PLoS ONE: leverkræft-Afledt Hepatitis C Virus Core Proteiner Shift TGF-beta Svar fra Tumor Suppression til Epithelial-Mesenchymale Transition

Abstrakt

Baggrund

Kronisk hepatitis C-virus (HCV) infektion og tilhørende levercirrose udgør en væsentlig risikofaktor for hepatocellulært carcinom (HCC) udvikling. TGF-β er en vigtig drivkraft for liver fibrogenese og kræft; dog dens konkrete indvirkning i human cancer progression stadig dårligt kendt. Formålet med denne undersøgelse var at undersøge den rolle, HCC-afledt HCV core naturlige varianter på kræft progression gennem deres indvirkning på TGF-β-signalering.

vigtigste resultater

Vi leverer dokumentation for, at HCC- afledt core protein ekspression i primære humane eller muse hepatocyt lindrer TGF-beta svar i form eller væksthæmning eller apoptose. I stedet i disse hepatocytter TGF-β var stadig i stand til at inducere en epitelial til mesenkymale overgang (EMT), en proces, der bidrager til at fremme celleinvasion og metastase. Endvidere viser vi, at forskellige tærskler for Smad3 aktivering diktere TGF-β reaktioner i leverceller, og at HCV kerneprotein, ved at nedsætte Smad3 aktivering, kan skifte TGF-β væksthæmmende effekter til tumorfremmende responser.

Konklusion /betydning

Vores data viser kapaciteten af ​​hepatocytter til at udvikle EMT og plasticitet under TGF-β, understrege betydningen af ​​HCV core protein i den dynamiske af disse virkninger og bevis for et paradigme, hvor en viral protein impliceret i onkogenese er i stand til at flytte TGF-β svar fra cytostatiske effekter til EMT udvikling

Henvisning:. Battaglia S, Benzoubir N, Nobilet S, Charneau P, Samuel D, Zignego aL, et al. (2009) leverkræft-Afledt Hepatitis C Virus Core Proteiner Shift TGF-beta Svar fra Tumor Suppression til Epithelial-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 4 (2): e4355. doi: 10,1371 /journal.pone.0004355

Redaktør: Mauricio Rojas, Emory University, USA

Modtaget: Juli 22, 2008; Accepteret: 18. december 2008; Publiceret: 3 feb 2009

Copyright: © 2009 Battaglia et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af INSERM, Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), Agence Nationale de Recherche sur le SIDA (ANR) og Det Europæiske Fællesskab (VIRGIL). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

epithelial til mesenkymale overgang (EMT) defineres som en proces, hvor epitelceller mister deres fænotypiske kendetegn og erhverve mesenkymale celles funktioner. Mens EMT er involveret i forbindelse med fosterudviklingen det spiller også en rolle i skabelsen af ​​fibroblaster under organfibrose i voksne væv, og kan bidrage til den metastaserende udvikling [1]. Faktisk EMT bliver i stigende grad anerkendt som et afgørende skridt, der fremmer celle migration, tumoral invasionsevne og metastase [2], og har også været impliceret nylig i kræft stamceller fremkomsten [3]. I leveren er hepatiske stjerneformige celler (HCS) betragtes som de store fibrotiske precursorceller der transdifferentiate til fibrogene, ekstracellulære matrix-producerende myofibroblaster i inflammatorisk levervæv ved TGF-β-signalering, mens hepatocytter undergå apoptose ved signalering med denne cytokin. Men identifikation af forskellige fibrogene populationer fra hinanden af ​​hjemmehørende stjemeformige celler [4] samt konvergerende resultaterne af de seneste undersøgelser har udfordret paradigme for HSC som væsentlig kilde til leveren myofibroblaster og udledte en fremtrædende rolle for hepatocytter i leveren fibrogenese. Faktisk er det blevet rapporteret for nylig, at rotte eller mus hepatocytter reagerer både

in vitro

in vivo

til TGF-β ikke kun i form af cellevækst hæmning og apoptose, men også i form af induktion af EMT [5] – [7]. Følgelig er det blevet vist, at TGF-β og laminin 5 omdanne ikke-invasive hepatocellulære carcinomceller i invasive celler gennem induktion af et komplet [8] EMT. Men selv om de molekylære mekanismer bag EMT udvikling er blevet omfattende undersøgt, lidt dokumentation er tilgængelig om dets fysiologiske funktioner og relevans i humane patologier.

