /MS er en følsom og reproducerbar teknik kvantitative proteomics. Ændring i ekspression af ORM2 foreslår, at ORM2 kunne anvendes som en potentiel biomarkør i diagnosen af ​​CRC

Henvisning:. Zhang X, Xiao Z, Liu X, Du L, Wang L, Wang S, et al. (2012) potentielle rolle ORM2 i udviklingen af ​​tyktarmskræft. PLoS ONE 7 (2): e31868. doi: 10,1371 /journal.pone.0031868

Redaktør: Anthony W. I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: November 7, 2011; Accepteret: 13 januar 2012; Udgivet: 21 februar, 2012 |

Copyright: © 2012 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Kontrakt tilskud sponsor: National Clinical Key specielle Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i 2009 American Cancer Society anslået i alt 146,970 nye kolorektal cancer (CRC) tilfælde og 40% dødsfald i USA. CRC forventes at være den tredje mest almindelige kræft i Amerika. Siden 1975 har der været en bemærkelsesværdig forbedring i forhold CRC 5-årige overlevelsesrater, som følge af en tidligere diagnose og forbedre behandlinger [1]. Sigmoideoskopi væsentligt forbedret påvisning på CRC. Imidlertid er dens brede anvendelse stadig begrænset på grund af høje omkostninger og besvær. Således er der behov for specifikke sera-baserede tumormarkører for tidlig diagnose og prognose.

plasma- /serum markører (f.eks carcinoembryonisk antigen, CEA) er de mest udbredte og pålidelige tumormarkører for CRC, fordi de er let måles kvantitativt , reproducerbar og omkostningseffektiv. Selvom de nuværende retningslinjer fra American Society of Clinical Oncology (ASCO) anbefaler, at CEA niveauer bør monitoreres hver 2-3 måned i mindst 2 år skrive diagnose, er der ingen klar konsensus om gyldigheden af ​​CEA overvågning [2]. Adskillige undersøgelser [3] – [5] spørgsmålstegn ved værdien af ​​CEA som en markør for CRC tilbagefald, især hos patienter med normale præoperative CEA niveauer. På grund af disse problemer, er nye biomarkører for at forbedre tidlig påvisning og forudsigelse af tilbagefald til alle former for CRC. Forskellige proteom mønstre i serum tilstedeværende nye muligheder for at udvikle nye, meget følsomme diagnostiske værktøjer til tidlig påvisning af kræft [6].

I litteraturen proteomics teknologier er blevet brugt til at studere CRC serum biomarkører. I disse undersøgelser proteomics strategier såsom todimensional polyacrylamidgelelektroforese (2-D PAGE), todimensional fluorescens forskellen i gelelektroforese (2D DIGE), overflade-forstærket laser desorption /ionisering time of flight-massespektrometri (SELDI -TOF MS) teknologi og proteinarrays er blevet udnyttet, men ingen kan præcist vurdere niveauet for op- eller nedregulering af de foreslåede biomarkører. Derfor er det vanskeligt at bestemme deres særlige og gyldighed i blindede studier af prøverne [7], [8]. For at afdække nye plasma biomarkører, en ny tilgang med isobarisk Tags til relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) er blevet anvendt [9]. Den stabile inkorporering af isotoper til en amin tagging reagens er involveret i denne kemiske mærkning metode. Ved anvendelse af massespektrometri, kan proteiner være pålideligt detekteret og tillade sammenlignende kvantificering i et multipleks måde. Kernen i denne metode er en multiplekset sæt isobare reagenser, der giver amin-derivatiserede peptider. De derivatiserede peptider er umulig at skelne i MS, men udviser intense lav masse MS /MS signatur ioner, der understøtter kvantificering. Denne metode bibringer en masseforskel som grundlag for kvantificering ved måling af relative toparealer i MS og /eller MS /MS massespektre. Dag, kan kommercielt tilgængelige 4-plex og 8-plex reagenser anvendes til at mærke proteinprøver af interesse følgende trypsin fordøjelse. Forskellige isobare tags i denne metode tyder på, at i en enkelt massespektrometrisk analyse, op til 4 eller 8 forskellige prøver, hvoraf den ene er en reference, kan samtidigt undersøges. I betragtning af denne grund er iTRAQ foreslåede fremgangsmåde som meget lovende i opdagelsen af ​​biomarkører i prøver med en lang række af plasma, legemsvæsker og væv.

