PLoS ONE: Muligheden for fækal MikroRNA’er som Novel Biomarkører for bugspytkirtlen Cancer

Abstrakt

Introduktion

Kræft i bugspytkirtlen (PCA) er en aggressiv tumor, der forbinder med høj dødelighed. Flertal af PCA patienter diagnosticeret normalt på sene tumor stadier, når de terapeutiske muligheder er begrænsede. MikroRNA’er (miRNA) er involveret i tumor udvikling og er almindeligt dysreguleret i PCA. Som en proof-of-principle studie, vi havde til formål at vurdere potentialet af fecal miRNA som biomarkører for kræft i bugspytkirtlen.

Materialer og metoder

Total RNA blev ekstraheret fra afføring hjælp Qiagen s miRNA Mini Kit . For miRNA udtryk analyserer vi valgt en delmængde af 7 miRNA, der ofte dysreguleret i PCA (miR-21, -143, -155, -196a, -210, -216a, -375). Efterfølgende blev ekspressionsniveauer af disse miRNA bestemt i fækale prøver fra kontroller (n = 15), kronisk pancreatitis (n = 15) og PCA patienter (n = 15) under anvendelse af kvantitative TaqMan-PCR-assays.

Resultater

Alle valgte miRNA var påviselige i fækale prøver med høj reproducerbarhed. Fire af syv miRNA (miR-216a, -196a, -143 und -155) blev påvist ved lavere koncentrationer i fæces fra PCA patienter sammenlignet med kontroller (p 0,05). Analyse af fækal miRNA udtryk i kontroller og patienter med kronisk pancreatitis og PCA afslørede, at ekspressionen af ​​miR-216a, -196a, -143 und -155 var højest i kontrol og lavest i PCA. Udtrykket af de resterende tre miRNA (MIR-21, -210 og -375) forblev uændret blandt kontroller og patienter med enten kronisk pancreatitis eller PCA.

Konklusion

Vores data giver nye beviser for den differentielle ekspression af miRNA i fæces fra patienter med PSA. Hvis held valideret i store prospektive studier, kan de fecal miRNA-biomarkører tilbyde nye værktøjer til PCA screening forskning

Henvisning:. Link A, Becker V, Goel A, Wex T, Malfertheiner P (2012) Feasibility af fækale MikroRNA’er som Novel Biomarkører for kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 7 (8): e42933. doi: 10,1371 /journal.pone.0042933

Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: 9. januar 2012; Accepteret: 16. juli 2012; Udgivet: 8. august, 2012 |

Copyright: © Link et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen (PCA) er den næststørste årsag af gastrointestinale kræft-dødsfald i Europa og USA [1], [2]. Trods intensiv grundforskning og klinisk forskning median overlevelse af patienter med PCA er fortsat ca. 6-10 måneder efter diagnosen, der fremhæver den aggressive tumor biologi af denne sygdom [3]. Størstedelen af ​​patienter med PCA ( 80%) til stede med formidling regional eller fjernt tumor på diagnosetidspunktet, der gør dem berettiget til kirurgisk tumor fjernelse, som er på nuværende tidspunkt den eneste potentielle helbredende behandling for denne malignitet [1], [3]. Udover potentielle kræftforebyggende livsstil ændringer (kost, motion, ophør af rygning etc.), screening og påvisning af tidlig PCA betragtes som mest lovende strategi for reduktion af PCA-associeret dødelighed [4] – [6]. Nuværende kliniske og diagnostiske forvaltning af PCA patienter er baseret på billedteknik såsom endoluminale ultralyd (EUS) eller kontrast-forstærket multi-detektor CT-scanning. Men på grund af deres invasive art, brug af stråling, og lav følsomhed /specificitet, sådanne teknikker i bedste må kun anvendes, til screening af patienter i højrisikogruppen (f.eks arvelig PCA, Peutz-jeghers syndrom etc.) [6], [7]. Derfor er der et umiddelbart behov for identifikation og udvikling af nye biomarkører, helst ikke-invasive diagnostiske teknologier, der kan forudsige udviklingen af ​​PCA eller dens diagnose på tidligste stadier.

