PLoS ONE: Tab af Keratin Cytoskeleton er ikke tilstrækkelig til at fremkalde Epithelial Mesenchymale Transition i en roman KRAS Driven Sporadisk lungekræft Mouse Model

Abstrakt

Epithelial-til-mesenchymal overgang (EMT), den fænotypiske ændring af celler fra en epitelial til en mesenchymal type, menes at være en vigtig begivenhed i invasion og metastase af adenocarcinomer. Disse ændringer indebærer tab af keratin udtryk samt tab af cellepolaritet og vedhæftning. Vi her til formål at fastslå, om tabet af keratin selve udtrykket drev øget invasion og metastase i adenocarcinomer og om keratin tab fører til de fænotypiske ændringer forbundet med EMT. Derfor anvendte vi en nyligt beskrevet murin model, hvor betinget deletion af Keratin cluster II af Cre-rekombinase fører til tab af hele keratinmultiprotein familien. Disse mus blev krydset til en nyligt genererede Cre-rekombinase inducerbar KRAS-drevet murin lungecancer model til at undersøge effekten af ​​keratin tab på morfologi, invasion og metastase samt ekspression af EMT beslægtede gener i de resulterende tumorer. Vi her viser tydeligt, at tabet af en funktionel keratin cytoskelet ikke signifikant ændrer tumor morfologi eller biologi i form af invasion, metastase, spredning eller tumor byrde og førte ikke til induktion af EMT. Endvidere havde tumorceller fremprovokere synkront udtryk for vimentin, som ofte ses i EMT, for at kompensere for keratin tab. Sammenfattende vores data tyder på, at ændringer i celleform og migration, der ligger bag EMT er afhængig af ændringer i signalveje, der forårsager sekundære ændringer i keratin ekspression og organisation. , Konkluderer således vi, at tab af keratin cytoskelettet per se ikke er tilstrækkelig til at kausalt drev EMT i denne tumor model

Henvisning:. König K, Meder L, Kröger C, Diehl L, Florin A, Rommerscheidt-Fuss U, et al. (2013) Tab af Keratin Cytoskeleton er ikke tilstrækkelig til at fremkalde Epithelial Mesenchymale Transition i en roman KRAS Driven Sporadisk Lung Cancer Mouse Model. PLoS ONE 8 (3): e57996. doi: 10,1371 /journal.pone.0057996

Redaktør: Victoria Lawson, University of Melbourne, Australien

Modtaget: September 24, 2012; Accepteret: 30 januar 2013; Udgivet: 11 Mar 2013

Copyright: © 2013 König et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret af det tyske forskningsråd via SFB 832, Projekt A5 og Z1 og den tyske kræft Støtte via CIO Köln /Bonn. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

fænotypiske ændringer fra en epitelial til en mesenkymale celletype, benævnt epitel-til-mesenkymale overgang (EMT), er vigtige skridt til invasion og metastase af kræft. Et kendetegn for EMT menes at være remodeling af cytoskelettet, såsom nedregulering af epiteliale keratiner, hvilket fører til ændringer i celle-til-celle sammenvoksninger og ændringer i polaritet og cellemotilitet [1]. Disse ændringer er blevet beskrevet i de fleste typer af adenocarcinomer og menes at understøtte invasivitet af tumorer og metastase-dannelse [2] og resistens mod kemoterapi [3].

Lungekræft, den mest almindelige årsag til kræftdødsfald verdensplan, er traditionelt blevet opdelt i småcellet lungecarcinomer (SCLC) og ikke-småcellet lungecarcinomer (NSCLC). SCLCs udgør 20% af lungekræfttilfælde [4]. NSCLCs er yderligere opdelt i tre histologiske undertyper: planocellulært karcinom, adenocarcinom og neuroendokrine tumorer. NSCLCs danne store sammenhængende primære tumorer, der afviger fra SCLCs, som er klinisk meget aggressiv og afslører en dødelighed på 95% [5]. SCLCs metastaserer meget tidligt, er ikke-sammenhængende og vise et diffust og infiltrativ vækstmønster. Histologisk bliver de karakteriseret ved en ufuldstændig og kondenseret keratin cytoskelet viser en præget og perinukleær fordeling.