I denne undersøgelse blev iTRAQ koblet med microQ-TOF /MS at detektere differentielle udtrykte proteiner i plasma fra CRC patienter og kontroller. Blandt de proteiner, der blev forhøjet i CRC plasma, blev 9 proteiner opreguleret, og 4 blev nedreguleret. Vi diskuterede deres mulige funktioner og verificeret ORM2 der kan være en potentiel serologisk biomarkør for (de) CRC patienterne. Den specifikke funktion af dette protein er endnu ikke fastlagt; dog ORM2 synes at fungere ved modulering af aktiviteten af ​​immunsystemet i den akutte fase reaktion, som måske spille en potentiel rolle i den tidlige udvikling af CRC. Voksende data viser, at tumor-associerede inflammation kan køre tumor udvikling og progression, mens tumor udvikling og progression kunne fremkalde inflammation, som kan spille en central rolle i alle faser af tumorigenese. kan påvises Sådanne inflammatoriske molekyler i blodprøver fra cancaer patienter og kan være have en potentiel rolle i tidlig påvisning af kræft. I denne undersøgelse blev den opregulering af ORM2 bekræftet ved ELISA i plasma hos patienter med tarmsystemet sygdom.

Resultater

Identifikation af kandidat biomarkører ved microQ-TOF MS

for microQ-TOF MS proteinprofilering blev plasmaprøver fra 10 CRC patienter og 10 individer i kontrolgruppen opsamlet (2 ml plasma fra hvert individ) og derefter blandes til dannelse af en prøve pulje til yderligere test. 100 pi puljede prøver fra hver gruppe blev immundepleteret af 12 rigelige plasmaproteiner efter immunoaffinitetssøjle teknik som beskrevet i Methods.

immundepleteret plasmaprøver blev spaltet med trypsin, mærkes med et entydigt isobarisk tag, kombineret og samtidigt analyseret ved microQ-TOF MS. CRC gruppe blev mærket med iTRAQ-114 og den raske kontrolgruppe blev mærket med iTRAQ-117 og derefter adskilt ved kraftig kationbytningskromatografi og C18 fraktionering. 75 proteiner blev identificeret ved microQ-TOF MS med ≥95% tillid. Blandt denne gruppe blev 13 differentielt udtrykte proteiner valgt på basis af 1,5-fold overekspression og 1,5 gange under-ekspression i CRC patienter, sammenlignet med de raske frivillige. Ni proteiner af de 13 differentielt udtrykte proteiner blev opreguleret (tabel 1). Tre proteiner fandtes at være signifikant forhøjet i CRC-gruppen (med målene fra 1.3 til 4.4). Fire proteiner blev nedreguleret i CRC patienter, og deres ekspressionsniveauer er vist i tabel 2. Den statistiske varians af tumor versus normale forhold var inden den 95. konfidensniveau (P = 0,05).

Måling af ORM2 i plasmaprøver

Som vist i fig. 1, plasma ORM2 niveauer på en logaritmisk skala i box-and-whisker plots, median plasma ORM2 koncentrationer var signifikant højere i CRC sammenlignet med den normale colorectum, hyperplastisk polyp, og adenom (alle på P 0,001, henholdsvis). Plasma ORM2 niveau var statistisk signifikant højere hos patienter med IBD end i den normale colorectum, kolorektal hyperplastisk polyp og adenom (alle på P 0,001 henholdsvis) og det var statistisk signifikant højere hos patienter med IBD end i CRC (

P

. 0,05)

Stjernen (stjerner) i figuren betyder et tegn for statistisk analyse. En stjerne betyder P 0,05 og tegnet med tre stjerner betyder P 0,001. CRC er statistisk forskellig fra den normale colorectum, hyperplastisk polyp og adenom (alle på P 0,001 henholdsvis); IBD er statistisk forskellig fra normal den colorectum hyperplastiske polyp og adenom (alle på P 0,001 henholdsvis). IBD er statistisk forskellig fra kolorektal cancer (P 0,05).

