PLoS ONE: p120RasGAP Er en Mediator af Rho Pathway Aktivering og Tumorigenicitet i DLD1 Colorectal Cancer Cell Line

Abstrakt

KRAS

er muteret i ~ 40% af kolorektal cancer (CRC), og der er begrænsede effektive behandlinger for avancerede

KRAS

mutant CRC. Derfor er det afgørende, at downstream mediatorer af onkogene KRAS fortsat blive undersøgt. Vi identificerede p190RhoGAP som værende phosphoryleret i DLD1 CRC cellelinie, som udtrykker en heterozygot

KRAS

G13D allel, og ikke i DKO4 hvor mutant allel er blevet slettet ved somatisk rekombination. Vi fandt, at en allestedsnærværende bindende partner p190RhoGAP, p120RasGAP (RasGAP), udtrykkes i meget lavere niveauer i DKO4 celler i forhold til DLD1, og dette udtryk er reguleret af KRAS. Redning af RasGAP ekspression i DKO4 reddet Rho-aktivering og delvist reddet tumorigenicitet i DKO4 celler, hvilket indikerer, at kombinationen af ​​mutante KRAS og RasGAP ekspression er afgørende for disse fænotyper. Vi konkluderer, at RasGAP er en vigtig effektor af mutant KRAS i CRC

Henvisning:. Organ SL, Hai J, Radulovich N, Marshall CB, Leung L, Sasazuki T, et al. (2014) p120RasGAP Er en Mediator af Rho Pathway Aktivering og Tumorigenicitet i DLD1 Colorectal Cancer Cell Line. PLoS ONE 9 (1): e86103. doi: 10,1371 /journal.pone.0086103

Redaktør: Juliet Spencer, University of San Francisco, USA

Modtaget: 28 oktober, 2013; Accepteret: December 5, 2013; Udgivet: 21 Jan 2014

Copyright: © 2014 Organ et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes i dele af tilskud fra den canadiske Institutes of Health Research MOP-64.345 (MST), Cancer Research Society of Canada (MI), og Ontario Sundhedsministeriet og Long Term Care. SLO er støttet af CIHR Banting og Best Doctoral Research Award. MI holder Canada Research Chair i Cancer Strukturel Biologi. MST er M. Qasim Choksi Stol i lungekræft Translational Research. Den UHN NMR anlægget er støttet af Canada Foundation for Innovation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i Nordamerika, kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest udbredte form for kræft hos både mænd og kvinder. I 2013 anslås det, at over 100.000 nye tilfælde vil blive diagnosticeret i USA, hvilket resulterer i mere end 50.000 dødsfald [1]. Selvom antallet af dødsfald som følge af kolorektal cancer er faldet med 3% i løbet af de seneste ti år [1], metastatisk sygdom, mest fremtrædende til leveren, vil udvikle sig i 30% til 40% af CRC patienterne, og 50% vil dø af CRC gentagelse [2]. Kirurgisk resektion er standarden for behandling af tidligt CRC, men begrænsede effektive behandlinger er tilgængelige for avancerede patienter [3]. Udviklingen af ​​CRC involverer en flertrinsproces med ophobning af både genetiske og epigenetiske ændringer, herunder ændringer af KRAS pathway [4].

KRAS

aktiverende mutationer forekommer i ca. 40-50% af CRC, med de mest almindelige mutationer blev fundet i kodon 12 (-80%) og kodon 13 (-20%).

Currently , de nyeste godkendte behandlinger for CRC er med målrettede epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere, såsom cetuximab og panitumumab, i kombination med kemoterapi. Men kun patienter med vildtype

KRAS

stammer signifikant klinisk gavn af denne behandling, som dem med

KRAS

mutationer viser ikke en signifikant overlevelse [5]. Derfor er igangværende undersøgelser rettet mod at finde hidtil ukendte nedstrømseffektorer af mutant

KRAS

som kan anvendes i kombination til at inhibere signalering fra denne vej.