Med den stigende anvendelse af målrettet EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren (TKI) terapi i adenocarcinomer i lungen, flere resistensmekanismer mod dette terapi er dukket op. På den ene side, er der observeret mutationer forårsager steriske ændringer i target protein eller omgåelse af hæmmet mål via ansættelse af en anden receptor eller signal transducer. På den anden side, afstamning transformation ved undergår epitel-til-mesenchymal overgang (EMT) [6] eller tilbagefald af TKI behandlet NSCLS som småcellet lungecancer (SCLC) er blevet beskrevet [7], [8]. Støtter således disse kliniske observationer den hypotese, at progression fra NSCLCs til SCLCs kan udløses af EMT.

Da tab af keratin udtryk menes at være centrale for EMT, detektering nedsat eller mistet udtryk for keratiner

i vivo

bruges som en markør for EMT i mange

in vivo

modelsystemer samt på histologiske menneskelige sektioner. Tab af keratiner fører til tab af celle-knudepunkter, såsom funktionelle desmosomer og strømpebukser knudepunkter, og derfor stærk celle-celle-adhæsion [9], [10]. Især er ekspressionen af ​​adherensovergange reguleret af EMT-gener både i adenokarcinomer og pladecellecarcinomer i lungen [11].

Den præcise funktionelle rolle af keratin tab på tumorvækst, metastase og invasion og dens rolle i EMT ikke er klart etableret i en hvilken som helst tumor model. Vi undersøgte derfor, om fuldstændig tab af keratin udtryk inducerer EMT, invasion og metastase. Til dette formål har vi udviklet en ny inducerbar musemodel for lungeadenocarcinom defekt i hele keratin type II klynge forårsager manglende dannelse eventuelle funktionelle keratin filamenter. Under anvendelse af denne model, vi her viser, at fuldstændig keratin tab i KRAS muterede lungetumorer ikke påvirker tumor morfologi, invasion eller metastase, hvilket indikerer, at tabet af keratin cytoskeleton er ikke kørsel overgang lungetumorer i småcellet carcinom eller en sarcomatoid fænotype . Desuden blev EMT markører ikke op reguleret i keratin-mangel adenokarcinomer.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne fra FELASA. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske dyreforsøg fra University of Bonn. blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Generation af RASLO transgene mus

For at fremkalde lungetumorer, vi genererede et udtryk vektor, der udtrykker et muteret KRAS

Val12 samt en fusion molekyle bestående ovalbumin, en S-tag og et luciferase-molekyle drevet af en 1,8-kb kylling ß-actin-promotor [4] efter Cre-medieret fjernelse af et stopkodon. RASLO mus blev frembragt ved pronucleus injektion af C57BI /6 × FVB F1 embryoner med onkogene KRAS konstruktionen afbildet i figur 1A. Mus blev avlet i den centrale dyr facilitet fra University of Bonn ifølge sammenslutningen af ​​europæiske laboratorium Animal Science Association retningslinjer. The Animal Care Kommissionen Nordrhein-Westfalen godkendt alle mus eksperimenter.

(A) Skematisk konstruktion viser den strategi, der anvendes til at generere den inducerbare KRAS drevne lungekræft model (RASLO). (B) Bio-Luminescence billede taget med en IVIS-200 (Xenogen) kamera af hale fibroblaster kulturer af RASLO grundlægger mus efter behandling med 2 uM TAT-CRE protein og tilsætning af luciferin lige før billedbehandling, viser stærke signaler i 5 grundlægger mus . (C) Luciferase imaging (IVIS-200) i 1 min ved middel følsomhed RASLO mus 6 uger efter induktion med 2 x 10

7 PFU af Adeno-CRE i.n (+) eller avl kontroller. (-). Mus blev injiceret i.p. med luciferin i 200 pi PBS og bedøvet ved isofluran inhalering. (D) Makroskopisk billede af lungen af ​​en RASLO mus 6 uger efter af AdCre administration, og (E) HE farvede sektion med flere tumorer på 100x og 400x forstørrelse. (F) PCR-analyse af DNA isoleret fra cellelinjer afledt fra tumor RASLO og RASLO × KIIf /d mus viser et PCR-produkt på 240 bp indikerer, at Stop kassetten er blevet fjernet ved Cre-rekombinase i tumoren. Den vektor, der anvendes til at generere musestamme (pRASLO) før CRE behandling viser en 1200 bp fragment. Den samme vektor efter Cre behandling in vitro tjener som en positiv kontrol for CRE medierede excision og viser den forventede 240 bp band efter rekombination.