Vi vurderet, om plasma ORM2 potentielt kunne skelne CRC fra godartede kolorektale sygdomme. Vi søgte efter korrelation (alder, køn, TNM stadie og histologisk klasse) mellem plasma ORM2 niveauer og CRC patientens klinisk-patologiske parametre (tabel 3). Ingen signifikant sammenhæng blev fundet mellem plasma ORM2 koncentrationer og alder, køn, TNM stadie eller histologisk klasse.

Måling af ORM2 i vævsprøver

Western blot analyse blev anvendt til at bestemme ekspressionen af ORM2 i væv. Når proteinekspression blev målt ved densitometer, median densitometer værdi ORM2 i CRC cancervæv var signifikant større end den tilsvarende hosliggende normale slimhinderne (

P

0,01). (. Figur 2)

diskussion

I de senere år har proteomics baseret biomarkør opdagelse fra serum /plasma taget fart. En række undersøgelser har forsøgt at bruge proteomiske fremgangsmåder for opdagelsen af ​​nye biomarkører for CRC patienter [10] – [14]. Undersøgelser foretaget af Yong-Sam Kim [10] afslørede 26 kandidat biomarkører for CRC ved kombineret 2-DE og nano-LC-FT-ICR /LTQ MS. Ma et al [11] identificerede 4 proteiner med diagnostiske potentialer ved SELDI undersøger serum proteomanalyse af 62 CRC patienter og 31 non-cancer fag. Imidlertid har spørgsmål vedrørende kompleksitet og dynamikområde konstituerende proteiner gjort det vanskeligt at opnå meningsfulde data til fortolkning. Både serum og plasma viser enorm variation i individuel protein overflod. LC-MS /MS tilgange til analyse af serum /plasma prøver råd meget bedre dynamisk range kapaciteter. Desuden har iTRAQ reagenser vundet interesser på dette område som et nyttigt redskab i protein biomarkør opdagelse. Det er den første undersøgelse til at kombinere iTRAQ med Q-TOF /MS på plasma prøver på CRC patienter til at opdage potentielle biomarkører for CRC. 13 proteiner med forskellige ekspressionsmønstre i CRC plasma lykkedes identificeret. Blandt disse 13 proteiner, var der flere proteiner af interesse, såsom ORM2, Serpin peptidase hæmmer (clade D), NADH dehydrogenase subunit 5 (ND5) og Retinol bindende protein 4 (RBP4), som blev udvalgt som gavnlige kandidater og kan yderligere undersøgt. ORM2 (alfa-1-syre-glycoprotein), et medlem af den akutfaseprotein familie fundet at være relateret til tarmsystemet sygdom [15] – [18], blev udvalgt til yderligere kontrol og efterforskning

Det. er kendt, at cancere er ledsaget af talrige systemiske fysiologiske og biokemiske ændringer, herunder glycosylering som er en af ​​de vigtigste post-translationelle modifikationer af proteiner. Flere og flere opmærksomhed bliver betalt på at studere afvigende glycosylering under forskellige patofysiologiske tilstande, herunder inflammation [19], gigt [20], [21], og kræft [22], [23]. Under tilrettelæggelsen af ​​vores data, fandt vi flere serologiske glycosylerede proteiner som ORM2, EpCAM ændre i niveauer under udviklingen af ​​kræft. I denne indledende undersøgelser, rapporterede vi ORM2 som nyt medlem af disse cancer-associerede glycoproteiner. Wandall [24] anvendes en hidtil ukendt O-glycopeptid-microarray at screene seromic profilering af patienter med kolorektal cancer.Dai [25] individuelt afbildet ændringen i glycoproteiner indirekte. Disse rapporter opfordre en anden vinkel at opdage kliniske biomarkører for diagnose og prognose

