PLoS ONE: Evaluering af effekt & amp; Biokemisk Mekanisme af celledød Induktion af Piper longum Uddrag Selektivt i In-vitro og in-vivo modeller af menneskelig Cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

I øjeblikket kemoterapi er begrænset meste til genotoksiske lægemidler, er forbundet med alvorlige bivirkninger som følge af ikke-selektiv målretning af normalt væv. Naturlige produkter spiller en væsentlig rolle i udviklingen af ​​de fleste kemoterapeutika, med 74,8% af alle tilgængelige kemoterapi er afledt af naturlige produkter.

Målsætning

For at videnskabeligt vurdere og validere anticancer potentiale en ethanolekstrakt af frugten af ​​den lange peber (PLX), en plante af

Piperaceae

familie, der har været brugt i traditionel medicin, især Ayurveda og undersøge anticancer virkningsmekanismen for PLX mod kræftceller.

Materialer Fremgangsmåder

Efter behandling med ethanolisk lang peber ekstrakt blev cellelevedygtighed vurderet under anvendelse af et vandopløseligt tetrazoliumsalt; apoptose induktion blev observeret efter nukleare farvning med Hoechst, binding af annexin V til externalized phosphatidylserin og fasekontrastmikroskopi. Billedbaseret cytometri blev anvendt til at påvise virkningen af ​​lange peber ekstrakt på produktionen af ​​reaktive oxygenspecies og spredning af det mitokondrielle membranpotentiale efter tetramethylrhodamin eller 5,5,6,6′-tetrachlor-1,1 ‘, 3, 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine chlorid-farvning (JC-1). Vurdering af PLX

in vivo

blev udført under anvendelse Balb /C-mus (toksicitet) og CD-1 nu /nu immunkompromitterede mus (virkning). HPLC-analyse aktiveret påvisning af nogle primære forbindelser til stede i vores lange peber ekstrakt.

Resultater

Vores resultater viste, at en ethanol lang peber ekstrakt selektivt inducerer caspase-uafhængig apoptose i cancerceller, uden at det påvirker ikke -cancerous celler, ved at målrette mitokondrierne, hvilket fører til spredning af det mitokondrielle membranpotentiale og forøgelse af ROS-produktion. Frigivelse af AIF og endonukleasen G fra isolerede mitokondrier bekræfter mitokondrierne som et potentielt mål for lang peber. Effekten af ​​PLX i

i-vivo

undersøgelser viser, at oral administration er i stand til at standse væksten af ​​tyktarmskræft tumorer i immunsvækkede mus, uden tilhørende toksicitet. Disse resultater viser den potentielt sikkert og ugiftigt alternativ, som er lang peber ekstrakt til kræftbehandling

Henvisning:. Ovadje P, Ma D, Tremblay P, Roma A, Steckle M, Guerrero J-A, et al. (2014) Evaluering af effekt Biokemisk Mekanisme af celledød Induktion af

Piper longum

Uddrag selektivt i

In-Vitro

In-vivo

modeller af humane cancerceller. PLoS ONE 9 (11): e113250. doi: 10,1371 /journal.pone.0113250

Redaktør: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, USA

Modtaget: Maj 29, 2014; Accepteret: 21 oktober, 2014; Udgivet: November 17, 2014

Copyright: © 2014 Ovadje et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle data præsenteres i form af tal og tabeller, som kan findes i manuskriptet