Betydningen af ​​sådanne ikke-invasive biomarkører har længe været anerkendt. Følgelig er blod, fæces eller andre kropsvæsker øjeblikket menes at være de bedste muligheder for biomarkør forskning, der inkorporerer et bredt spektrum af genetisk og /eller epigenetisk ændringer i forbindelse med cancer [6], [8]. Baseret på dette paradigme, flere biomarkører såsom hTERT, CA72-4, Osteopontin, REG4, MIC-1,

K-ras

,

s-53

eller afvigende methylering af CpG øer de tumorsuppressorgener dem i øjeblikket [3], [9] – [11]. Ikke desto mindre, indtil dato, har kun kulhydrat antigen 19-9 (CA19-9) fundet sin kliniske anvendelighed i tidlig påvisning af tilbagevendende sygdom, efter kirurgisk behandling af PCA patienter [12]. Imidlertid er brugen af ​​CA19-9 for PCA-screening ikke anbefales på grund af lav følsomhed og specificitet [13].

MikroRNA’er (miRNA), de små ikke-kodning udskrifter af -22 nukleotider, har for nylig blevet identificeret som en ny klasse af cellulære molekyler med betydelige diagnostiske, prognostiske og terapeutiske implikationer [14]. MiRNA spiller en vigtig rolle i en lang række fysiologiske og patologiske processer [15]. I kraft af at regulere genekspression, er miRNA involveret i de tidligste trin i kræft patogenesen af ​​flere menneskelige kræftformer [15], [16]. Desuden forekomsten af ​​unikke miRNA ekspressionsmønstre kan identificeres forskellige typer og undertyper af cancere [17] – [19]. En af de mest spændende funktioner i miRNA er deres biologiske stabilitet sammenlignet med DNA eller mRNA. MiRNA er bemærkelsesværdigt beskyttet mod endogene og eksogene nedbrydning på grund af deres lille størrelse og exosomal tilstedeværelse i kropsvæsker [20], [21]. Baseret på dette paradigme har flere forskergrupper uafhængigt vist potentialet af miRNA som blod-baserede biomarkører for PCA [21] – [23]. Mens blod tilgang er stadig et spørgsmål om den intensive forskning, er det også blevet foreslået, at potentielt kan påvises gastrointestinal cancer-relaterede genetiske og epigenetiske ændringer i fæces [8], [24]. I betragtning af den store mængde (~1.5 l) bugspyt produktion og udskillelse i tarmen, er det blevet antaget, at præcancerøse eller tidlig cancer-beslægtede molekylære ændringer kan være detekterbar i afføring og blod af patienter med pancreascancer, hvilket giver en stærk rationale for fækal biomarkør forskning [8].

i betragtning af at PCA er forbundet med unikke ændring mønster af miRNA udtryk vi hypotese, at miRNA udtryk signatur kan være identificerbare i fæces fra patienter med pancreas neoplasi. Følgelig i den foreliggende undersøgelse vurderede vi potentialet af fækalt miRNA ekspression analyser til identifikation PCA. Som et bevis på hovedstol, vi viser, at flere fækale miRNA forskelligt udtrykkes hos patienter med sygdom i bugspytkirtlen. Pilot analyser af fæcesprøver fra patienter med kronisk pancreatitis og PCA foreslå en potentiel rolle for fækale miRNA som nye biomarkører i tidlig påvisning af PCA.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

undersøgelsen blev udført på de arkiverede fækale prøver fra konsekutive patienter, der er blevet indsamlet til kliniske analyser og prospektivt indsamlede afføring fra raske forsøgspersoner. Alle prospektivt rekrutteret raske frivillige forudsat skriftligt informeret samtykke og protokollen blev godkendt af Institutional Review Board ved Baylor University Medical Center [24]. De arkiverede fækale prøver blev de-identificeret, da der ikke kunne opnås den skriftligt informeret samtykke på grund af patientens migration eller død, og protokollen blev godkendt af Institutional Review Board of Otto-von-Guericke University Magdeburg (Magdeburg, Tyskland). I alt 45 fæcesprøver, herunder 15 kontroller, 15 patienter med kronisk pancreatitis og 15 PCA patienter blev inkluderet i undersøgelsen. Kontrolprøver blev tilfældigt udvalgt fra afføringsprøver indsamlet til påvisning af