Screening for RASLO transgene mus

Tail udklip af grundlæggerne blev brugt til at oprette fibroblastkulturer og PCR-analyse. tail tip blev derfor steriliseret med 70% ethanol, skåret i små stykker og fordøjet med collagenase i fire timer ved 37 ° C. De blev dyrket i DMEM-medium leveres med 8% FCS, 2 mM glutamin og penicillin /streptomycin. Efter fem dage blev hale fibroblaster behandlet med 2 pM Tat-Cre-protein i syv timer og den næste dag analyseret under IVIS 200 bioluminescens kamera efter tilsætningen af ​​luciferin til dyrkningsmediet. PCR og luciferase assay positive grundlæggere blev anvendt til at etablere flere RASLO stammer. Genotypebestemmelse blev udført af hale PCR med fremad (5′-CAGTGCAATGAGGGACCAGT-3 ‘) og reverse primere (5′-CACCCTGTCTTGTCTTTGCTGATG-3’).

Produktion og administration Adenoviral CRE

HEK 293 celler blev inficeret med rekombinant adenovirus, der udtrykker Cre-rekombinase (AdCre) [12] med (MOI = 5). Efter fem dage blev cellerne høstet og virus blev frigivet af hurtige optøning og frysning cyklusser. Virus blev oprenset ved ultracentrifugering på en cæsiumchloridgradient [13] Derefter virusstammer blev dannet via koncentration på Slidalyzer kassetter (Thermo Fisher Scientific).

Før nasal applikation af AdCre mus blev bedøvet med en kombination af 10 mg /ml Ketamin /0,1% Rompun i PBS. Afhængigt af legemsvægten af ​​mus mellem 150 pi og 200 pi blev injiceret i.p. 2 × 10

7 PFU AdCre blev pipetteret på næsen af ​​musene, der skal inhaleres. Dyrene blev observeret indtil helt vågen og komfortable. Der blev ikke observeret tegn på stress og ubehag. Efter tumorinduktion blev dyrene overvåget dagligt for tegn på ubehag eller åndedrætsbesvær. Mus blev udelukket for yderligere analyser, når mus viste symptomer på respiratorisk stress. Mus blev afbildet regelmæssigt under IVIS 200 bioluminescens kamera (PerkinElmer). Kort beskrevet blev mus bedøvet ved isofluran inhalation og modtog derefter 2,8 mg D-Luciferin Firefly (Caliper) i 200 pi PBS i.p. og afbildes på en opvarmet scene. Mus blev aflivet ved cervikal dislokation efter 6 ugers AdCre administration. Lunger blev straks fikseret i 4% PBS-bufret formalin i 24 timer for paraffin indlejring eller lynfrosset i flydende nitrogen i kryo-konservering.

polymerasekædereaktion (PCR)

DNA blev isoleret fra cellelinier dannet ud fra transgene mus lungetumorer eller fra frisk frosset (FF) lungevæv med DNA Mini Kit (Qiagen). 50 ng af template DNA blev anvendt pr reaktion. Hver PCR reaktion indeholdt 1x puffer, 0,2 mM dNTP, 2 mM MgC

2, 0,2 U Taq-polymerase og 0,2 pM primer. For at vise vellykket udskæring af loxP-steder 5’Lox5 forward: 5′-CTGCTAACCATGTTCATGCC-3 ‘og 3′ Ras5 revers: 5’-CCTACGCCACAAGCTCCAAC-3 ‘blev anvendt til opnåelse af et produkt på 240 bp. Uden udskæring af stopcodonet disse primere giver et produkt på 1,2 kb. For at bekræfte keratin locus excision følgende primere blev anvendt: DEL (fremadrettet 5’TGAACCCAGGAGGTTGAGAC-3 ‘og revers 5’TGGCGTCGTGATTAGTGATGA) og FLOX (fremad 5′- GATAACCGTATTACCGCCTTTG-3’ og revers 5’CGCCCTCTTGTCTATATCAACC-3 ‘).