Der er flere rapporter om ORM2 i tarmsystemet sygdom og kræft [15] -. [18], [26]. ORM2 blev anset for at være relateret til kapillær permeabilitet [15]. Funktionen af ​​orosomucoid blev rapporteret at være forbundet med inflammation og cancer. Koncentrationen af ​​S-orosomucoid viste sig at være øget hos patienter med Crohns sygdom [16]. Sammenligning blære kræftpatienter med raske kontrolpersoner, der var signifikante forskelle, med meget mere orosomucoid udtryk i kræft gruppen [17]. Lignende fænomen kunne også fundet hos patienter med lungekræft [18]. Brug af 2-D DIGE og yderligere analyseret ved MALDI-TOF massespektrometri hos patienter med kronisk inflammatorisk demyeliniserende polyneuropati, var signifikant opregulering af alfa-1-syre glycoprotein 1 forløber identificeret [26]. Undersøgelser har vist, at CEA, svarende til alfa 1-syre-glycoprotein (orosomucoid) i immunologi postuleres som en biosyntetisk forløber af alfa 1-syre-glycoprotein [27].

Dette er den første rapport af en opregulering af ORM2 i CRC plasma. Endvidere blev opregulering af ORM2 bekræftet ved ELISA i plasma fra patienter med tarmsystemet sygdom. Det blev konstateret, at ORM2 blev forøget betydeligt i patienter, der lider CRC og IBD sammenlignet med normale individer og patienter med hyperplastisk polyp og adenom. ORM 2 er et centralt akutte fase plasmaprotein i inflammation, så dette protein er klassificeret som et akut-fase reaktant. Den specifikke funktion af dette protein endnu ikke blevet bestemt, men ORM2 synes at fungere ved modulering af aktiviteten af ​​immunsystemet i den akutte fase reaktion. Dette kan tjene som en potentiel mediator af immun flugt i CRC og påvisning af ORM2 kan være betydelig i skelne kolorektal carcinogenese fra IBD.

For at bestemme kilden til ORM2, CRC tumorvæv og tilsvarende tilstødende normale slimhinderne blev vurderet ved Western blot. Resultaterne viste, at ekspressionsniveauet for ORM2 i CRC cancervæv viste sig at være højere end i normalt væv. Derfor foreslås det, at ORM2 kan være involveret i carcinogenese hos patienter med CRC cancer.

Denne undersøgelse giver også bevis for, at ORM2 niveauer i CRC patienter kan være nyttige som en biomarkør til diagnosticering. Serum CEA analyser anbefales ikke til screening asymptomatiske patienter for kræft. En af grundene er, at plasma CEA assayet er ikke diagnostisk nok til at diskriminere mellem lokaliserede maligne tumorer og godartede lidelser. I vores undersøgelse, påvisning af ORM2 anvendelse af ELISA og Western blot er lovende. Plasma ORM2 koncentrationer var signifikant højere i CRC sammenlignet med den normale colorectum, hyperplastisk polyp, og adenom (P 0,001). Derfor bruger ORM2 at overvåge potentielle CRC patienter kan være en god måde at validere, om ORM2 kan anvendes til screening asymptomatiske patienter. Det er imidlertid vigtigt at analysere den diagnostiske betydning af ORM2 af et stort antal patienter i flere centre inden den endelige kliniske anvendelse for CRC-diagnose.

Serpin peptidase-inhibitor, clade D (heparin cofaktor), det kodede produkt heparin cofaktor som deler homologi med antitrombin III og andre medlemmer af alfa 1-antitrypsin-superfamilien kan hurtigt inhibere thrombin i nærvær af heparin. Defekter i SERPIND1 er den vigtigste årsag til heparin cofaktor II-mangel, og heparin cofaktor II-mangel kan føre til øget thrombin generation og en a-hyperkoagulations tilstand. Det er uheldigt for udviklingen af ​​kræft. Der er flere rapporter om clade A og E i kræft [28], [29], men kun få på clade D. Lignende protein blev også identificeret som en Alpha-1-antichymotrypsin forløber. Alpha-1-antichymotrypsin tilhører serpinfamilien, er overudtrykt i astrocytter og har vist sig at spille roller ved patogenesen af ​​klassiske plaques med Alzheimers sygdom. Som et akut-fase-faktor, kan det inhibere aktiviteten af ​​makrofag ectoenzymes og matrixmetalloproteinase-9 under huden sårheling [30], men inducerer TNF-α-produktion i studiet af microgliale cellelinjer [31]. Denne type protease inhibitor er blevet rapporteret at danne komplekser med kallikrein familien såsom hK3 (også kendt som en prostata-specifikt antigen), hK2 og HK6, og kan anvendes til diagnosticering af prostatakræft [32].