Finansiering:. Denne undersøgelse blev finansieret af Windsor Essex County Cancer Centre Foundation ved Seeds4Hope Grant (URL: https://windsorcancerfoundation.org/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Det medforfatter Siyaram Pandey er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Det betyder dog ikke ændre forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Den fortsatte stigning i forekomsten af ​​kræft betyder et behov for yderligere forskning i mere effektiv og mindre giftige alternativer til nuværende behandlinger. I Canada alene, blev det anslået, at 267,700 nye tilfælde af kræft vil opstå, med 76,020 dødsfald forekommer i 2012 alene. De globale statistikker er endnu mere dystre, med 12,7 millioner kræfttilfælde og 7,6 millioner kræftdødsfald opstår i 2008 [1], [2]. De kendetegnende for kræftceller afdække vanskeligheden ved at målrette cancerceller selektivt. Kræftceller er berygtet for at opretholde proliferativ signalering, unddrage vækst undertrykkelse, aktivering invasion og metastase og modstå celledød blandt andre [3] egenskaber. Disse egenskaber udgør forskellige udfordringer i udviklingen af ​​succesfulde anticancer behandlingsformer. Evnen af ​​kræftceller at unddrage sig celledød begivenheder har været centrum for opmærksomhed for megen forskning, med fokus centreret om at målrette de forskellige sårbare aspekter af kræftceller til at fremkalde forskellige former for programmeret celledød (PCD) i kræftceller, uden tilhørende toksiciteter til ikke-kræftceller.

Apoptose (PCD type i) er blevet undersøgt i årtier, forståelsen af ​​som vil øge den mulige udvikling af mere effektive behandlinger mod kræft. Dette er en form for celledød, der er påkrævet for ordinær celle udvikling og homeostase, samt en forsvarsmekanisme for at slippe af beskadigede celler; celler, som undergår apoptose investere energi i deres egen død for ikke at blive et irritationsmoment [2]. Kræftceller unddrage apoptose for at give ekstra vækst fordel og næring, derfor aktuelle anticancer terapier bestræbe sig på at udnytte de forskellige sårbarheder i kræftceller for at udløse aktivering af apoptose gennem enten ydre eller indre veje [4], [5]. Udfordringerne nogle af de tilgængelige cancerterapier er deres evner til at inducere apoptose i cancerceller ved at inducere genomisk DNA-beskadigelse. Selv om dette er indledningsvis effektiv, da de er rettet mod hurtigt delende celler [6], er de som regel ledsaget af alvorlige bivirkninger forårsaget af den ikke-selektive målretning af normale ikke-cancerceller, hvilket antyder et behov for andre ikke-fælles mål for apoptose induktion uden de tilknyttede toksiciteter.

Naturlige sundhedsprodukter (menneskelige primater) har vist meget lovende inden for kræftforskning. De sidste 70 år har indført forskellige naturlige produkter som kilden til mange lægemidler i cancerbehandling. Ca. 75% af de godkendte antineoplastiske lægemidler er afledt fra naturlige produkter, en forventet statistik betragtning af, at mere end 80% af udviklingslandene verdens befolkning er afhængig af de naturlige produkter til terapi [7]. Planteprodukter især indeholder mange bioaktive kemikalier, som er i stand til at spille specifikke roller i behandlingen af ​​forskellige sygdomme. I betragtning af de komplekse blandinger og farmakologiske egenskaber af mange naturlige produkter, bliver det vanskeligt at etablere et specifikt mål og virkningsmekanisme mange menneskelige primater. Med menneskelige primater fart, især inden for kræftforskning, er der en masse nye undersøgelser på mekanistiske effekten og sikkerheden af ​​menneskelige primater som potentielle anticancer midler [8].

Lang peber, fra Piperaceae familien, har været anvendt i århundreder til behandling af forskellige sygdomme. Flere arter af lange peber er blevet identificeret, herunder

Piper longum

(ekstrakt af som bliver brugt i denne undersøgelse),

Piper betle

,

Piper retrofactum

ekstrakter er blevet anvendt i årevis i behandlingen af ​​forskellige sygdomme. En lang liste af anvendelser og fordele forbundet med ekstrakter af forskellige

Piper spp

, med rapporter angiver deres effektivitet som gode fordøjelsesforstyrrelser agenter og smerter og inflammatoriske suppressants [9]. Men der er lidt at ingen videnskabelig validering, kun anekdotiske beviser, for de fordele, der er forbundet med brugen af ​​lange peber ekstrakter. Der er videnskabelige undersøgelser er blevet udført på flere forbindelser til stede i ekstrakter af lange peber, herunder piperines, som har vist sig at hæmme mange enzymatiske narkotika bio-transformerende reaktioner og spiller specifikke roller i metabolisk aktivering af kræftfremkaldende stoffer og mitokondrie energiproduktion [10] – [13], og forskellige piperidin alkaloider, med fungicid virkning [9], [14]. Nogle af disse forbindelser har vist potent anticancer aktivitet [15], hvilket antyder, at lange peber ekstrakter kunne repræsentere en ny NHP, med bedre selektiv virkning mod cancerceller.