cellelinier

følgende cellelinjer af human oprindelse blev anvendt: A549, blev H1975, H460, HCC827, DMS114, og SW1271 fås fra American Type Culture Collection. R. Thomas (universitetet i Köln) venligt forudsat: N417 [14], PC9 [15]. Glc1, glc2 [16], og GLC36 [17] var en slags gave fra Dr. L. de Leij (University of Groningen, Groningen, Holland). NSCLC og SCLC-cellelinier blev dyrket i DMEM medium suppleret med 8% FCS inkuberet ved 37 ° C og 5% CO

2

Mus lung cellelinjer blev frembragt fra RASLO KII + /+ og KIIf /. – mus. Tumorer blev udskåret med en skalpel og fordøjet i mindst 3 timer ved 37 ° C i DMEM-medium /Hams F12-medium med L-glutamin suppleret med 2% bovint serumalbumin, 0,5 ug /ml hydrocortison, 600 U /ml collagenase, 5 ug /ml humant insulin, 200 U /ml hyaluronidase, Hepes-puffer 10 mM, og penicillin /streptomycin. Cellesuspensionen blev filtreret to gange og røde blodlegemer lyseret med ACK lysis buffer. Celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med murine EGF 20 ng /ml, basiske fibroblastvækstfaktorer (bFGF) 20 ng /ml, Heparin sodium salt fra porcine intestinale mucosa 4 ug /ml, B-27 Serum-Free Supplement, Penicillin /Streptomycin og Gentamycin 35 ug /ml.

QRT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra humant lunge cancer cellelinier eller kryo-konserverede muse lungevæv (5 gange 10 um objektglas) ved RNeasy Mini Kit (Qiagen). 500 ng af total RNA blev transcriberet til cDNA under anvendelse af SuperScript ™ III H

– Revers transkriptase og oligo (dT) 12-18 Primer (Life Technologies). QRT-PCR blev udført med SYBR Green (Qiagen) med primere rettet mod keratin 8 (fremadrettet 5′-GCCGTGGTTGTGAAGAAGA-3 ‘og revers 5′-CTGTTCCCAGTGCTACCCT-3′). Som husholdning kontrol anvendte vi 28 s RNA (fremadrettet 5’-CCCAGTGCTCTGAATGTCAA-3 ‘og revers 5′-AGTGGGAATCTCGTTCATCC-3′). Luciferase primere havde følgende sekvens: fremadrettet 5’-TTGCATTTTGATCCAGTCGAG-3 ‘og revers 5’TCGAGAGCGTGGATCAAACG-3′; og som en husholdning kontrol 18 s:. forward 5’- ACAGCCAGGTTCTGGCCAACGG-3 ‘og reverse 5′- TGACCGCGGACAGAAGGCCC-3’

Alle QRT-PCR’er blev kørt på 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems ) og analyseres med SDS2.2 software (Applied Biosystems). Alle prøver blev analyseret i tre eksemplarer og ekspressionsniveauet blev beregnet ved hjælp af ΔΔCT metode.

Immunofluorescens af Lung Cancer Cell Lines

Cellerne blev udsået på dækglas natten over og fikseret i iskold methanol i 5 minutter , derefter farvet med pan-Keratin (1:100, MNF116, Dako) og DP-1 (1:100, DP-1, Progen) fortyndet i TBS /1% BSA /5% NGS i 1 time ved stuetemperatur. Tilsvarende sekundære antistoffer ged anti-gp

Alexa488 (1:800, Life Technologies), ged anti-mus

TexasRed (1:800, Life Technologies) og DAPI (1:1000, Life Technologies) fortyndet i TBS /1% BSA /5% NGS sattes til cellerne i 45 minutter ved stuetemperatur. Billeder blev taget med et inverteret mikroskop udstyret med en ApoTome (Zeiss).

Immunhistokemi

Væv blev fikseret i 4% PBS-buffer formalin, indlejret i paraffin (FFPE). 3 um objektglas blev anvendt til histologiske pletter. Immunhistokemi blev udført som tidligere [18] beskrevne. Følgende antistoffer blev anvendt: Ki67 (1:25, TEC-3, Dako), K8 /18 (1:100, GP11, Progen), vimentin (1:100, EPR3776, Abcam), E-cadherin (1:50 SC-8426, Santa Cruz Biotechnology), ß-Catenin (1:100, # 4270, Cell Signaling), CD56 (01:50, RNL-1, Abcam), Snail (1:200, Abcam), synaptophysin (1 :200, SY38, Abcam), chromogranin A (1:200, Abcam), Slug (1:100, Abcam), pERK (1:50, Cell Signaling), CD44 (1:50, Abcam). Alle objektglas blev scannet med en Pannoramic 250 dias scanner (3D Histech.com).