Aktiviteten af ​​vildtype-RAS nøje kontrolleret af familier af GTP-ase aktiverende proteiner (GAPS), som inaktiverer RAS ved at lette hydrolyse af bundet GTP og GTP exchange faktorer (GEFs), som letter frigivelsen af ​​BNP så RAS igen kan binde GTP [6]. Af den store familie af RasGAPs, der nu er kendt, en af ​​de tidligste identificeret og mest omfattende undersøgt er p120RasGAP, eller blot RasGAP, produktet af

RASA1

gen [7], [8]. Forstyrrelse af den

RASA1

gen i mus resulterer i embryonal letalitet på E10.5, på grund af afvigende kardiovaskulære system udvikling [9]. Transgene mus embryoner oprettet fra RNAi-medieret

RASA1

knockdown i ES-celler viste, at sværhedsgraden af ​​vaskulære defekter korreleret med niveauet af resterende RasGAP udtryk og mosaik embryoner udvikler lokaliserede defekter [10]. I overensstemmelse med disse mus studier, mutationer i

RASA1

gen har været forbundet med familiær kapillar venøse misdannelser syndromer som kan præsentere med en bred vifte af fænotyper, mest almindeligt, at kendt som en “portvin pletten” [11] [12], [13], [14], [15]. Nylige proteomisk analyse af disse hudlæsioner viste konsekvent nedsat ekspression af RasGAP sammenlignet med omkringliggende normalt væv [16]. Dette tyder sammen, at

RASA1

spiller en afgørende rolle i angiogenese og vaskulær udvikling. Men selv om protein modulation af RasGAP er fundet i flere neoplasmer, herunder kronisk myeloid leukæmi [17], astrocytoma [18], trofoblastiske tumorer [19], prostatacancer [20], levercancer [21], og basalcellecarcinom [22 ] har nødvendigvis ikke fundet proteinniveauer at være korreleret med RAS-aktivitet eller cancer sværhedsgrad [22], [23]. Derfor forbliver den rolle RasGAP i kræft skal afklares.

SH2-SH3-SH2 domæne konfiguration i N-terminale region af RasGAP har længe foreslået forskere, at RasGAP kunne spille en rolle som en signalering adapter protein, ved at bidrage til, såvel som uafhængig af dens GAP aktivitet [7], [24]. Vigtigere, blev disse domæner fundet at binde til tyrosinphosphoryleret p190RhoGAP (her benævnt RhoGAP) som reaktion på opstrømskinase aktivitet og celleadhæsion [25], [26], [27]. Dette fund forudsat den første mekanistisk bevis for en sammenhæng mellem RAS aktivering og Rho pathway signalering. Vores gruppe har for nylig fundet, at RhoGAP bliver tyrosinphosphoryleret nedstrøms af c-MET signalering i DLD1 mutant

KRAS

CRC-cellelinje [28]. Vi søgte derfor at fastlægge den rolle, aktive KRAS i RhoGAP-RasGAP interaktion, og effekten af ​​denne interaktion i CRC tumorceller.

Eksperimentelle procedurer

Cell kultur

DLD1 (ATCC, Manassas, VA) er en kolorektal cancer cellelinje, der er heterozygot for G13D

KRAS

mutation. DKO4 celler blev afledt fra DLD1 ved afbrydelse af mutant

KRAS

allel ved somatisk rekombination [29]. Begge cellelinier blev rutinemæssigt dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles-medie (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).

Modulation af genekspression

RASA1 overudtrykker lentiviral vektor blev konstrueret ved anvendelse af Gateway rekombinationssystem (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA). Indrejse vektor, der indeholder enten CMV promotor eller RASA1 ORF (OpenBiosystems, ThermoScientific, Ottawa, ON) blev rekombineret med pLenti-CMV-GFP-DEST vektor (Addgene plasmid 19732) skabe pLentiCMV og pLentiRASA1. HEK293T celler blev transficeret med disse vektorer og pLenti lentiviral pakkevektorer som tidligere [30] beskrevne. Virale supernatanter blev opsamlet, filtreret og anvendt til at inficere målceller i nærvær af 4 ug /ml polybren (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). 72 timer efter transduktion blev cellerne sorteret for GFP-ekspression. For KRAS mutant overekspression, blev retrovira frembragt ved transfektion Phoenix ecotropiske pakkeceller med retrovirusvektoren pBabepuro indeholdende enten vildtype-KRAS-4B, mutanten

KRAS

konstruktioner eller tom vektor ved anvendelse FuGENE 6-transfektionsreagens (Promega, Madison, WI). Retrovirale supernatanter blev opsamlet som ovenfor, og celler blev selekteret med 0,5 ug /ml puromycin (ICN Biomedicals, Irvine, CA), indtil der ikke utransficerede kontrolceller blev efterladt i live.