En af de mekanismer, hvorved cellerne undergår neoplastisk transformation og flygte fra normal kontrol vækst indebærer en ændret reaktion på de cytostatiske virkninger af TGF-β [9], [10]. Endvidere i de senere faser af tumorigenese, kan TGF-β stimulere invasion primært gennem induktion af EMT. Det er nu generelt accepteret, at TGF-β har en dobbelt rolle i onkogenese og kan fungere som en tumorsuppressor eller tumor promotor faktor afhængig cellulær kontekst [11], [12], men de mekanismer involveret i kontakten af ​​TGF-p-responser mod malignitet er ikke fuldt forstået.

In vivo

, har det vist sig, at tabet af TGF-β signalering faldt betydeligt tumor ventetid og øget antallet af metastaser i flere musemodeller [13].

TGF-β initierer reaktioner ved kontaktes to typer af transmembrane serin /threoninkinaser kaldet receptorer type i og type II, fremme aktivering af type i af type II-kinase. Den aktiverede type I receptor udbreder derefter signalet til cellekernen ved phosphorylering Smad2 og Smad3. Når phosphoryleret, Smad2 og Smad3 associeret med den delte partner Smad4 og komplekserne ophobes i kernen, hvor de regulerer ekspressionen af ​​TGF-β målgener gennem kooperative interaktioner med transkriptionelle partnere [14], [15], [16]. Afbrydelse af TGF-β-signalering, enten via mutations-inaktivering af bestanddele af signalvejen, eller ved modulation af deres ekspression eller funktion, vides nu at spille en vigtig rolle i tumorudvikling. Trods alle disse beviser, den kliniske konsekvenser af TGF-β i metastaser progression er fortsat uklart.

Kronisk hepatitis C-virus (HCV) infektion og tilhørende levercirrose udgør en væsentlig risikofaktor for hepatocellulært carcinom (HCC) udvikling, og trods epidemiologiske beviser forbinder HCV-infektion til HCC, den kliniske effekt af denne virus på hepatocarcinogenese er stadig uklart [17]. Fordi HCV RNA viser høj genetisk variabilitet, kronisk HCV-infektion resulterer i en kompleks population af forskellige, men tæt beslægtede virale varianter almindeligvis omtales som quasispecies [18], [19]. Der er observeret ikke-tilfældig fordeling af HCV quasispecies mellem tumor- og ikke-tumorale leveren antyder muligheden for en markering af quasispecies med modificerede funktionelle egenskaber der kan bidrage til fibrose udvikling samt tumorigenese proces [20].

Den strukturelle komponent af HCV, har HCV core protein påkaldt sig særlig opmærksomhed efter sin karakterisering og forskellige rapporter har antydet sin potentielle rolle i HCV patogenese. Faktisk ud over sin rolle i viral RNA-pakning, HCV kerneprotein er blevet rapporteret at interagere med flere cellulære proteiner, såsom TNFR [21], PKR [22], Stat3 pRB eller p53 [23] fører til modulering af transskription af gener er afhængige af disse kaskader og følgelig til modulering af en række cellulære regulatoriske funktioner. Faktisk har mange data antydede en mulig involvering af HCV-kerneprotein i modulationen af ​​celleproliferation og apoptose selv om der er kontroversiel givet nogle resultater, kerneprotein er blevet rapporteret at udvise pro eller anti-apoptotiske virkninger afhængigt af det eksperimentelle system anvendt [24] , [25]. Desuden er disse undersøgelser blev hovedsageligt udført med apoptotiske agenter fra TNF-familien og ikke med TGF-β. Denne uoverensstemmelse kan også skyldes genetisk heterogenitet forskellige HCV-genotyper.

Vi og andre har tidligere demonstreret en interaktion mellem Smad3 og HCV-kerneproteinet [26], [27]. Interessant vi også observeret, at forskellige naturlige kerne varianter isoleret fra tumor eller non tumorknuder kunne forskelligt binde Smad3, og følgelig inhibere TGF-β inducerede Smad3 transkriptionel aktivitet tyder på, at HCV-kerneproteinet kan modulere TGF-β-signalering og dens downstream biologiske reaktioner [ ,,,0],27]. Vi hypothetised at den molekylære heterogenitet af HCV observeret i inficerede patienter kan inddrages i det kliniske forløb af udviklingen af ​​kræft.