Statistik

Statistik blev beregnet med Excel, Prism og SPSS. Fejlsøjler indikerer standardafvigelser på middelværdien. Den t-test blev anvendt til at analysere data for signifikante forskelle. P-værdier 0,05 blev betragtet som signifikant og angivet i figurerne som følger:. * P≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001

Resultater

Generation af RASLO murin Lung Cancer model

Vi genererede en hidtil ukendt transgen musemodel (RASLO) for lunge adenocarcinom, som ved Cre-rekombinase-induceret fjernelse af en stopkodon drives af en konstitutivt aktiverede onkogene KRAS

Val12 under kontrol af et 1,8 kb kylling ß-actin-promotor. Konstruktionen udtrykker også et fusionsgen bestående af en S-tag (for immunhistokemi), luciferase (til in vivo detektion af tumorer) og kyllingeovalbumin (som en model tumorantigen) ved hjælp af en polyomavirus internt ribosomalt re-entry site ( fig. 1A). RASLO mus blev frembragt ved pronucleus injektion af C57BI /6 × FVB F1 embryoer. De resulterende dyr blev screenet for en vellykket integration af en funktionel konstruktion, ved inkubation af hale fibroblastkulturer med rekombinant Tat-Cre protein [19] for at udskære stop kassette og aktivere konstruktionen

in vitro

. Efterfølgende blev disse fibroblaster afbildet med en IVIS 200 bioluminescens kamera efter tilsætning af luciferin til dyrkningsmediet (fig. 1B) til at identificere dyr med en fuldt funktionel integration af RASLO konstruktionen. Fem stiftere blev identificeret baseret på PCR og luciferaseassays, hvoraf den ene viste kønsceller transmission.

Vi anvendte en adenovirus udtrykker CRE rekombinase (AdCre) intranasalt (i.n.) til RASLO mus. Lungetumorer udviklet i disse mus efter 6 til 8 uger, som kunne visualiseres

in vivo

ved detektion af bioluminescens efter i.p. injektion af luciferin (fig. 1C) og var makroskopisk påviselige

ex vivo

talrige hvide knuder dækker lungerne (fig. 1D). Tumorer, der opstår i de RASLO mus behandlet med AdCre omfattede flere papillære adenomer og invasive papillære adenokarcinomer (fig. 1E), hvilket er i overensstemmelse med KRAS drevet lungekræft modeller tidligere [4], der er beskrevet, [20]. Tumordannelse blev udelukkende etableret i lungen, som vi ikke observere tumordannelse i noget andet organ af AdCre-behandlede RASLO mus. Genomisk PCR-analyse af cellelinjer, der er etableret fra RASLO lungetumorer afslørede vellykket fjernelse af stop-kassette (fig. 1 F).

Reduceret Keratin Expression i SCLC

Tab af keratin udtryk er almindeligt observeret under EMT samt transformation fra et adenocarcinom til et småcellet carcinom (SCLC) [8]. Derfor er vi farvede menneskelige lunge adenokarcinomer og småcellet lungekræft enheder, for keratiner og kun observeret perinuclearly kondenseret keratin farvning i SCLC prøverne i forhold til stærke cytoplasmatisk farvning i kohæsivt voksende lunge adenokarcinomer (Fig. 2A øverste paneler). Et lignende farvningsmønster af keratiner blev observeret i cellekulturer af adenocarcinom og SCLC-cellelinier ved immunfluorescensfarvning (fig. 2A, bundpaneler). Endvidere har vi farvet for desmoplakin, at når fraværende, fører til mere invasive tumorvækst og er fraværende eller reduceret i mange humane epiteliale cancere [21]. I SCLC, desmoplakin var fraværende, mens NSCLC udtrykte desmoplakin (Fig. 2A). Vi yderligere undersøgt, om keratiner udtrykkes forskelligt i NSCLC og SCLC-cellelinjer. Faktisk SCLC-cellelinier udtrykte lille eller ingen mRNA for keratin 8, hvorimod NSCLC linier udtrykte høje niveauer af keratin 8 mRNA (fig. 2B). Salg