Immunfældning og Western Blotting

celler blev lyseret i en 1% Triton-X 100-puffer (1% Triton X-100, 10% glycerol, 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM natriumpyrophosphat, 100 mM NaF, 10 mM Na

4P

2O

4, 1 mM EDTA, 1 mM natriumorthovanadat plus en komplet mini EDTA-fri proteaseinhibitor tablet (Roche, Laval, QC), fik lov til at hvile på is i 10 minutter og derefter klaret ved centrifugering ved 14.000 g ved 4 ° C i 30 minutter. proteinkoncentration standardisering blev udført under anvendelse Bradford protein assay-reagens (Bio-Rad, Hercules, CA). for immunopræcipitationer blev proteinkoncentration udlignet blandt prøver, og lysater blev kombineret med 2-5 pi af antistof og fik lov at vugge natten over ved 4 ° C. 30 pi Protein G PLUS-agaroseperler (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), blev kombineret med lysaterne og rystet i 1 time ved 4 ° C. Immunopræcipiterede proteiner blev derefter vasket 3x med lyseringspuffer, elueret med 20 pi 2xSDS prøvebuffer og kogt i 5 minutter. Helcelle lyates blev normaliseret for proteinkoncentration, kombineret med 6xSDS prøvebuffer og kogt i 5 minutter, så godt. Lysater blev derefter sat på en 4-20% gradient SDS-polyacrylamidgel (Bio-Rad) og kørt ved 120 V. Gelerne blev overført til PVDF-membraner før bliver blokeret med enten 5% tør skummetmælk i TBST eller 5% BSA i TBST i 1 time ved stuetemperatur og derefter probet natten over med passende antistof. Westerns blev probet med passende sekundært antistof, omsat med ECL prime (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og eksponeret for XRAY film til den passende mængde tid. Antistoffer blev brugt som anvist:. RasGAP klon B4F8 og anti-phosphotyrosin klon 4G10 (EMD Millipore, Billerica, MA), p190A-RhoGAP (Cell Signaling, Danvers, MA), GAPDH og KRAS 4B klon F234 (Santa Cruz Biotechnology)

Kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA (1-2 ug) blev isoleret fra cellelinier og væv ved hjælp af et Qiagen RNeasy kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) og blev revers-transkriberet under anvendelse med SuperScript III revers transkriptase (Invitrogen, Life Technologies, Burlington, ON). En 10 ng ækvivalent af cDNA blev anvendt til hver kvantitativ PCR (qPCR) assay udført med Stratagene Mx3000p Sequence Detection System ved hjælp SYBR green 2 × Master mix. Primere anvendes, er:

GAPDH F – CCCCCACCACACTG,

GAPDH R – GCCCCTCCCCTCTTCAAG

RPS13 F – GTTCTGTTCGAAAGCATTG

RPS13 R – AATATCGAGCCAAACGGTGAA

RASA1 F – GGACGAAGGTGACTCTCTGGAT

RASA1 R – GGAGGAGCGGTCAACGGTAT

KRASF – CAGGCTCAGGACTTAGCAAGAAG

KRASR-TGTTTTCGAATTTCTCGAACTAATGTA

Forventet PCR produkt sekvenser blev verificeret ved hjælp af BLAST for anerkendelse af mål- og ikke-målsekvenser. Resultaterne blev analyseret ved hjælp af delta-delta Ct-metoden, normalisering imod gennemsnittet af to husholdning gener.

cellebaserede assays

Cell optælling.

5 × 10

3-celler blev udpladet i fuld serum medier i tre eksemplarer i 5 dage tælling i en plade med 24. Begyndende ved 72 timer efter udpladning, er 3 brønde af hver cellelinje trypsineret og derefter talt ved anvendelse af en Beckman Coulter Z2 celletæller (Beckman-Coulter, Brea, CA).

celleadhæsionsassay.