I denne undersøgelse undersøger vi effektiviteten af ​​en ethanolekstrakt for Long peber frugt (PLX) mod forskellige cancerceller, samt forsøg på at belyse virkningsmekanismen, efter behandling. Resultaterne fra denne undersøgelse viser, at PLX reducerede levedygtigheden af ​​forskellige cancer celletyper i en dosis og tid afhængig måde, hvor apoptose induktion blev observeret, efter mitokondrie målretning og frigivelse af pro-apoptotiske faktorer. På grund af de lave doser af PLX kræves for at inducere apoptose i cancerceller, var det let at finde det terapeutiske vindue af denne ekstrakt. Induktionen af ​​apoptose blev fundet at være caspase-uafhængig, selv om der var aktivering af både ydre og indre veje og produktionen af ​​ROS blev ikke afgørende for mekanismen af ​​celledød induktion ved PLX. Komplekset polychemical ekstrakt af frugten af ​​den lange peber plante, som en naturlig sundhed produkt med hidtil uset anticancer aktivitet, giver en måde at målrette flere sårbarheder i kræftceller. Selv i tilstedeværelsen af ​​visse inhibitorer, PLX var effektiv til at inducere apoptose tyder den potentielle anvendelse af udvikle PLX som en sikker og effektiv kræftbehandling.

Materialer og metoder

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse til protokollen Dyrepleje udvalg godkendt af University of Windsor Animal Care Udvalg; Denne protokol og projekt blev godkendt af dyret pleje udvalg – Protokol nummer:. AUPP 10-17), i overensstemmelse med den canadiske Råd Animal Care (CCAC) retningslinjer

Cell Culture

malignt melanom cellelinie G-361, humane kolorektal cancer cellelinjer HT-29 og HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA Cat No. CRL-1687, CCL-218 . CCL-247, henholdsvis) blev dyrket med McCoys medium 5a (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) suppleret med 10% (vol /vol) FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og 40 mg /ml gentamicin (Gibco, BRL, VWR). Den ovarie adenocarcinom cellelinie OVCAR-3 (American Type Culture Collection, katalog nr. HTB-161) blev dyrket i RPMI-1640 medie (Sigma-Aldrich Canada, Mississauga, ON, Canada) suppleret med 0,01 mg /ml bovint insulin, 20% (volumen /volumen) føtalt bovint serum (FBS) standard (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) og 10 mg /ml gentamicin. Pancreas adenocarcinom cellelinie BxPC-3 (American Type Culture Collection, katalog nr. CRL-1424) blev dyrket i RPMI-1640-medium, suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) standard og 40 mg /ml gentamicin. Normal-afledte colon mucosa NCM460 cellelinje (Incell Corporation, LLC., San Antonio, TX, USA) blev dyrket i Incell s M3Base medium (Incell Corporation, LLC., Katalog nr. M300A500) suppleret med 10% (v /v) FBS og 10 mg /ml gentamicin.

Alle celler blev dyrket under optimale vækstbetingelser 37 ° C og 5% CO2. Desuden blev alle celler overført til ≤ 6 måneder.

Lange Pepper Extraction

Ripe og tørrede indiske lang peber frugter blev opnået fra Quality Natural Foods begrænset, Toronto Ontario. Plantematerialet blev formalet op og ekstraheret i vandfri ethanol (100%) i et forhold på 1:10 (1 g plantemateriale til 10 ml ethanol). Ekstraktionen blev udført natten over på et rysteapparat ved stuetemperatur. Ekstrakten blev ledt gennem en P8 groft filter, efterfulgt af en 0,45 um filter. Opløsningsmidlet blev afdampet under anvendelse af en RotorVap ved 40 ° C og rekonstitueret i dimethylsulfoxid (Me

2SO) i en endelig koncentration af stamopløsning på 450 mg /ml.