(A) Immunhistokemi af FFPE tumorprøver til pan Keratin af adenocarcinom lungen og en typisk SCLC (øverste paneler af a). Immunofluorescens af et adenocarcinom (HCC827) og SCLC cellelinie (GLC36) farvet for pan Keratin (rød) og desmoplakin (DSP i grøn) (A, lavere paneler). (B) Totalt RNA blev isoleret fra et panel af human SCLC og NSCLC cellelinier. Relativ mRNA-ekspression af keratin 8 blev målt ved QRT-PCR Mean relative ekspression af fire eksemplarer analyser for hver cellelinier er afbildet og SEM er angivet. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af en t-test: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Repræsentant for tre uafhængige forsøg.

Keratin Loss in vivo fører ikke til EMT eller en mere aggressiv tumor Biologi

For at undersøge om tab af keratin udtryk i adenokarcinomer af lungen funktionelt leads til værre tumorbiologi ved at inducere EMT eller en lille cellefænotype, krydsede vi RASLO mus med den inducerbare keratin KO line (KII). RASLO mus med en vildtype keratin type II klynge (KII + /+) eller huser en vildtype og en knock-out allel (KII +/-) eller en floxet og én knock-out allel (KII f /-) blev behandlet med AdCre intranasalt. Alle tre grupper af mus udviklede tumorer, der var detekterbar

in vivo

ved bioluminescens billeddannelse inden for 6 uger (fig. 3A). Seks uger efter AdCre behandling blev musene aflivet, og tumorbyrde og morfologi blev vurderet. For at bekræfte genotypen af ​​musene og lungetumorer, udførte vi PCR-reaktioner på DNA ekstraheret fra hele lungen af ​​musene med primere specifikke for RASLO konstruktionen, den slettede og floxet Keratin typen to klynge (fig. 3B). Alle mus viste tilstedeværelsen af ​​RASLO konstruere, og som forventet kun KII +/- og KII f /- viste indføring af DEL-locus, og udelukkende musene med den centrale investorinformation f /- allel gav det forventede PCR bånd (. Fig 3B) . Vi brugte tre forskellige foranstaltninger for at kvantificere tumor byrde af centrale investorinformation + /+, centrale investorinformation +/- og centrale investorinformation f /- dyr. Første har vi kvantificeret tumorbelastningen ved at måle mængden af ​​luciferase-mRNA i tumorbærende lunger hjælp af QRT-PCR (fig. 3C). Luciferaseekspression kan korreleres med tumor belastning, som det er co-udtrykkes af RASLO konstruktionen. Vi har ikke observere en statistisk signifikant forskel i luciferase mRNA-niveauer mellem grupperne. Dette indikerer, at en reduceret Keratin udtryk ikke fører til en øget tumor belastning.

(A) Grupper af RASLO transgene mus krydsede på forskellige Keratin II klynge alleler blev bedøvet med ketamin /Rompun, og 2 × 10

∧7 pfu AdCre blev administreret i seks uger tidligere. For tumor detektion blev musene injiceret i.p. med luciferin i 200 pi PBS og afbildes med en IVIS-200 (Xenogen) kamera. Bioluminescense sammenligne repræsentativ vildtype (ctrl), RASLO transgene med vildtype-Keratin locus (KII + /+), RASLO transgene med heterozygot Keratin cluster II-ekspression (KII +/-) og RASLO transgene mus med en knock-out og en floxede Keratin klynge II allel (centrale investorinformation f /-) er vist her. De forskellige grupper viste bioluminescens signaler med sammenlignelig intensitet. (B) allelspecifik PCR-analyser for DNA isoleret fra kryo-konserverede lungetumorer af RASLO mus til påvisning af FLOX, DEL, og RASLO alleler blev udført. (C) luciferase-mRNA-ekspression niveau blev bestemt i kryo-konserverede lungerne ved QRT-PCR for at estimere tumor belastning. Ekspressionsniveau blev normaliseret til 18 s RNA. (D) Kvantificering af tumorbelastning efter område på tre sektioner pr lunge. Tre repræsentative HE sektioner pr lunge blev analyseret med hensyn til procentdelen af ​​tumor område (øverste felt) og tumorstørrelse (nederste panel). FFPE sektioner blev farvet for K8 /18 og filmede med Pannoramic250 (3DHistech) dias scanner. Maksimal tumor diameter på op til tredive tumorer repræsentative tumor per dias blev målt med 3DHistech Pannoramic Viewer og den gennemsnitlige maksimale diameter sammenligne mellem de forskellige genotyper. (F) immunhistokemisk farvning for keratiner 8 og 18 i tumorer i RASLO Kii f /- mus. (G). Skalaen søjle repræsenterer 100 um. Vildtype RASLO tumorer (venstre) sammenlignet med centrale investorinformation – /- tumorer på højre vises som HAN pletter (øverste paneler) og Keratin 8 og 18 (lavere paneler) værdier er afbildet som gennemsnit +/- SEM. Statistisk signifikans blev beregnet ved hjælp af en t-test: * p≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001. Repræsentant for tre uafhængige forsøg.