Blandt de nedregulerede proteiner, ND5, en essentiel underenhed bestanddel af hele mitokondriske kompleks i [33], [34], spiller en vigtig rolle i den oxidative phosphorylering proces samt i carcinogenese. Nogle litteratur viste, at ND5 kunne fremkalde hepatomer [35]. Mitokondrie-DNA (mtDNA) mutationer er blevet rapporteret i mange former for kræft. mtDNA gen defekter kan være involveret i de patogenetiske mekanismer fatal manifestation [36]. Rammeskiftsmutation i ND5 gener er blevet rapporteret i hepatocellulært carcinom, og også i præneoplastiske læsioner i mave-tarmkanalen [37]. I denne undersøgelse identificerede vi ND5 (67 kDa) som en potentiel kandidat, men dens præcise rolle i carcinogenese stadig behov for yderligere undersøgelser, især mutationer.

RBP4, et cytokin udskilles af fedtvæv, er en roman adipokine forbundet med fedme og insulinresistens af type 2-diabetes. RBP4 også er blevet påvist at være involveret i nogen grad, i udviklingen af ​​inflammation og cancer. For eksempel blev RBP4 methylering undersøgt i esophageal pladecellecarcinom [38]. I colorektal carcinom, niveauet af RBP aftager [39]. I vores undersøgelse, vi identificeret RBP4 som en potentiel kandidat, men yderligere undersøgelser af dens funktion i patogenesen af ​​udviklingen af ​​kræft er påkrævet.

I denne indledende proof-of-principle studie, tabel 1 og tabel 2 liste 13 kandidat biomarkører for CRC. De fleste af disse er ikke blevet rapporteret som kræft biomarkører, der har vist, at iTRAQ sammen med Q-TOF /MS er en følsom, reproducerbar, robust teknik til at identificere statistisk signifikante forskelle af protein udtryk betweenCRC patienter og raske kontrol plasmaprøver. Fra kontrol af ORM2, blev det konstateret, at ORM2 kan være en potentiel biomarkør for at skelne CRC fra IBD. I fremtidige studier, vil større prøvepopulationer være forpligtet til at bekræfte disse potentielle biomarkører. I vores forskning, er ORM2 først identificeret som en anderledes reguleret protein i CRC patienter sammenlignet med normale kontroller med proteomics screening. Men det kræver en masse bænk forsøg og kliniske test før ORM2 kan anvendes som en pålidelig biomarkør. Vi vil fortsætte vores undersøgelse om ORM2 i to aspekter. For det første er vi etablere en platform til at skelne og analysere relevancies af forskellige niveauer på glycosyl mønster ændringer forskellige faser af sygdomme udvikling baseret på ORM2. Samtidig er vi også meget interesseret i funktionen af ​​ORM2 i tumorprogression grund det regulerer lipid homeostase og protein kvalitetskontrol på det endoplasmatiske reticulum-membran.

Metoder

Prøveforberedelse

Denne undersøgelse blev godkendt og overvåget af den etiske komité i Qilu Hospital, Shangdong University. Plasmaprøver til proteomics fra 10 CRC patienter gruppe og 10 raske kontrolgruppe blev indsamlet (tabel 4). For hver person blev 2 ml blod opnået ved venepunktur og opsamledes i et rør med EDTA, og plasmaet blev fremstillet som anbefalet af HUPO Plasma Proteomprojekt [40]. Der var i alt 419 emner for ELISA, der var klassificeret i fem kategorier ved standard kliniske, radiologiske endoskopisk og histologisk kriterier: normal kontrol (n = 65), hyperplastisk polyp (n = 59), inflammatorisk tarmsygdom (IBD) (n = 62), adenom (n = 53) og CRC (n = 180). Til Western-blot, blev i alt 41 sekventielle patienter diagnosticeret som CRC vurderet. Tumorprøver og tilsvarende hosliggende normale mukøse væv ( 5 cm fra randen af ​​tumoren) blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Ingen patienter i dette studyreceived enhver form for terapi, såsom stråling eller kemoterapi.