1 × 10

5-celler podedes på en 24-brønds skål overtrukket med 0,01% PureCol collagen (Sigma-Aldrich) i 15 minutter. Brøndene blev farvet med 0,2% krystalviolet og lyseret med 0,1% Triton X-100. Lysatet blev aflæst ved 590 nm på en Tecan XFlour4 pladelæser (Mannedorf, Schweiz).

Cell motilitet assay.

7 × 10

4 celler blev udpladet i 70 pi fuld serum medie i hver side af en μ-fad celledyrkningsinsert (Ibidi, Planegg, Tyskland) i en 24-brønds celledyrkningsplade og lodes vokse i 72 timer, eller indtil et konfluent monolag blev nået. Insertet blev fjernet, og mediet blev ændret til serumfrit DMEM. Fase kontrast billeder blev erhvervet på Zeiss Axio Observer blev brugt til at tage et fotografi på 32 × forstørrelse på dette tidspunkt (tid 0) og hver 24 timer derefter. Billedanalyse blev udført som tidligere [31] beskrevne. Image-Pro Plus software (MediaCybernetics, Rockville, MD) blev anvendt til at analysere de sårhelende assays. Brug kant og segmentering filtre, områder med store pixel intensitet variationer (celler) vises lys, mens glatte områder af billedet (sår) er mørke. Den filtrerede billede blev derefter omdannet til et binært billede ved at anvende en pixel tærskel og sårområdet blev bestemt ved tælling summen af ​​pixels tildelt. Den pixel beløb blev derefter udtrykt som procent sårlukning, hvor nul pixels i såret repræsenterer 100% lukning.

Immunofluorescens

Glas kammer slides (BD Biosciences, San Jose, CA) blev coatet natten over ved 4 ° C med 0,01% collagen i PBS. Trypsanised celler blev resuspenderet i DMEM + 5% BSA, udpladet på objektglas og fik lov at adhærere natten over. Objektglas blev derefter vasket en gang med PBS og fikseret med paraformaldehyd i 20 minutter ved stuetemperatur. Celler blev permeabiliseret med 0,01% Tween-20 i PBS i 20 minutter, blokerede med 3% BSA i PBS og farvet med 1:300 rhodamin phalloidin i 1 time ved stuetemperatur. Dækglas blev påført med Vectashield indeholdende DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i nuklear farvning. Billeder præsenteres her blev taget på 43 × forstørrelse med en fordybelse olie linse på en Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop.

CRC prøvetagning

Patient vævsprøver blev opnået fra UHN snap-frosne vævsbank efter godkendelse af UHN Research Ethics Board. Alle væv blev indsamlet inden for 30 min af resektion og snap-frosset i flydende kvælstof samt blive formalin fikseret og paraffin indstøbt (FFPE), og deres kvalitet er blevet bekræftet af histologi. Væv omfattede 63 primære kolorektal kræft og 30 metastatiske kolorektal kræft. Metastatiske tumorer var fra leveren (22 tilfælde) og lunge (8 tilfælde) metastasectomy prøver.

RASA1 mutation analyse

cDNA blev isoleret fra patientens væv cellelinjer, som beskrevet ovenfor fra total RNA.

RASA1

cDNA blev først amplificeret med 6 sæt primere til at dække længden af ​​genet, og sekventering blev udført på det amplificerede DNA med de samme tilsvarende primere, der er som følger:

F1 – CTCAGCCTGGGGAGCTGAAGG

R1 – TGGAGGAGCGGTCAACGGTATG (bp 2-649)

F2 – GGCCTCGGGACAGTGGACGA

R2 – GGGCCTCACAAGAAAACTGCAGAC (bp 563-1252)

F3-AGGTGGGCCGGGAAGAAGATCC

R3-TCCAATCCTCTGCTTGTTCTGGAGT (bp 1131-1823)

F4-TGGCAGGCCAAACTGTTTTCAGA

R4-TGCTGGCCAGTAGTGTTCGGT (bp 1723-2381)

F5-CCGAACACTACTGGCCAGCATCC

R5 – TGACACCTTCCATGTAGGGCTCC (bp 2362-2987)

F6-CGACTCATCTGTCCTGCCATCCT

R6 – CTGGGGCGAAGGCTGCTACC (bp 2825-3277)