Overekspression af TGF-β og ledsagende fald i hepatocyt væksthæmning er observeret hyppigere i HCC støtter opfattelsen af, at TGF-β kunne spille en tumorfremmende rolle i leverkræft [28]. Dog er den funktionelle konsekvenser af TGF-β i lever tumorigenese samt konsekvenserne af EMT i HCC udvikling endnu ikke belyst. Ligeledes har effekter af onkogen viral hepatitis B eller C proteiner på EMT udvikling ikke blevet undersøgt i løbet af leverkarcinom proces. Demonstration samspil mellem HCV-infektion og TGF-β medieret EMT kan give en ny model til at opnå indsigt i mekanismerne i leveren carcinogenese.

I denne undersøgelse har vi gjort brug af naturlige HCV kerne varianter isoleret fra HCV-relateret HCC væv til at analysere deres indvirkning på den dobbelte funktion af TGF-β i en pathophysiogically-relevant tilstand. Således har vi undersøgt effekterne af kerneprotein varianter isoleret fra både tumor eller non tumor cirrotiske områder i primære humane hepatocytter; faktisk, cirrose er en velkendt præneoplastiske tilstand, der er forbundet i mindst 90% af tilfældene af HCC. Ved hjælp af disse varianter, vi leverer bevis for et paradigme, hvor et viralt protein er i stand til at flytte TGF-svar fra cytostatiske effekter til EMT udvikling.

Materialer og metoder

Materialer

rekombinant TGF-β1 og rekombinant TRAIL /Apo2L blev indkøbt fra Abcys, den kemiske inhibitor af TGF-β signalering SB-431.542, der virker ved specifikt at interferere med type i receptoren [29] var fra Calbiochem, det fluorescerende farvestof DiOC

6 (3,3’dihexylocarbocyanine iodid) var fra Molecular Probes.

vektorer Salg

Fuld længde HCV-kerne-sekvenser blev amplificeret fra HCV-RNA ekstraheret fra tumor (T) eller cirrotiske (NT) knuder af en patient (patient B) inficeret med HCV 1b genotype som tidligere beskrevet [22]. PCR-produkter blev direkte sekventeret og indsat i pcDNA3.1-vektoren. Sekvensen af ​​disse to varianter er tidligere blevet beskrevet [27]. T sekvens adskiller sig fra NT én efter 2 ændringer i aa 118 (N → D) og aa 189 (A → V).

(CAGA)

9-Luc blev venligst stillet til rådighed af Dr. JM Gauthier . Ekspressionsvektorerne for HA-TβRI.act, og Flag-TβRImL45.act var en gave fra Dr. Y.E. Zhang [30]. Den pRetroSuper-puro plasmid indeholdende korte hårnåle RNA antisense mod Smad3 blev venligst stillet til rådighed af Dr. J. Massagué [31]. En pRetroSuper-puro plasmid indeholdende scramble korte hårnåle-RNA blev anvendt som kontrol. pIRES-GFP blev opnået fra Stratagene, pCMV-Renilla-luc var fra Promega. Myc-Smad3 ekspressionsvektoren er tidligere beskrevet [32].

Transgene mus

For at opnå transgene mus, HCV-kerne-cDNA’er isoleret fra tumor (T) eller cirrotiske knuder (NT) blev klonet nedstrøms af hepatitis B virus regulatoriske elementer og indføres i C57BL /6 embryoner (Institut Clinique de la Souris, Strasbourg, Frankrig). Transgene mus blev identificeret ved at underkaste 1 ug hale-DNA til amplifikation ved PCR.

Cellekultur

Den humane hepatomcellelinje Huh7 [33] blev holdt i Dulbecco Modified medium indeholdende 10% føtalt kalv serum (FCS). Celler blev transficeret med de forskellige vektorer under anvendelse af LipofectAMINE fremgangsmåden (Invitrogen) og stabile transfektanter blev selekteret ved at inkubere cellerne med antibiotiket svarende til selektionsgenet.