Immunodepletion af høj tæthed plasmaproteiner

Plasma prøver fra 10 CRC patienter og 10 personer i kontrolgruppen gruppe blev opsamlet (2 ml plasma fra hvert individ) og derefter blandes til dannelse af en prøve pulje til yderligere test. Puljede plasmaprøver blev udtømt for de øverste 12 mest rigelige proteiner (albumin, IgG, IgA, IgM, transferrin, fibrinogen, α

2-makroglobulin, α

1-antitrypsin, Haptoglobin, α

1-Acid glycoprotein Apolipoprotein AI og apolipoprotein a-II) ved anvendelse af en forpakket 2-ml Seppro ™ MIXED12 affinitet LC-søjle (Genway Biotech, San Diego, CA) på en Agilent 1100 series HPLC-system (Agilent, Palo Alto, CA) i overensstemmelse til det anbefalede fabrikantens procedure.

efter udtømning, de udfældede proteiner blev opløst ved lysepuffer (6M urinstof, 4% CHAPS, 1 mM PMSF, 2 mM EDTA). Proteinkoncentrationer blev bestemt ved 2D Quant Kit (GE Healthcare, USA) under anvendelse af albumin som referencestandard (1 pg /pl-10 pg /pl). Koncentrationerne blev målt til 4,83 pg /pl (CRC-gruppen) og 2,27 pg /pl (den sunde gruppe).

Trypic digeston og iTRAQ mærkningsreagenset

Efter reduktion (10 mM DTT, 100 mM NH4HCO3, 56 ° C, 45 min) og alkylering (55 mM IAA, 100 mM NH4HCO3, 45 min), hver prøve (100 ug) blev fordøjet med trypsin og mærket med iTRAQ reagenser. Disse prøver blev fordøjet i dissociation buffer (trypsin:protein = 1:30) natten over ved 37 ° C. Peptider blev mærket med iTRAQ reagenser (114 for CRC-gruppen, 117 for den raske gruppe).

Strong kationbytningskromatografi og C18-søjle fraktionering

Strong kationbytterkromatografi blev anvendt til at fjerne overflødige iTRAQ reagenser og interfererende stoffer, der kan påvirke MS-analyse. De mærkede prøver blev tilsat til 10 × Buffer A (10 mM KH2PO4 i 25% acetonitril, pH 3,0). Høj opløsning kationbytterkromatografi blev derefter udført for at adskille de mærkede prøver i 10 fraktioner. Peptider blev elueret med en lineær gradient af 0~500 mm KCI (25% v /v ACN, 10 mm KH2PO4, pH 3) i løbet af 15 minutter ved en strømningshastighed på 1 ml /min, med fraktioner opsamlet ved 1-minutters intervaller. Prøver blev afsaltet og yderligere fraktioneret ved anvendelse af en C18-søjle på nano-HPLC (PROXEOME, Amerika) efterfulgt af MS-analyse. Gradienten var 5~40% ACN i 70 minutter.

maldi-tid søgning (MALDI-TOF) /TOF og microQ-TOF analyse

Machine parametre blev indstillet som , ion kilde 25 kV for positiv matrix faktorisering (PMF) og 8,0 kV for tandem MS /MS reflektor 26,3 kV for PMF og 29,5 kV for tandem MS /MS, linse 9,5 kV for PMF og 3,5 kV for tandem MS /MS, løft 19,0 kV og spektre blev erhvervet i refleksion mode i MALDI TOF /TOF med masseinterval 700~4000. Toppene med forholdet S /N over 5 blev automatisk mærket ved FlexAnalysis (Bruker, Tyskland). PMF toppe med masse intensitet på mere end 5000 blev udvalgt til yderligere MS /MS. Spektrene blev opnået i positiv ion-mode i microQ-TOF med masseinterval 50~3000, og den tørre gas og nebulizer gas blev sat som 3 l /min, og 2 L /min. Temperaturen af ​​spray kammer blev sat som 150 ° C, og styrken af ​​det elektriske felt blev sat som 1400 V blev kollisionsenergi sat som 35% timing for lav ion masse og 65% timing for høj ion mass. Andre parametre blev sat som standard.