For PCR-amplifikation, 0,3 ul hver af fremadrettede og reverse primere (50 uM) blev tilsat til 6 pi cDNA (20 ng /ul), 12,5 pi 2x Taq vælg DNA-polymerase, 0,2 ul 25 mM dNTP og ultrarent vand (Sigma-Aldrich) til et totalt volumen 25 ul for hver reaktion. Cykliseringsbetingelserne var: 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 39 cyklusser med denaturering ved 95 ° C i 45 “, annealing ved 64 ° C i 45” og forlængelse ved 72 ° C i 1 min, en 10 minutters inkubering ved 72 ° C efterfulgt af en 4 ° C. 5 ul af PCR-produktet blev kontrolleret på en 2% agarosegel. PCR-produktet blev renset op med ExoSAP-IT (Affymatrix, Santa Clara, Californien).

For at validere sekventering i genomisk DNA blev de samme metoder som ovenfor, ved hjælp af følgende primere til at forstærke og sekvens exon 16 :

F – CGCTGCCAGTTGAGCCGATTACA

R – CTCTGGCATCATTGTGCTACTAAGC

Real-Time NMR GAP aktivitet assay

mærket GTPase domæne af RAS 1-171 blev udtrykt fra pET15b vektorer i

E. coli

i M9-medium suppleret med

15N ammoniumchlorid og oprenset ved Ni-NTA affinitetskromatografi. His mærker blev fjernet ved thrombinspaltning og monomere GTPaser blev yderligere oprenset ved gelfiltreringskromatografi (Superdex 75) [32], [33]. Prøver blev opkoncentreret, og om nødvendigt udvekslede i NMR buffer (fx 25 mM HEPES pH 7,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl

2, 1 mM DTT og 10% D

2O).

for at analysere iboende GTP hydrolyse, blev en GTP-loaded prøve fremstillet ved inkubering af RAS-protein (~ 10 min ved 37 ° C eller mere ved stuetemperatur) i nærvær af 10-fold molært overskud GTP og 10 mM EDTA [34 ]. Efter udveksling, MgCl

2 tilsættes til en slutkoncentration på 20 mM for at stabilisere den nyligt bundne nucleotid, og prøven ledes gennem en gel filtrering eller afsaltning søjle (PD MidiTrap ™ G-25 (GE Healthcare) ækvilibreret med NMR puffer for at fjerne overskydende nukleotid og den eluerede prøve blev derefter hurtigt koncentreret og hurtigt nedfrosset.

Celler blev høstet ved skrabning i et minimalt volumen (150 pi for en 10 cm plade) lyseringsbuffer som beskrevet for Western blotting, derefter væk for kort centrifugering (16.000 g i 30 s) og det totale cellulære protein i supernatanten blev analyseret ved anvendelse af Bradford-assay-reagens (BioRad) at standardisere den mængde protein, der anvendes i hvert assay. En koncentration på 10-20 pg /pl totalt protein i lysatet blev opnået og 35 ug i 3,5 pi blev sat til den rensede GTP-bundne RAS fragment.

Dataindsamlingen blev efterfølgende iværksat så hurtigt som muligt. Halvdelen liv reaktioner blev oprindeligt anslåede ved visuel inspektion af spektre, da den del af BNP-bundne GTPase stede ved hvert tidspunkt blev vurderet fra flere par toppe og dataene blev tilpasset til en enfaset eksponentielt henfald funktion at opnå de veksel- /hydrolysehastigheder [35].

RAS aktivitetsassay

Celler blev serum sultet i 24 timer og derefter analyseret for aktive RAS hjælp af RAS aktivering kit (Millipore) som anvist. Kort fortalt blev cellerne lyseret i 1 x MLB lysepuffer og lige proteinmængder blev blandet med RAS-bindende domæne af RAF1 fusioneret til glutathion

S

transferase og koblet til glutathion-sepharose-perler. Efter vipning ved 4 ° C i 1 time blev kuglerne vasket i den samme lyseringspuffer og resuspenderet i 2 x SDS-prøvebuffer. Western Blotting forløb som beskrevet ovenfor.

Subkutan tumorgenicitet assay

Etik erklæring.

Alle manipulationer blev gjort for at minimere dyrenes lidelser, i overensstemmelse med protokoller godkendt af Ontario Cancer Institute (OCI) Animal Care udvalg under anvendelsen af ​​dyr protokol nummer AUP 736,9.