Isolering og dyrkning af primære hepatocytter

primære muse hepatocytter blev isoleret ved liver perfusion med en collagenase blanding som tidligere beskrevet [34]. Efter isolering blev hepatocytter resuspenderet i Williams-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, 250 ng /ml fungizon ( “udpladningsmedium”) og udpladet med en densitet på 3 × 10

4 celler /cm

2. Efter 4 timer blev serumholdigt medium fjernet og cellerne blev dyrket i Williams-medium suppleret med 1 mg /ml bovint serumalbumin, 100 ug /ml streptomycin, 100 U /ml penicillin, 250 ng /ml fungizon og behandlet med TGF β 2 ng /ml eller SB431542 1 uM.

Primære humane hepatocytter blev isoleret fra raske levervæv af kirurgisk leverbiopsiprøver prøver indsamlet efter informeret samtykke opnået fra patienten undergår terapeutisk partiel hepatektomi for levermetastaser og godartet levertumor. Collagenase (Sigma-Aldrich) perfusion (500 ug /ml, 2,4 mg /ml CaCl

2 i HEPES-buffer, pH 7,4) blev efterfulgt af grundig vask af levervævet med HEPES /EDTA-buffer (pH 7,4) ved anvendelse af et kateter indsat ind i fartøjer på snitfladen af ​​resekterede fragment. Celler blev derefter vasket to gange og hepatocytter blev separeret fra nonparenchymatous celler ved Percoll fraktionering (30% isotonisk Percoll-opløsning, centrifugeret ved 450 g i 4 min) og straks inficeret ved 37 ° C i 2 timer med lentivirusvektorer, vasket og udpladet i Williams-medium suppleret som beskrevet andetsteds [35]. Tolv timer senere, blev de behandlet eller ikke med TGF-β eller SB431542 for forskellige tidsperioder.

Lentivirale vektorer

TRIP-AU3-CMV-T, TRIP-AU3-CMV-NT og TRIP-AU3-CMV-CINV vektorer blev opnået ved at erstatte GFP i TRIP-AU3-CMV-GFP med cDNA, der koder for HCV centrale sekvenser. En omvendt kernesekvens TRIP-AU3-CMV-CINV blev anvendt som kontrol.

vektorpartikler blev fremstillet ved den transiente calciumphosphat cotransfektion af 293T-celler som en tidligere beskrevet [36]. Vektor koncentrationer blev normaliseret ifølge p24 (HIV-1 capsid protein) indhold af supernatanter.

Western blotting

Celler blev vasket to gange med PBS og lyseret i RIPA-buffer indeholdende 0,5% SDS og Benzon nuklease. Proteiner blev kvantificeret med Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad, Frankrig) og 30 ug ekstrakter blev separeret på SDS-polyacrylamidgel, overført på nitrocellulose membran og blottet under anvendelse af forskellige primære antistoffer rettet mod HCV kerneprotein, E-cadherin, Fibronectin (Santa Cruz Biotechnology), vimentin (Chemicon), phospho-Smad3 (cellesignalering), Smad3 (Abcam), Flag, Myc og HA-tags (Sigma). Membraner blev afsløret under anvendelse af et chemioluminescence detektion kit (ECL Plus, GE Healthcare).

Cellefarvning

Primære muse hepatocytter blev dyrket i 48 timer med eller uden TGF-β (2 ng /ml) og rutinemæssig plet hematoxylin-eosin blev udført efter fiksering af celler med EtOH 70% ved 4 ° C i 15 minutter.

Immunfluorescensfarvning

celler blev vasket med PBS og fikseret med en 4% PFA opløsning ved 4 ° C i 20 minutter efterfulgt af methanol permeabilisering i 5 min ved -20 ° C. Celler blev derefter inkuberet med et primært muse-anti-vimentin, kanin-anti-αSMA eller kanin anti-E-cadherin antistof og derefter med en Alexa Fluor 488-konjugeret anti-muse-antistof og et Alexa Fluor 594-konjugeret gede-anti-kanin-antistof (Molecular Probes). De blev derefter farvet med Hoechst og undersøgt ved fluorescensmikroskopi.

celleproliferation og apoptose analyser

Cell proliferation blev vurderet ved BrdU inkorporering (Roche), blev cellernes levedygtighed og caspase 3-aktivitet estimeres ved en CellTiter-Glo levedygtighed luminescerende celleassay eller CaspaseGlo 3/7 assay henholdsvis (Promega) ifølge producentens instruktioner.

mitokondrie transmembranpotentiale (A ^ m) blev evalueret ved farvning af celler (10

6) med fluorescerende farvestof DiOC

6 i en endelig koncentration på 40 nM i 15 minutter ved 37 ° C. Celler blev straks dissocieret ved trypsin og deres fluorescens estimeret ved analyse med en FACScan flowcytometer (Becton-Dickinson) ved hjælp af FL1 kanal [37].