Database søgning

spektre blev behandlet med microQ-TOF kontrol 3.0 (Bruker, Tyskland) ved hjælp af standardindstillinger, bortset fra at parametrene for overførsel tragt RF og kollision celle RF blev fastsat som 120 Vpp og 600 Vpp hhv. Analysen efterfølgende data blev udført ved hjælp af Dataanalyse 4,0 Biotools 3.0 (Bruker, Tyskland), WARP-LC 2.0 (Bruker, Tyskland), og Mascot 2.2 (Matrix Science, London, UK), hhv. Protein identifikation blev udført ved at søge på Swiss-Prot Human2009-12 database med en forløber ion og fragment masse tolerance både indstillet som 0,04 Da. Carbamidomethylation af cysteiner blev sat som fast modifikation, og oxidation af methioniner, iTRAQ 8 plex modifikation af N-terminal, K og Y blev betragtet som variable ændringer hhv. Et maksimum mis-spaltning blev accepteret. Ion score cutoffs blev indstillet til 25 til peptider og til 68 for proteiner. Peptid identifikationer blev accepteret, hvis de kunne etableres på mere end 90,0% sandsynlighed som angivet af PeptideProphet algoritmen. Protein identifikationer blev accepteret, hvis de kunne etableres på mere end 90,0% sandsynlighed eller indeholdt mindst 2 identificerede peptider. Proteiner, der indeholdt lignende peptider og kunne ikke differentieres på grundlag af MS /MS-analyse alene var grupperet at overholde principperne om sparsommelighed. For klassificering blev gen ontologi (GO) symboler for de identificerede proteiner kurateret hjælp xref databasen, og forespørges mod genet ontologi databasen ved hjælp af GoMiner værktøjet (https://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp ). Forudsigelse af oprindelsen af ​​proteiner med ukendt cellulær lokalisering blev udført ved hjælp af PSORT II (https://www.psort.org/).

Alt protein iTRAQ forhold blev omdannet til at basere 2 logaritme værdier. I bunden 2 logaritme plads blev en 2-gange ændring i niveauer rapporteret som en eller -1 for opreguleret og nedreguleret ændringer hhv.

Elisa for ORM2

ORM2 niveauer i plasma blev kvantificeret under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt ELISA-kit (Groundwork Biotechnology Diagnosticate, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner.

Western blotting for ORM2

tumorvæv og tilsvarende hosliggende normale slimhinderne blev resuspenderet i iskold radioimmunfældningsassays (RIPA) buffer til lysering. En BCA protein assay kit (Beyotime, Biotechnology, Kina) blev anvendt til proteinanalyse. Ca. 25 ug protein af prøver blev indlæst, separeret på 9,0% Tris-glycin-SDS-polyacrylamidgeler og derefter elektro-overført til polyvinyliden fluorid membraner. Efter blokering med 5% fedtfri mælk blev membraner inkuberet med ORM2 Ab (1:150, Yueyan Biotechnology, Shanghai, Kina) eller anti-β-actin-monoklonalt museantistof (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) natten over ved 4 ° C. Membraner blev yderligere inkuberet med polyklonale muse-anti-gede-HRP-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) eller polyklonalt gede-anti-muse HRP-konjugeret sekundært antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) i 2 timer ved stuetemperatur. Bånd blev påvist under anvendelse af en kemiluminescensdetektion kit (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Intensiteten af ​​hvert bånd blev kvantificeret ved hjælp ImageJ 1,32 software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) efter densitometrisk scanning af filmene.

Statistisk analyse

Kolmogorov-Smirnov test blev udført for at bestemme fordelingen af ​​prøver af hver gruppe. Data blev udtrykt som median (inter-kvartil rækkevidde, 1IQR). En ikke-parametrisk test (Kruskal-Wallis test) blev anvendt til at analysere forskelle mellem CRC og andre grupper. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Statistisk analyse blev udført med SPSS softwareversioner 13,0 til vinduer (SPSS Inc, Chicago, USA).

Tak

Tak til Dr. Edward C. Mignot, tidligere Shandong University, for sproglig rådgivning .