Cell behandling

Celler blev udpladet og dyrket til 60-70% konfluens, før behandling med lange Pepper Ekstrakter (PLX), N-acetyl-L-cystein (NAC) (Sigma-Aldrich Canada, katalog nr. A7250), og bredspektret caspaseinhibitor, Z-VAD-FMK (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA) ved de angivne doser og varigheder. NAC blev opløst i sterilt vand. Z-VAD-FMK blev opløst i dimethylsulfoxid (Me

2SO). PLX blev ekstraheret som tidligere beskrevet, rekonstitueres i Me

2SO. Før behandling blev en fortyndet arbejder koncentration på 10 mg /ml i PBS fremstillet. Cellerne blev behandlet med 10 mg /ml til opnået den endelige angivne koncentrationer i resultatafsnittet.

Vurdering af Virkning for Long Pepper Extract (PLX) i kræftceller

WST-1 Assay for cellelevedygtighed.

for at vurdere virkningen af ​​PLX på cancerceller, blev et vandopløseligt tetrazoliumsalt (WST-1) baseret kolorimetrisk analyse udføres i henhold til producentens protokol (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA ), at kvantificere cellelevedygtighed som en funktion af cellulær metabolisme. Samme antal celler podedes på 96-brønds klare bund vævskulturplader derefter behandlet med de angivne behandlinger på de angivne koncentrationer og varigheder. Efter behandling blev cellerne inkuberet med WST-1-reagens i 4 timer ved 37 ° C med 5% CO2. WST-1 reagens spaltes til formazan af cellulære enzymer i aktivt metaboliserende celler. Formazan produkt blev kvantificeret ved at tage absorbansaflæsninger ved 450 nm på en Wallac Victor

3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canada). Cellular levedygtighed som et mål for metabolisk aktivitet blev udtrykt i procent af opløsningsmidlet kontrolgrupper.

Nuclear Farvning.

Efter behandling blev kerner af cellerne farvet med 10 pM Hoechst 33342 farvestof ( Molecular Probes, Eugene, OR, USA) eller 1 mg /ml propidiumiodid (PI) (Sigma-Aldrich, Mississauga, ON. Canada), at overvåge cellekernemorfologi for apoptose induktion ved udpegede tidspunkter og samlet celledød. Celler blev inkuberet med 10 pM Hoechst farvestof og 1 mg /ml PI i 10 minutter og mikrografer blev taget med et Leica DM IRB inverteret fluorescensmikroskop (Wetzlar, Tyskland) ved 400 ganges forstørrelse. Image-baserede cytometri blev anvendt til at kvantificere mængden af ​​celledød forekommer med PI farvning.

Annexin V Binding analysen.

For at bekræfte induktion af apoptose, bindingen af ​​Annexin V til eksternaliseres phosphatidylserin på den ydre cellulære overflade, blev vurderet. Efter behandling med PLX blev celler vasket to gange i phosphatbuffer saltvand (PBS). Efterfølgende blev celler resuspenderet og inkuberet i Annexin V binding buffer (10 mM HEPES, 10 mM NaOH, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 7,6) med Annexin V AlexaFluor-488 (1:50) (Invitrogen, Canada, Cat nr . A13201) i 15 minutter. I de sidste 10 minutter af inkubation, 10 pM Hoechst og 1 mg /ml propidiumiodid blev tilsat til mikrocentrifugerør og inkuberes i de sidste 10 minutter i mørke. Mikrografer blev taget ved 400 × forstørrelse på et Leica DM IRB omvendt mikroskop (Wetzlar, Tyskland) og image-baserede cytometri blev anvendt til at kvantificere procentdelen af ​​programmeret celledød (annexin V positive celler) forekommer efter behandling.

TUNEL Farvning at Detect DNA Skader og kvantificere Apoptose

.