Helicobacter pylori

i fæces fra patienter med ikke-maligne GI-lidelser såsom reflux eller gastritis. Prøver fra patienter med kronisk pancreatitis og PCA blev udvalgt fra konsekutive patienter med tilgængelige frosne fæcesprøver, som blev indsamlet til analyse fecal

elastase

niveauer som en rutinemæssig diagnostisk test for eksokrin pancreas insufficiens. Kliniske og demografiske data for de patienter er vist i tabel 1.

Afføringsprøver samling

Alle prøver blev indsamlet og behandlet ensartet ved hjælp af prøvetagningsrør afføring (Sarstedt AG, Nümbrecht, Tyskland) som praktiseres i de rutinemæssige kliniske omgivelser. Ambulante patienter blev bedt om at indsamle afføring derhjemme og bringe afføring under næste præsentation i afdelingen. Fækal prøve fra stationære patienter er blevet indsamlet i lignende måde. Før de når laboratoriet blev prøverne enten opbevaret ved + 4 ° C eller ved stuetemperatur. Når prøverne nåede laboratoriet blev prøverne alikvoteret og opbevaret kontinuerligt ved -30 ° C indtil yderligere anvendelse.

RNA-isolering

Totalt RNA (herunder miRNA) blev ekstraheret fra afføringsprøver hjælp Qiagens miRNAeasy Mini Kits (Qiagen) som beskrevet tidligere [24]. Kort fortalt blev ca. 30-50 pi frosset alikvoteret afføring homogeniseret med RNase-frit vand til en samlet 150 pi og straks lyseret med 800 pi QIAzol lysis reagens (Qiagen, Hilden, Tyskland). Udfældning blev udført med chloroform, og den vandige fase blev blandet med 1,5 volumener af 100% ethanol. Efter eluering blev RNA kvalitet vurderet ved anvendelse A260 /A280-forhold ved anvendelse af UV-spektroskopi og prøverne blev opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere analyse.

MicroRNA kvantificering af real-time PCR

Kvantitativ miRNA ekspression analyser blev udført under anvendelse af enten TaqMan miRNA Assays (Applied Biosystems, CA, USA) eller SYBRgreen fremgangsmåde ifølge producentens instruktioner som tidligere [24] beskrevne. Efter revers transkription blev prøver kørt under anvendelse iCycler IQ® detektionssystem (Bio-Rad, CA, USA). For at undgå en inter-plade skævhed /variabilitet, analyser miRNA ekspression blev udført under anvendelse af en enkelt plade med 96 brønde i dubletter. Forskelle mellem grupperne præsenteres som ACt, der repræsenterer forskelle mellem den gennemsnitlige Ct værdien af ​​miRNA af interesse og den gennemsnitlige Ct værdien af ​​normalizer miRNA. Vi anvendte MIR-16 for fækale miRNA normalisering i alle prøver, som det har vist sig at være mest konsekvent angives i andre fækale prøver, herunder prøver fra patienter med tyktarmskræft som tidligere beskrevet [24]. Udvælgelse af microRNA blev udført under anvendelse af følgende kriterier: a) rapporteres som pancreas-specifik microRNA (MIR-375) [25]; b) tidligere rapporteret for potentielle konsekvenser i bugspytkirtlen carcinogenese (miR-21, -196a, -210, -143, -155, -375, -216a) [26] – [28]; c) differential ekspression af miRNA er blevet rapporteret for blod (MIR-21, -155, -196a, -210) [21] – [23] og /eller pancreatisk fluid (MIR-21, -155; Tabel 2) [29 ]. Primer sekvenser for RT-PCR-analyser er anført i tabel S1.