Ud vi estimeret tumoren belastning ved at vurdere% af lunge område, som tumor på tre sagittale sektioner af lungerne ved to blindede uafhængige observatører. Dette viste, at tumorer af sammenlignelig størrelse udviklet i RASLO mus, der bærer de forskellige keratin genotyper (Fig. 3D). Desuden blev tumorstørrelsen bedømmes ved måling af tumordiameteren anvender billeder af scannede histologiske objektglas. En sammenligning mellem de forskellige genotyper viste ingen signifikante forskelle (Fig. 3E). Disse data tyder på, at fraværet af mindst en allel af keratin type II klynge ikke væsentligt påvirke tumorbiologi i denne KRAS-drevet model af lunge adenocarcinom.

Aktiveringen af ​​KRAS-konstruktionen kræver CRE medieret fjernelse af et 800 bp stort DNA-fragment indbefattende et stopkodon (fig. 1A). At slette hele type II keratin klynge, skal fjernes et DNA fragment på 0,68 Mbs [10], [22]. Derfor har vi ikke forvente, at alle tumorer i RASLO × KIIf /- mus ville være helt blottet for keratiner. At visualisere de tumorer i lungerne hos RASLO × KIIf /- mus, hvor floxed KII-allel blev fjernet farvede vi paraffinsnit for keratinerne 8/18. Omkring 30% af tumorer manglede helt keratin udtryk, der angiver, at faktisk cre-medieret deletion af den centrale investorinformation klyngen ikke var så effektiv som aktiveringen af ​​KRAS-konstruktionen (fig. 3F). Morfologisk, de keratin-mangel tumorer var typiske papillære adenomer og adenokarcinomer ikke kan skelnes fra de tilstødende keratin positive tumorer på samme glas (Fig. 3F), eller fra KRAS-induceret lunge tumorer fra keratin vildtype dyr (fig. 3G). For at undersøge, om keratin tab haft indflydelse på proliferation eller apoptose sats i KRAS drevet lungetumorer, vi bestemmes spredning satser og apoptose satser med Ki67 og kløvet caspase 3 farvning, henholdsvis, men ikke observere signifikante forskelle (fig. 4A, B) . Sammenfattende disse data beviser, at tab af keratin ekspression ikke påvirker tumorcelle størrelse KRAS drevet murine lunge adenocarcinomer og at tilstedeværelsen af ​​30% keratin negative tumorer ikke ændrede overordnede tumorbyrde, hvilket antyder, at tab af keratin ekspression er ikke direkte involveret i etableringen af ​​den lille celle og aggressiv fænotype af SCLC

(a) Ki-67 immunhistokemi af en centrale investorinformation -. /- mangelfuld tumor (sammenlign figur 5 fra samme serie af serielle sektioner). (B) Formel analyse af 6 områder pr lunge seks Keratin vildtype- og KII – /- tumorer afslører tilsvarende Ki-67 proliferationsindeks. Kløvet caspase 3 farvning viste kun enkelte positive celler (rød pil) i i Keratin mangelfuld (- /-). Og Keratin udtrykker tumorer (Kii)