Efter PLX behandling blev HT-29 celler mærket med Terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) assay. Assayet blev udført ifølge producentens protokol (Molecular Probes, Eugene, OR), for at detektere DNA-beskadigelse. Celler blev behandlet med PLX eller VP-16 (som en positiv kontrol) ved angivne koncentrationer og tidspunkter og analyseret for fragmentering af DNA. Efter behandling blev celler fikseret ved at suspendere disse i 70% (v /v) ethanol og opbevaret ved -20 ° C natten over. Prøven blev derefter inkuberet med en DNA-mærkning opløsning (10 pi reaktionsbuffer, 0,75 pi TdT enzym, 8 pi BrdUTP, 31,25 pi dH2O) i 1 time ved 25 ° C. Hver prøve blev udsat for et antistof-opløsning (5 pi Alexa Fluor 488 mærket anti-BrdU-antistof og 95 pi skylleopløsning). Cellerne blev inkuberet med antistoffet opløsningen i 20 minutter og TUNEL-positive celler blev kvantificeret ved billedbaseret cytometri.

Whole Cell ROS Generation.

Efter behandling med PLX, celler blev inkuberet med 2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin diacetat H

2DCFDA (katalog nr D6883, Sigma Aldrich, Mississauga ON. Canada) i 45 minutter. Celler blev opsamlet, vasket to gange i PBS og grøn fluorescens blev observeret ved anvendelse af en tali billedbaseret cytometer (Invitrogen, Canada). NAC blev anvendt til at vurdere afhængigheden af ​​PLX på ROS generation og levedygtighed.

Vurdering af mitokondriefunktionen Efter PLX Behandling

tetramethylrhodamin Methyl Ester (TMRM) Farvning.

For at overvåge mitokondrie membran potentiale (MMP), tetramethylrhodamin methyl ester (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) eller 5,5,6,6′-tetrachlor-1,1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine chlorid ( JC-1) (Invitrogen, Canada) blev anvendt. Celler blev dyrket på dækglas, behandlet med de angivne koncentrationer af behandlinger på de angivne tidspunkter, og inkuberet med 200 nM TMRM i 45 minutter ved 37 ° C. Mikrografer blev opnået ved 400 ganges forstørrelse på et Leica DM IRB inverteret fluorescensmikroskop (Wetzlar, Tyskland). For at bekræfte resultaterne opnået ved fluorescensmikroskopi blev billedbaseret cytometri anvendes til at detektere rød fluorescens. Celler blev podet i 6-brønds plader og efter behandling blev celler inkuberet med TMRM i 45 minutter, vasket to gange i PBS og anbragt i Tali glider. Rød fluorescens blev opnået ved anvendelse af en tali billedbaseret cytometer (Invitrogen, Canada).

mitokondrie Isolation i vurdering mitokondrie Targeting.

Celler blev opsamlet ved trypsin, vasket en gang i koldt PBS, resuspenderet i kold hypotonisk puffer (1 mM EDTA, 5 mM Tris-HCI, 210 mM mannitol, 70 mM saccharose, 10 uM Leu-pep og Pep-A, 100 pM PMSF), og manuelt homogeniseret. Den homogeniserede celle opløsning blev centrifugeret ved 3000 rpm i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C, og det mitokondrielle pellet blev resuspenderet i kold reaktionspuffer (2,5 mM malat, 10 mM succinat, 10 uM Leu-pep og Pep-A, 100 pM PMSF i PBS). De isolerede mitokondrier blev behandlet med PLX i de angivne koncentrationer og inkuberet i 2 timer i koldt reaktionspuffer. Kontrolgruppen blev behandlet med opløsningsmiddel (ethanol). Efter inkubation i 2 timer med ekstrakt blev mitokondrielle prøver hvirvlet og centrifugeret ved 12.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. De resulterende supernatant og mitokondrie pellets (resuspenderes i kold reaktion buffer) blev udsat for Western blot analyse for at vurdere om den mitokondrielle frigivelse /tilbageholdelse af pro-apoptotiske faktorer.