Svær kombinere immundefekt (SCID) mus blev avlet på stedet, og fås fra Ontario Cancer Institute (OCI, Toronto, ON). En million celler blev injiceret subkutant i højre skulder region af 4- til 6 uger gamle mandlige SCID-mus (n = 5-8 pr cellelinie). Når tumorer var palpable de blev målt hver 3 dage, indtil human slutpunkt var nået, som var enten når tumorerne nåede 1,5 cm, eller når de blev sår til punktet af animalsk nød. Tumorvolumen blev målt under anvendelse af formlen (længde x bredde

2) x π /6. Mus blev aflivet ved hjælp af CO

2, som er godkendt af OCI Animal Care udvalg, tumorer blev fjernet, og dele var enten lynfrosset i flydende nitrogen for DNA og protein isolation eller fikseret i formalin til paraffin indlejring og immunhistokemisk farvning. Til statistisk analyse blev en lineær blandede effekter (LME) model, der anvendes til at inkorporere den høje korrelation forekommende blandt målinger på den samme mus. Alle volumen målinger tumor var kvadratroden forvandlet til at stabilisere variansen, og Wald p-værdi blev anvendt til at angive betydning.

Resultater

Tab af RasGAP fører til tab af RhoGAP fosforylering

for yderligere at studere rolle RhoGAP fosforylering i DLD1 celler, vi undersøgte dens interaktion med RasGAP, en af ​​sine vigtigste bindende partnere. Samtidig ønskede vi at vide, om tabet af mutant

KRAS

i DKO4 isogene afledte cellelinje ville have en effekt på dette samspil. Vi fandt, at RhoGAP kun kunne phosphoryleres i DLD1 celler, ikke i DKO4, mens de samlede niveauer af RhoGAP forbliver uændrede. Denne phosphorylerede RhoGAP co-immunpræcipiteret med RasGAP (figur 1A). Desuden fandt vi, at ekspression af RasGAP ikke kunne detekteres i DKO4 cellelinje (figur 1A). Det er blevet rapporteret, at RasGAP phosphorylering sker ofte nedstrøms for receptortyrosinkinase signalering [18], [36], [37], [38], [39]. Vi fandt imidlertid, at den store tyrosinphosphoryleret band, der vises efter immunpræcipitering af RasGAP var faktisk på ~190 kDa, sandsynligvis repræsenterer RhoGAP (figur 1A), hvilket indikerer, at RasGAP selv er ikke meget phosphoryleret i disse celler.

A) RhoGAP og RasGAP blev immunpræcipiteret fra DLD1 og DKO4 celler. Immunpræcipitater blev underkastet Western blotting og probet for total phosphotyrosin, RasGAP og RhoGAP. Western blotting af helcellelysater (A) og rt-QPCR (C) blev anvendt til at bestemme total protein og mRNA-niveauer i henholdsvis disse cellelinier.

RasGAP ekspression går tabt i DKO4 celler

Vi fandt, at mens DKO4 cellelinien udtrykte lidt til ingen RasGAP protein sammenlignet med DLD1, mRNA niveauer i

RASA1

gen forblev på 50% af det oprindelige cellelinje (figur 1, B C). Vi udførte SNP arrays for at undersøge potentielle kopital ændringer mellem disse isogene cellepar. Vi fandt meget lille forskel mellem de to cellelinier (data ikke vist). Et lignende resultat blev for nylig fundet i en række alternative kloner (DKO3 og DKO1) afledt fra DLD1 model [40]. Vigtigt er det, blev der ikke kopital forskelle set i kromosom 5q13.3, der viser, at faldet i mRNA niveau i DKO4 skyldes ikke kromosomal tab.

RasGAP mutation i CRC

Vi derefter kiggede for mutationer, der kunne forklare forskellene i RasGAP udtryk niveau. Vi sekventeret både det genomiske DNA og cDNA fra DLD1 og DKO4 celler. Vi fandt en heterozygot punktmutation i det genomiske DNA af begge cellelinier. Dette C T overgang er en nonsense mutation, der koder for en R709 * ændring (figur 2, A B), ligger mellem C2 og RasGAP domæner RasGAP. Hvis det muterede gen blev oversat til et trunkeret protein, bør en ~77 kDa bånd have været påviselig i Western blots ved anvendelse af et RasGAP antistof, som genkender den N-terminale del af proteinet. Men ser vi ikke et band af denne størrelse i enhver celle betingelser.