Cell sortering

Flowcytometrisk analyse og sortering var udført under anvendelse af en FacsDiva flowcytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Forward Scatter (FSC) og sidespredning (SSC) blev opsamlet gennem et filter. GFP signal blev opsamlet i FL1-kanalen. En let gate blev trukket i VSK versus FSC at udelukke døde celler /snavs. Celler i porten blev vist i en biparameter histogram (FS versus FL1) og endelige gating indstillinger bestemt til at indsamle de mærkede celler. GFP-positive celler blev sorteret ved 5000 celler /sek.

Transkriptionel analyse

Celler blev cotransficeret med vektorer, der koder for genet af interesse sammen med den CAGA-luc reporter plasmidet og Renilla luciferase plasmid til normalisere resultaterne. De blev inkuberet 24 timer senere i fravær eller nærvær af TGF-β i yderligere 18 timer. Luciferaseaktivitet blev målt med Dual Luciferase reporter assay (Promega) ifølge producentens instruktioner.

Statistisk analyse

signifikans mellem de forskellige betingelser og deres kontrol blev bestemt ved parrede Students

t

test anvendelse af GraphPad Prism software. En p-value≤0.05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

HCV kerne varianter lindre TGF-β cytostatiske svarene og øge TGF-β medierede EMT i mus eller humane primære hepatocytter

Vi har tidligere påvist, at når forbigående udtrykt i leverceller, HCV kerneproteiner isoleret fra tumor eller cirrotiske knuder binde Smad3 forskelligt, og at denne interaktion inhiberer Smad3-afhængig transkriptionel aktivitet [27]. For at sikre den fysiologiske relevans af denne observation, vi først undersøgt virkningen af ​​en sådan bindende for TGF-β biologiske reaktioner i hepatocytter isoleret fra transgene mus, der udtrykker disse HCV tumor (T) eller cirrotiske (NT) core varianter under kontrol af HBx promotor og som for det meste udtrykt i leveren. Hepatocytter blev isoleret fra lever fra 2 måneder gamle mus og behandlet eller ej med TGF-β i 48 timer. Vi observerede, at TGF-β var mindre potent til inhibering af celleproliferation i hepatocytter isoleret fra transgene mus, der udtrykker HCV-kerne-proteinerne end i hepatocytter isoleret fra en kontrol mus (fig. 1A). Følgelig blev cellelevedygtighed mindre reduceret med TGF-β i celler, der udtrykker de centrale proteiner i forhold til vild type celler (fig. 1B). Vi fandt også, at ekspressionen af ​​HCV-kerneproteiner inhiberede TGF-β-medieret apoptose som vist ved caspase 3-aktivering, som repræsenterer en veldefineret kendetegnende for apoptose (fig. 1C). Interessant T core ekspression faldt TGF-β-medieret apoptose eller inhibering af cellelevedygtighed i højere grad end NT kerne visende en funktionel betydning af øget interaktion af denne kerne variant med Smad3 [27]. For at kontrollere, at denne HCV kerne-induceret reduktion af apoptose observeret efter TGF-β behandling var specifik, brugte vi en anden induktor af apoptose, TRAIL. Mus hepatocytter som udtrykker eller ikke HCV-kerne-proteinerne svare TRAIL på lignende måde i form af caspase 3-aktivering antyder, at den samlede apoptose processen ikke blev modificeret ved kerne-ekspression (fig. 1D). Dette resultat er i overensstemmelse med en tidligere rapport indikerer, at HCV kerne fører til TRAIL-induceret apoptose gennem aktivering af mitokondrie-signalvejen [38].