Western blot Analyser.

Protein prøver blev underkastet SDS-PAGE, overført til en nitrocellulosemembran, og blokeret med 5% vægt /volumen mælk TBST (Tris-saltvand Tween-20) opløsning i 1 time. Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med et anti-endonuclease G (EndoG) antistof (1:1000) rejst i kaniner (Abcam, kat. Nr ab9647, Cambridge, MA, USA), en anti-succinat-dehydrogenase underenhed A ( SDHA) antistof (1:1000) i mus (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-59.687, Paso Robles, CA, USA), eller et anti-apoptoseinducerende faktor (AIF) antistof rejst i kaniner (1:1000) (Abcam, katalog nr. ab1998, Cambridge, MA, USA). Efter primære antistof inkubation blev membranen vasket en gang i 15 minutter og to gange i 5 minutter i TBST. Membraner blev inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med et anti-muse eller et anti-kanin peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:2000) (Abcam, ab6728, ab6802, Cambridge, MA, USA) efterfulgt af tre 5-minutters vask i TBST. Kemiluminescens-reagens (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canada) blev anvendt til at visualisere proteinbånd og densitometrianalyse blev udført under anvendelse ImageJ software.

In-vivo

Vurdering af Long Pepper Extract

Toksicitet Assessment.

Seks uger gamle Balb /C-mus blev opnået fra Charles River Laboratories og huset i konstante laboratoriebetingelser i en 12-timers lys /mørke cyklus, i overensstemmelse med de animalske protokoller skitseret i University of Windsor Research Ethics plade- AUPP 10-17). Efter akklimatisering blev mus opdelt i tre grupper (3 dyr /kontrol (ubehandlet), 3 dyr /sondeernæring kontrol (vehikelbehandling) og 4 dyr /behandlingsgruppe) af. Kontrolgruppen ubehandlet gruppe fik almindeligt filtreret vand, mens den anden og tredje gruppe fik 50 mg /kg /dag bærer (Me

2SO) eller PLX, henholdsvis 75 dage. I løbet af undersøgelsen blev toksicitet målt ved vejning mus to gange om ugen og urin blev opsamlet for protein urinanalyse af urin oliepinden og Bradford assays. Efter studietid blev musene aflivet og deres organer (lever, nyrer og hjerter) blev opnået for immunhistokemisk og toksikologiske analyser af Dr. Brooke ved University of Guelph.

Effekten af ​​PLX i Tumor xenograftmodeller af immunsvækkede mus.

Seks uger gammel mand CD-1 nu /nu mus blev opnået fra Charles River Laboratories og huset i konstante laboratoriebetingelser i en 12-timers lys /mørke cyklus, i overensstemmelse med de animalske protokoller skitseret i University of Windsor Research Ethics plade- AUPP 10-17). Efter akklimatisering blev musene injiceret subkutant i højre og venstre hind flanker med en coloncancer cellesuspension (i phosphatbufret saltvand) ved en koncentration på 2 * 10

6 celler /mus (HT-29, p53

– /-, i den venstre flanke og HCT116, p53

+ /+, i højre flanke). Tumorer fik lov til at udvikle (ca. en uge), hvorefter dyrene blev randomiseret i behandlingsgrupper på 4 mus pr gruppe, en kontrolgruppe, en sonde kontrolgruppe gives almindeligt filtreret sterilt vand, samt gavage regimen af ​​køretøjet (5 uL Me

2SO i PBS) to gange om ugen. Den sidste gruppe blev givet filtreret vand suppleret med langt peber ekstrakt i en koncentration på 100 pg /ml, samt sondeernæring regime af lange peber ekstrakt (5 pi ekstrakt i PBS), to gange om ugen, svarende til 50 mg /kg /dag . Tumorerne blev vurderet hver anden dag ved måling af længde, bredde og højde, ved anvendelse af en standard caliper og tumorvolumenet blev beregnet ifølge formlen π /6 * længde * bredde. Musene blev også vurderet for eventuelle vægttab hver anden dag i varigheden af ​​undersøgelsen, som varede 75 dage, hvorefter dyrene blev aflivet, og deres organer og væv (lever, nyrer, hjerte og tumorer) blev opnået og opbevaret i 10 % formaldehyd til immunhistokemisk og toksikologisk analyse