A) kromatogram, som viser relative intensiteter af hvert basepar efter Sanger sekventering i både den genomiske og cDNA afledt af cellelinjer. B) Illustration af placeringen af ​​mutationen på proteinniveauet RasGAP. C) RASA1 udtryk data fra alle cellelinjer i de overordnede Institute Cancer Cell Linje Encyclopedia. Bjælker repræsenterer middelværdien.

Interessant cDNA-sekventering i DLD1 og DKO4 cellelinier viste, at DLD1 cellelinien havde næsten fuldstændig tabt ekspression af det muterede gen, der udtrykker kun vildtype, mens DKO4 cellelinie opretholdt 50% af hver af vildtype og mutant

RASA1

genprodukt (figur 2A).

Vi kiggede for tilstedeværelsen af ​​C2330T mutation i primær tumor og metastaser væv fra CRC patienter, men var ude af stand til at identificere denne mutation i nogen af ​​vores prøver. Men kunne vi finde denne mutation i tre cellelinier fra de overordnede Institute Cancer cellelinje Encyclopedia (https://www.broadinstitute.org/ccle) [41]: de kolorektal cancer cellelinjer HRT18 og HCT15 samt urinvejene cancer tarmkanalen cellelinje 639 V. Dette indebærer, at selv om mutationen er sjælden, det er til stede i visse typer af cancer. Denne mutation er heller ikke findes i den menneskelige SNP-databasen, hvilket indebærer, at det ikke findes i den brede befolkning.

For yderligere at undersøge vores hypotese, at det muterede

RASA1

udskrift er ustabil og muligvis nedbrudt, sammenlignede vi mRNA ekspressionsniveauer af

RASA1

i de tre cellelinjer, der indeholder C2330T mutation til resten af ​​cancercellelinier i cellelinjen Encyclopedia. Disse tre cellelinier udtrykker signifikant mindre

RASA1

end flertallet af andre cancercellelinier i databasen (figur 2C). Selvom det ikke er afgørende, synes dette at angive, at dette beskærer mutation kan resultere i nedsat mRNA genekspression.

Disse fund tyder på flere niveauer af regulering af RasGAP, alle muligvis som følge af tabet af aktive KRAS i DKO4. Først, den fuldstændige mangel på mutant p120RasGAP mRNA i DLD1 cellelinien som påvist ved sekventering viser, at enten den mutante allel ikke bliver transkriberet til mRNA i denne cellelinie, eller at mutanten mRNA er meget ustabil og nedbrydes straks ved transkriberet. Interessant, selvom det mutante mRNA var til stede i DKO4 cellelinie, faldet i den samlede

RASA1

mRNA-niveauer som påvist ved real time qPCR tyder på, at denne mutant mRNA også nedbrydes, men muligvis ikke så hurtigt 50% eller så effektivt som i DLD1

alt i alt virker det, at tabet af aktive KRAS i DKO4 formindsker presset på cellen til at stabilisere RasGAP udtryk på både mRNA og protein niveau.; Men den mekanisme, hvormed protein niveauer RasGAP reguleres i disse cellelinjer i stadig ukendt.

Regulering af RasGAP mRNA-ekspression af mutant KRAS

For at tydeliggøre den rolle, som tab af mutant

KRAS

i DKO4 spiller i ekspressionen af ​​RasGAP, vi stabilt overudtrykt den pBabepuro (PBP) tom vektor, vektor, der indeholder fuld længde vildtype

KRAS

eller vektor, der indeholder

KRAS

med punktmutationer i codon 12 (G12V eller G12D) eller codon 13 (G13D), i DKO4 celler. Vores hypotese, at G13D mutationen ville have den største virkning ved stabilisering og redning RasGAP ekspression i DKO4, på grund af denne mutation er den, der oprindeligt forekom i denne cellelinie. Men efter gentagne forsøg, vi var kun i stand til at overudtrykke