MicroRNA microarray udtryk profilering og dataanalyse

MicroRNA microarray udtryk profilering blev udført med det formål at vurdere tilstedeværelsen af udvalgte miRNA i fæces som tidligere beskrevet [24]. Kort beskrevet blev totalt RNA ekstraheret fra en enkelt afføringsprøve fra et rask individ under anvendelse Qiagens miRNAeasy Mini Kit, som beskrevet ovenfor. Amplifikation og hybridisering blev udført ifølge producentens anvisninger (Illumina, Inc., San Diego, CA). Microarray databehandling og analyse blev udført ved hjælp af Illumina s BeadStudio software. Normalisering er blevet udført under anvendelse af Lumi BioConductor softwarepakken skabe log miRNA ekspressions værdier [30]. Efter konservativ sonde filtrering skridt, som udelukkede sonder, der ikke nåede en afsløring værdi på P 0,05 analyserne resulterede i pålidelig detektering for 630 sonder

Statistisk analyse

Data analyser blev udført med. GraphPad Prism 4.0 software (San Diego, CA, USA) eller SPSS 17.0 (IBM Deutschland GmbH, München, Tyskland). Forskellene mellem to grupper blev analyseret under anvendelse af Students t-test. Forskellene mellem mere end to grupper blev analyseret ved hjælp af Kruskal-Wallis-metoden med passende Dunns multipel sammenligning

post hoc

test. Sammenligningstabeller analyser blev udført ved anvendelse af Pearsons test. Hvor det er hensigtsmæssigt, blev logaritmisk regression bruges til at beregne R

2 og skabe ligningen af ​​skråningen. En to sidet p-værdi. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Valg af fækal miRNA

For at undersøge om PCA patienter har påviselige fækale miRNA udtryk ændringer, vi uropført systematiske analyser af litteraturen med det formål at vælge flere miRNA med størst evidens for miRNA deregulering i PCA patienter. Baseret på forskellen miRNA ekspression i pancreas tumorvæv [18], [26] – [28], ændringer i bugspyt [29] og i blod [21] – [23], som beskrevet ovenfor. Vi efterfølgende udvalgt 5 opreguleret (miR-21, -210, -143, -155, -196a) og 2 nedreguleret miRNA (miR-216a og -375) for yderligere analyser. Tabel 2 giver et samlet overblik over PCA-relaterede miRNA udtryk ændringer. For at få et samlet overblik for sporbarhed af de udvalgte miRNA i afføring hos normale raske forsøgspersoner, blev fækal miRNA udtryk profilering udføres ved hjælp af miRNA microarrays ved hjælp af en enkelt afføringsprøve fra raske frivillige. Som vist i figur 1A, alle de valgte miRNA var til stede i fæces ved påviselige koncentrationer

(A) miRNA microarray ekspression analyser blev udført ved anvendelse Illumina mikroarray at evaluere forekomsten af ​​udvalgte miRNA (MIR-16,. – 375, -196a, -216a, -21, -143, -155 og -210) i en enkelt afføringsprøve af den sunde individ. Fækal miRNA udtryk blev konverteret til at logge-udtryk værdier efter Lumi BioConductor normalisering. (B C) Angivelse af udvalgte miRNA blev bekræftet i alle 45 prøver, herunder kontrol, kronisk betændelse i bugspytkirtlen og bugspytkirtlen kræftpatienter. Figur (B) repræsenterer de rå miRNA udtryk Ct-værdier for kvalitativ vurdering. (C) Normalisering blev udført ved hjælp af standard ACt-metode under anvendelse miR-16 som intern fækal normalizer.