Hematoxylin Eosin (H Inducerer apoptose i kræftceller i en dosis Tid afhængig måde

Det første skridt i at forstå effekten af ​​lange peber ekstrakt i denne undersøgelse var at vurdere effekten af ​​PLX på levedygtigheden af ​​kræftceller. Efter behandling med stigende koncentration af PLX ved stigende tidspunkter blev cellerne inkuberet med et vandopløseligt tetrazoliumsalt, der bliver metaboliseret til et rødt formazanprodukt af levedygtige celler med aktiv metabolisme. Dette produkt kan derefter kvantificeres ved absorbans spektrometri. Vi observerede effekten af ​​rå PLX reducere levedygtigheden af ​​kræftceller, herunder colon (HCT116), pancreas (BxPC-3), ovariecancer (OVCAR-3) og melanomceller. Denne effekt var dosis og tidsafhængig (figur 1). For yderligere at evaluere anticancer aktivitet af PLX, ønskede vi at vurdere dens rolle i celledød og dets selektivitet for cancerceller. Vores resultater viser, at PLX er i stand til selektivt at inducere celledød i cancerceller (colon, pancreas og leukæmi) i en dosis og tid afhængig måde, som karakteriseret ved stigningen i propidiumiodid positive celler i cancerceller behandlet med PLX (figur 2) . Desuden er denne effekt var selektiv, som normale kolon epitelceller forblev upåvirket af denne behandling, i samme koncentrationer og tidspunkter (figur 2B). Disse resultater blev kvantificeret ved anvendelse billedbaseret cytometri for at bestemme procentdelen af ​​celler, som undergår apoptose og total celledød. Vi observerede en stigning på 30-40% i annexin V-positive celler, efter PLX behandling og en 80-100% PI positive stigning i de samme celleprøver, der bekræfter induktionen af ​​apoptose, efterfulgt af nekrose i dyrkede cancerceller (figur 3).

Colon (HCT116), Ovarian (OVCAR-3), blev pancreas (BxPC-3) cancer og melanom (G-361) celler behandlet med en rå ethanolekstrakt af lange peber (PLX), hvorefter de blev inkuberet med WST-1 cellelevedygtigheden farvestof i 4 timer. Absorbans blev aflæst ved 450 nm og udtrykkes som en procent af kontrollen. Værdier er udtrykt som middelværdi ± SD fra firdobbelte af 3 uafhængige forsøg. ** P. 0,0001

(A) Efter behandling af human pancreas (BxPc-3) cancer og T-celle leukæmi celler med PLX, ved angivne tidspunkter, blev cellerne inkuberet med propidiumiodid og vurderes til induktion af celledød ved billedbaseret cytometri. (B) Lignende forsøg blev udført i humane coloncancer-celler (HT-29) og normal colon epithelceller (NCM460). Fluorescensmikroskopi blev anvendt til at vurdere induktion af celledød som karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​propidiumiodid-positive celler. Billeder blev taget ved 400 ganges forstørrelse på et fluorescerende mikroskop. Scale bar = 15 um.

Image-Based cytometri blev anvendt til at kvantificere apoptotisk induktion (% Annexin V positiv), efterfulgt af nekrose (% PI positive) i E6-1 og HT-29-celler efter PLX behandling. Manglen på annexin V eller PI-farvning blev anvendt som en indikation af levende celler efter behandling (% Annexin V /PI negative celler) (* P 0,05, ** P 0,003, *** P 0,0001). (E) For yderligere at bekræfte induktion af apoptose.