(A, B, C) Mus hepatocytter fremstillet af lever fra transgene mus, der udtrykker eller ikke HCV kerneproteiner isoleret fra tumor (T) eller cirrotiske (NT) væv blev behandlet med TGF-β i 48 timer før bestemmelse af celleproliferation, estimeret ved BrdU-inkorporering (A), cellelevedygtighed (B) eller caspase 3-aktivitet (C). (D) Celler blev behandlet med TRAIL (20 ng /ml) i 18 timer inden bestemmelsen af ​​caspase3 aktivitet. Resultaterne repræsenterer middelværdien +/- SD af triplikater fra et repræsentativt eksperiment. * P ≤ 0,05, ** p≤0.005, *** p≤0.0005.

Flere linjer af beviser støtter den tanke, at epitel cancerceller mister deres evne til at reagere på TGF-β cytostatiske virkninger, men i nogle tilfælde bevarer deres evne til at reagere på andre TGF-β medierede funktioner som EMT. Den observation, at HCV-kerneproteiner interfererer med evnen af ​​TGF-β til at udføre cellevækstinhiberingen og celledrab fik os til at overveje muligheden af, at disse proteiner kunne påvirke TGF-β-medieret EMT. Siden seneste resultater har vist, at TGF-β kunne fremkalde en EMT i modne mus hepatocytter

in vitro

[6], [7], undersøgte vi, om HCV kerne proteiner kunne modulere evne TGF-β til at fremme EMT i de samme primære hepatocytter. Kontrast mikroskopi observation afslørede, at efter behandling i 30 timer med TGF-p nogle hepatocytter erhvervet en fibroblast-lignende morfologi antyder EMT og at denne virkning var mere udtalt, når disse hepatocytter udtrykke kerneproteinet viser, at celle plasticitet kan øges i muse hepatocytter som udtrykker HCV-kerne T-protein (fig. 2A). Denne observation blev forstærket af videomicroscopy observation (data ikke vist). For at bekræfte, at disse observerede fænotypiske ændringer var reflekterende af en EMT, vi udførte immunfluorescens analyser på hepatocytter isoleret fra kontrol eller fra transgene mus. I overensstemmelse med tidligere resultater, blev TGF-β behandling af kontrol- mus hepatocytter ledsaget af en meget kraftig stigning i polymeriseringen af ​​mesenchymale markør alpha glatmuskelactin (αSMA) stemte overens med en fænotype af EMT (fig. 2B). Interessant HCV kerneproteiner og især T man kunne øge αSMA fibrene i fravær af exogent tilsat TGF-β. For at vurdere om autokrine frigivelse af TGF-β kunne være involveret i dannelsen af ​​αSMA stress fibre i HCV kerne udtrykker celler, brugte vi en specifik TGFβR1 inhibitor, SB431542. Når disse udtrykkende celler blev behandlet med denne inhibitor, αSMA fibre helt forsvundet, hvilket antyder, at virkningen af ​​kerneproteinet på EMT udvikling medieres af en endogen produktion af TGF-β (Fig. 2B). I overensstemmelse analyser Western blots viste også, at E-cadherin ekspression, en epitelial markør vides at være tabt i mesenchymale celler, var stærkt reduceret med TGF-β og fuldt restaureret ved tilsætning af SB431542 (fig. 2C).

(A) morfologiske forandringer af muse hepatocytter som udtrykker eller ikke HCV T-kerneprotein observeret efter 48 timers dyrkning med eller uden TGF-β (2 ng /ml). (B) hepatocytter isoleret fra transgene mus, der udtrykker HCV kerneproteiner blev behandlet med TGF-β (2 ng /ml) eller SB431542 (1 uM) i 48 timer og ekspressionen af ​​αSMA blev undersøgt ved immunfluorescens under anvendelse af et αSMA antistof. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (C) hepatocytter isoleret fra transgene mus, der udtrykker HCV kerneproteiner blev behandlet med TGF-β eller SB431542 i 48 timer og ekspressionen af ​​E-cadherin blev bestemt ved Western blotting. Anti-p38 western blotting blev anvendt som kontrol loading. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

For at få yderligere beviser for, at HCV kerne proteiner kunne modulere størrelsen af ​​de negative vækst regulatoriske virkninger af TGF-B vi også udført eksperimenter i humane primære hepatocytter. Frisk isolerede hepatocytter blev inficeret med lentivirus koder for de T eller NT kerne varianter eller en omvendt kernesekvens som kontrol. Western blot analyser bekræftede ekspressionen af ​​kerneproteinerne (fig. 3A). Celler blev derefter behandlet eller ikke med TGF-β i 96 timer inden analyse for cellelevedygtighed eller caspase 3-aktivering. Både TGF-β-medieret fald i cellelevedygtighed (fig. 3B) og apoptotiske responser (fig. 3C) blev afhjælpes ved HCV-kerne-ekspression bekræfter resultaterne opnået i mus hepatocytter.