KRAS

G12V mutant gen i denne cellelinje (figur 3A). Overekspression af G12V blev ledsaget af en samlet stigning i GTP-KRAS, som forventet (figur 3C). Interessant transient transfektion af disse konstruktioner viste, at KRAS kunne være overudtrykt op til 7 dage efter transfektion med alle mutanterne, hvilket indikerer, at langvarig ekspression af KRAS-konstruktioner bortset G12V blev ikke opretholdt i DKO4. Overekspression af

KRAS

G12V forårsagede en signifikant stigning i

RASA1

mRNA; dog blev denne stigning ikke ses på proteinniveau (figur 3, B 0,001, * p 0,05

For yderligere at undersøge rollen af ​​aktive KRAS i RasGAP udtryk vi forbigående transficerede DLD1 celler med 11. separate shRNAs mod

KRAS

. Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem mængden af ​​

KRAS

knockdown og faldet i

RASA1

mRNA-ekspression i forhold til den ikke-specifikke shRNA kontrol (figur 3D). Imidlertid blev disse ændringer ikke observeret på proteinniveau (figur 3E). For at sikre, at KRAS shRNA knockdown gjorde medføre væsentlige ændringer i ikke-specifikke gener, figur S1A viser niveauer på to husholdning gener, der ikke er berørt af knockdown. Figur S1B viser Western blots hvorfra Figur 3E stammer.

Sammen disse resultater tyder, at tab af aktive KRAS spillede en delvis rolle for stabiliteten og /eller udtryk for

RASA1

mRNA, selvom yderligere mekanismer er til stede, der regulerer proteinekspression i denne cellelinie.

RasGAP overekspression redninger RasGAP aktivitet

for at bestemme om nogen af ​​de fænotyper tilskrives tab af aktive KRAS i DLD1 isogene celle linjer kunne forklares ved tabet af RasGAP proteinekspression, vi overudtrykt RasGAP i DKO4 cellelinje (figur 4A). Trods vores evne til at få . 100 fold mRNA overekspression af RasGAP i DKO4 cellelinie, det resulterende protein niveauer var magen til endogen ekspression i DLD1 celler (figur 4D)

A) mRNA ekspression af RasGAP efter overekspression i DKO4 celler sammenlignet med GFP vektor kontrol. B) Real-time NMR-analyse af RasGAP aktivitet, viser betyde hastigheden af ​​GTP hydrolyse (B) og GAP-aktivitet over tid (C). Hver kurve i (C) er afledt fra en enkelt repræsentativt forsøg. Fejlsøjler i (B) betegne standardfejl på middelværdien (SEM). D) RAS-aktivitet assay viser niveauer af aktiv KRAS efter RasGAP overekspression. Numre angiver densitometrimålinger værdier fra denne blot, som er repræsentativt for tre biologiske replikater. E) RhoGAP blev immunpræcipiteret fra cellelinier, udsat for Western blotting, derefter undersøgt for total phosphotyrosin, RasGAP og RhoGAP.

For at afgøre, om overekspression af RasGAP havde nogen effekt på KRAS aktivitet, en RAS aktivitet assay blev udført under anvendelse af Raf-RBD-bundne agaroseperler til at immunpræcipitere aktiv KRAS (figur 4D). Som det er blevet vist tidligere [40], KRAS samlede var mindre aktiv i de DKO4 celler sammenlignet med de DLD1 celler. Vi så en lille, men signifikant fald i KRAS aktivitet i DKO4 celler efter

RasGAP

overekspression, hvilket indikerer, at RasGAP er i stand til at regulere vildtype-KRAS i DKO4. For yderligere at præcisere, hvilken rolle RasGAP i disse celler, brugte vi en real-time NMR-baserede assay til at bestemme RasGAP aktivitet. Vi fandt, at niveauerne af RasGAP aktivitet var overensstemmende med RasGAP proteinekspression (fig 4, B & C). Ekstrakter af DLD1 celler accelererede RAS GTP hydrolyse ~1.8 fold, mens DKO4 ekstrakter, matchede for totale proteinindhold fremkaldte en beskeden 1,2 fold stigning hydrolyse sats. Disse resultater var i overensstemmelse med tilstedeværelsen af ​​basale aktivitet fra andre RasGAPs. RasGAP overekspression i DKO4 rejst denne sats tilbage til ~1.8 fold.