DNA fragmentation er et centralt biokemisk træk ved apoptose. For yderligere at bekræfte denne induktion af apoptose til TUNEL mærkning opdage DNA-fragmentering blev ansat. Kvantificering resultater fra billedbaseret viser cytometri effekten af ​​PLX i inducere apoptose efter DNA fragmentation i HT-29 coloncancer-celler på en tidsafhængig måde. VP16, en kendt kemoterapeutisk middel med DNA-beskadigende kapaciteter, blev anvendt som en positiv kontrol (figur 4).

TUNEL mærkning blev anvendt til at detektere DNA-fragmentering. Efter PLX og VP16 (som en positiv kontrol for DNA-skader) behandling blev celler mærket med DNA farvningsopløsning og kvantificeres ved billedbaseret cytometri. Behandlede celler blev sammenlignet med den ubehandlede celleprøve kontrol. (**** P 0,0001).

Derudover apoptose induktion i forskellige kræftceller, melanom (G-361), æggestokkene og tyktarmskræft (HT-29) celler, blev bekræftet af Annexin -V bindingsassay. Denne induktion af apoptose blev bekræftet at være selektiv for cancerceller, som normale kolon celler (NCM460) forblev upåvirket af PLX behandling. Dette blev vist ved cellekernekondensation, cellemorfologi og eksternalisering af phosphatidylserin til den ydre blad af cellemembranen, som angivet ved Hoechst-farvning, fasekontrast billeder og binding af annexin V farvestof (figur 5A og B). Selektiviteten af ​​PLX for cancerceller blev yderligere bekræftet ved WST-1 celleviabilitetstest som viste, at PLX var meget effektiv ved sådanne lave doser, blev et terapeutisk vindue let observeret (figur 5C). Behandling af HT-29 med 0,20 mg /ml reduceres effektivt levedygtigheden med ca. 90%, mens NCM460 celler forblev på 100% levedygtighed ved samme dosis. Dette indikerer, at PLX kan være mere effektive ved meget lave doser, hvilket yderligere reducerer chancerne for toksicitet i forbindelse med behandling

Efter behandling med PLX, celler (Ovarian;. OVCAR-3, melanom; G-361 og Normal colon epitel celler (NCM460) blev farvet med Hoechst for at karakterisere cellekernemorfologi og Annexin-V til påvisning apoptotiske celler (a) og cellulær morfologi ved fasekontrastmikroskopi (B);. Billeder blev taget ved 400 ganges forstørrelse på et fluorescerende mikroskop Scale bar = 15 um. (C) efter PLX behandling, HT-29 colorektale cancerceller og ikke-kræft NCM460 celler blev inkuberet med levedygtighed WST-1 celle farvestof i 4 timer og absorbansen blev aflæst ved 450 nm og udtrykkes som en procent af kontrol . Værdierne er udtrykt som middelværdi ± SD af 3 uafhængige forsøg ** p .. 0,0001

PLX inducerer caspase-Uafhængig apoptose i humane cancerceller

Caspaser er cystein asparaginproteaser der spille en fremtrædende rolle som død proteaser [17]. deres roller i forskellige celle dødsprocesser forbliver kontroversiel, da deres aktivering eller hæmning kan være afgørende for udviklingen af ​​hæmning af celledød veje [18], [19]. For at vurdere rollen af ​​caspaser i vores undersøgelse, efter behandling med 0,10 mg /ml PLX, ved angivne tidspunkter blev BxPc-3-celler opsamlet, vasket og inkuberet med lyseringsbuffer til opnåelse cellelysat. Cellelysatet blev inkuberet med caspase substrater, der er specifikke for hver caspase (3, 8 og 9) og inkuberet i en time. Fluorescensaflæsninger blev opnået under anvendelse af et spektrofluorometer. Vores resultater viser, at PLX er i stand til at aktivere begge veje (ydre og indre apoptose) i en tidsafhængig måde. Dette blev observeret som hurtig aktivering af caspase-3, 8 og 9 blev observeret så tidligt som en time efter behandling (figur 6A).

Efter behandling med 0,10 mg /ml PLX, ved angivne tidspunkter, BxPc -3 celler blev opsamlet, vasket og inkuberet med lyseringsbuffer til opnåelse cellelysat.