Friskt isolerede celler blev inficeret med lentivirus koder for HCV core protein varianter eller en omvendt kernesekvens som kontrol (CTL) (A) Niveauer af kerne-ekspression blev vurderet ved Western blot-analyse forskellige tidspunkter efter lentivirus transduktion. (B, C) Bestemmelse af cellelevedygtighed (B) eller caspase 3-aktivitet (C) blev udført efter 96 timers behandling med TGF-β (5 ng /ml). Resultaterne repræsenterer middelværdien +/- SD af triplikater fra et repræsentativt eksperiment. * P ≤ 0,05, *** p≤0.0005.

Selvom TGF-β-medieret EMT er blevet beskrevet i primære mus eller rotte hepatocytter samt i cancerøse humane celler, ikke en sådan undersøgelse har været endnu undersøgt i primære humane hepatocytter in vitro. Interessant observerede vi, at humane hepatocytter kunne udtrykke stress fibre som pigge hovedsageligt placeret i membran fremspring under TGF-β behandling (fig. 4A). Ekspression af HCV-kerneproteiner steg denne TGF-β virkning. Også her ekspression af HCV kerneproteinerne øget αSMA polymerisation selv i fravær af exogent tilsat TGF-β. Denne effekt kan involvere endogen TGF-β, da det blev fuldstændig ophævet i nærvær af TGF-receptor-inhibitor. For at underbygge dette resultat, studerede vi udtryk for en anden mesenchymale markør, vimentin. I overensstemmelse med de data, der er opnået med αSMA, observerede vi, at vimentin udtryk i kontrolrum hepatocytter blev markant forøget efter TGF-β behandling, og at denne stigning var større, når hepatocytter udtrykte NT kernen protein og endnu større, når T kerne blev udtrykt (Fig. 4A ). Tilsvarende kerneproteiner inducerede vimentin ekspression og polymerisering i fravær af exogent tilsat TGF-β. Dette udtryk blev fuldstændig vendt af TGFbRI inhibitoren tyder igen at endogent produceret TGF-β kan være ansvarlig for denne effekt.

(A) Ekspression af αSMA eller vimentin blev estimeret ved immunofluorescens-analyse efter behandling med TGF-β ( 5 ng /ml) eller SB431542 (1 uM). (B) Ekspression af fibronectin eller E-cadherin blev estimeret ved Western blot-analyse under de samme forsøgsbetingelser. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Western blots analyser fremgår en lavere ekspression af E-cadherin efter TGF-β behandling, som var fuldstændig genvundet i nærvær af TbRI inhibitor. Tværtimod blev ekspression af mesenchymale markør fibronectin stærkt forøget ved TGF-β (Fig. 4B).

Taget sammen disse data antyder kraftigt, at HCV-kerne forstyrre TGF-β svar i form af cellevækstinhiberingen og apoptose i hepatocytter isoleret fra transgene mus samt humane primære hepatocytter. Bemærkelsesværdigt, er TGF-p-responser, i form af EMT forøges ved ekspression af T eller NT kerne proteinvarianter i både mus og humane hepatocytter. Dette kan afspejle både direkte virkninger af kernen på TGF-β-induceret EMT og reduktion af TGF-β induceret apoptose ved kerneproteinet, hvilket tillader flere celler til at undergå EMT sammenlignet med kontrolceller.