Keratin Tab ikke påvirke tegnene på EMT og Neuroendokrine markører i lungetumorer

reduktionen af ​​keratin ekspression og kondensation i en punktformig perinukleær mønster er karakteristisk for neuroendokrine småcellet lungekræft og er almindeligt anvendt som en markør for EMT i adenocarcinomer. Selvom keratin negative tumorer opstår i AdCre-behandlede KRAS × KIIf /- mus adskilte sig ikke morfologisk fra deres tilstødende keratin positive tumorer, vi undersøgt, om de keratin negative tumorer udtrykte yderligere markører forbundet med EMT og SCLC fænotype

Immunhistokemi viste, at type III mellemliggende filament protein vimentin, som ofte opreguleres under epitelial til mesenkymale overgang (EMT) efter tab af keratin ekspression (Mani RE, 2008), blev hverken udtrykt i keratin-positive eller -negative tumorer KRAS × KIIf /- mus (fig. 5). Desuden chromogranin A, CD56, og synaptophysin, er immunhistokemiske markører typisk udtrykt i små celle neuroendokrine karcinomer i lungerne [23], [24]. Men begge keratin-positive og -negative tumorer i KRAS × KIIf /- havde mus ikke udtrykke nogen af ​​disse markører (Fig 5.). Positive kontroller for specificiteten af ​​farvninger er vist i figur S1. Vi analyserede derefter markører associeret med tab af celle-celle-kontakter i løbet EMT. Især tab af E-cadherin induceret af flere transkriptionelle repressorer som sneglen, og Slug [25] er typisk for EMT. Men vi fandt ikke, at keratin-mangel tumorer overudtrykt de transkriptionelle repressorer Snail, Slug eller tabt E-cadherinekspression (fig. 6).

Mus blev bedøvet og 2 × 10

7 PFU Adeno -CRE virus blev pipetteret på næsen af ​​musen, der skal inhaleres. Mus blev aflivet efter 6 uger og lunger blev musene fjernet og fikseret i formalin og paraffin indlejret. IHCs for K8 /18, vimentin, Chromogranin A (kromosomerne), CD56 og synaptophysin (synapto) er vist. En større forstørrelse af en Keratin negativ tumor er vist i højre kolonne og området boxed til venstre.

Seks uger efter Adeno-Cre administration blev musene aflivet, og lungerne af musene blev fjernet og formalinfikseret og paraffinindlejret. En større forstørrelse af en Keratin negativ tumor er vist i højre kolonne og området boxed til venstre. Farvninger af seriel sektion for EMT markører, dvs. E-cadherin, sneglen, Slug, og β-catenin vises.

Udvikling og vedligeholdelse af adherensovergange afhænger af en multiproteinkompleks af β-catenin, α catenin og E-cadherin. Ved aktivering af Wnt signalering, idet en betydelig del af ß-catenin i translokeres til kernen for at tænde genekspression forbundet med EMT [26]. Vi farvet for ß-catenin, men kunne ikke finde nogen nukleare ß-catenin udtryk i keratin vildtype eller mangelfulde tumorer (fig. 6). Vi har tidligere vist i cellelinier, der mangler den centrale investorinformation klynge, ZO1 og desmoplakin ikke længere placeret på membranen [22] Vi har forsøgt at farvning for desmoplakin og ZO1 på murine FFPE materiale. I fig S2 + er vist farvningen af ​​vildtype murin hud og KII /+ for ZO1. Vi kunne opdage nogle membranøs farvning i huden prøve, der tjente som en positiv kontrol. Men ser vi ikke nogen membranøs farvning i vildtype eller centrale investorinformation – /- tumorer. Desuden har vi farvet RASLO wild-typ og keratin mangelfulde tumorer for pMAPK og CD44 og ikke observere og forskel (fig. S2). Sammenfattende havde keratin tab i vores KRAS lungetumor model ikke føre til udvikling af tumorer med en lille cellefænotype eller ekspression af markører associeret med EMT. Disse data indikerer, at keratin tab i sig selv ikke er ansvarlig for indtræden af ​​EMT eller udvikling af en lille cellefænotype i adenocarcinomer i lungen i musemodellen præsenteres her.

Discussion

Tab af keratin udtryk er kendetegnende for både småcellet lungecancer og EMT og er blevet foreslået at forbedre invasion og metastase. Endvidere i adenocarcinomer i lungen, som er blevet behandlet med hidtil ukendt EGFR tyrosinkinaseinhibitorer, omdannelse til et lille cellefænotype og EMT er blevet identificeret som en af ​​flere resistensmekanismer at unddrage terapi [8].

For