HCV-kerne modulerer TGF -p reaktioner i Huh7-celler

for at dissekere de molekylære mekanismer aktiveres af HCV-kerneproteinet, vi etableret Huh7 cellelinjer der stabilt udtrykker T-kerneproteinet (fig. 5A). Kerneprotein inhiberede TGF-β-medieret Smad3 transkriptionel aktivitet målt ved ekspression i disse celler af et reporterplasmid, der indeholder CagA elementer, der tidligere er vist at blive transaktiveret af TGF-β gennem Smad proteiner (ikke vist). Overensstemmelse med de observerede i primære hepatocytter resultater, fandt vi, at HCV kerneprotein var i stand til at nedsætte den inhibitoriske virkning af TGF-β på cellelevedygtighed (fig. 5B). Tilsvarende blev TGF-β-medieret apoptose reduceret i celler, der udtrykker HCV-kerne som vist ved caspase3 aktivering (fig. 5C) eller tab af mitochondriemembranpotential, som repræsenterer en anden tidlig markør af apoptose (fig. 5D).

(A) Ekspression af HCV-kerneprotein bestemt ved Western blot analyse. (B, C) Celler blev behandlet med TGF-β (5 ng /ml) i 48 timer før bestemmelse af cellelevedygtighed (B) eller caspase3 aktivitet (C). Resultaterne repræsenterer middelværdien +/- SD af triplikater fra et repræsentativt eksperiment. *** P≤0.0005 (D) mitochondrial membranpotentiale (A ^ m) blev estimeret ved FACS-analyse i celler behandlet med TGF-β i 48 timer. Efter farvning med DiOC

6 (3), celler med lav fluorescens intensitet svarende til lav (A ^ m) blev gated og deres antal udtrykt i procent af den samlede befolkning. Et repræsentativt eksperiment er vist. (E) Celler blev behandlet med TGF-β i 48 timer og E-cadherin eller αSMA ekspression blev vurderet ved immunofluorescensanalyse. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (F) Sammenlignende ekspression af HCV-kerneproteiner. Ekstrakter fra dyrkede celler, der udtrykker kerneproteinet (Huh7, menneskelige eller muse primære hepatocytter) eller fra lever fra HCV-relaterede HCC patienter blev analyseret ved Western-blot. Anti-p38 western blotting blev anvendt som kontrol loading.

Vi derefter bestemt EMT proces i Huh7 cellelinier, der udtrykker denne kerneprotein. Immunfluorescens undersøgelser viste, at αSMA var stærkt polymeriseret efter TGF-β behandling forbundet med en kraftig nedgang i E-cadherin fra cellemembranerne (fig. 5e). αSMA polymerisering blev øget i centrale udtrykker celler. Interessant nok i nærvær af kerneproteinet, αSMA fibre forekom selv i fravær af exogent tilsat TGF-β. Ekspressionen af ​​αSMA blev ledsaget med forankringsuafhængig vækst, der blev observeret i fravær af exogent tilsat TGF-β i HCV kerneprotein udtrykkende celler (data ikke vist).

Tilsammen indikerer disse data, at virkningerne af HCV-kerneproteiner på TGF-β reaktioner observeret i primære hepatocytter blev gengivet i en human hepatoma-cellelinie, som således kan udgøre et nyttigt værktøj til at dissekere de mekanismer, der er involveret i moduleringen af ​​TGF-p responser.

Vi sammenlignede også protein kerne udtryk i vores forskellige cellulære modeller og i uddrag fra leveren af ​​HCV /HCC patienter. Den stærkeste ekspression opnåedes i humane hepatocytter, hvilket er konsistent med en effektiv lentiviral transduktion. HCV kerneprotein ekspression kunne også påvises i forskellige lever ekstrakter om end på forskellige niveauer. Interessant core udtryk i disse ekstrakter var sammenlignelig med den observeret i mus hepatocytter (fig. 5F).

Differential tærskler for Smad3 aktivering switch TGF-β reaktioner fra tumor undertrykkelse til tumorpromotion

for at analysere mere detaljeret bidrag Smad aktivering i virkningerne af HCV kerne på TGF-β reaktioner, vi gjort brug af en mutant af TGF-β-receptor i, TβRImL45Act der bevarer en konstitutivt aktiv kinase domæne, men er ude af stand til at fremkalde Smad phosphorylering. Huh7-celler blev transficeret med denne mutant eller med vildtype aktiverede form af TβRI, sammen med et plasmid, der koder for HCV-kerne og GFP til påvisning de transficerede celler. Immunofluorescens analyse blev udført 48 timer senere. .