Variation og normalisering af fækale miRNA

Næste, vi evalueret miRNA udtryk i alle prøver samtidigt. Samlet set alle fecal miRNA analyserede viste høj grad af variation (over 10 Ct s) for de rå værdier (Figur 1B). For at normalisere miRNA udtryk blev ACt-værdier beregnet ved hjælp af miR-16 som en intern endogen normalizer som tidligere [24] beskrevet. Efter normalisering, opdagede vi, at ekspressionsniveauerne af miR-375, -21 og -210 demonstreret lav (standardafvigelse (± SD) 0,76, 0,71, 0,78, henholdsvis), og de af miR-216a, -143 og -155 ( ± SD: 3,31, 1,97, 2,15, henholdsvis) viste høj inter-individuel variation på tværs af alle prøver (figur 1C)

Langsigtet stabilitet fecal miRNA

Det er tidligere blevet vist, at. fecal miRNA er stabile i frisk indsamlede prøver eller FOBT-kits [24], men det vides ikke, om miRNA er stabile under langtidslagring. For at teste stabiliteten af ​​miRNA under de langsigtede opbevaringsbetingelser, vi analyserede fækale miRNA prøver fra en ekstra gruppe på 30 raske forsøgspersoner. Blandt disse blev femten fækale prøver (1-15) indsamlet mellem 2004 og 2006 og femten prøver (16-30) mellem 2009 og 2010. Som det fremgår af figur 2A, alle analyserede miRNA viste lignende ekspressionsniveauerne for både miR-16 og mIR-196a. Middel ± SD for miR-16 (figur 2B) blev 30,53 ± 2,21 for prøver efter langtidslagring i forhold til 29,59 ± 1,39 for frisk indsamlede prøver (p = 0,172), og at der af miR-196a var 33,41 ± 2,84 vs. 32,75 ± 1,43 (p = 0,426), henholdsvis (figur 2C). Efter normalisering med miR-16, mener ACt-værdi for miR-196a var -2,88 ± 1,03 for prøver indsamlet fra 2004-2006, og -3,16 ± 0,93 (p = 0,441) for prøver indsamlet i løbet af 2009-2010 (figur 2D).

for at vurdere den langsigtede stabilitet af prøverne, vi udførte miRNA analyser i de fækale prøver indsamlet på forskellige tidspunkter. Prøver 1-15 blev indsamlet mellem 2004 og 2006, og prøver 16-30 mellem 2009 og 2010 fra raske forsøgspersoner. Alle prøver blev opbevaret og behandlet i lignende forhold. Figur (A) viser variationer i MIR-16 og MIR-196a ekspression blandt alle fæcesprøver. (B) MIR-16 og (C) MIR-196a ekspression i analyser af undergrupper viste lignende ekspression (p 0,1). (D) Normalized miR-196a udtryk er sammenlignelige i lang- og kortsigtede gemte prøver (p = 0,441). (E) Da MIR-216a var til stede i fæces ved laveste koncentrationer, og dets ekspression blev analyseret af to uafhængige kvantitativ RT-PCR-kørsler for at evaluere reproducerbarheden af ​​analysen (p 0,0001). Normalisering blev udført med hjælp miR-16 som intern normalizer.

reproducerbarhed af resultaterne for de miRNA med lav udtryk

Blandt alle analyserede miRNA, miR-216a var til stede i afføring på laveste koncentration (figur 1C). For at undersøge, om selv miRNA med lav ekspression kan være pålideligt og reproducerbart analyseret i fæces, udførte vi to uafhængige ekspressionssystemer målinger. Som vist i figur 2E, blev MIR-216a ekspression reproducerbart detekteret i fæces fra alle prøver trods af sin lave koncentration (R

2 = 0,761, p 0,0001)

Differentiel ekspression af fækale miRNA i PCA patienter.

For at vurdere, om fækal miRNA ekspressionsanalyse tilgang kunne være nyttig i PCA diagnose, blev 45 fækale prøver evalueres. De kliniske karakteristika for patienterne er vist i tabel 1. Fifteen fækale prøver fra kontroller blev sammenlignet med femten hver fra patienter med PCA og med kronisk pancreatitis. Alle 7 testede miRNA, der er rigeligt dysreguleret i bugspytkirtelkræft, var til stede i fæces, dog med specifikke variationer i miRNA udtryk. Fire af 7 miRNA (miR-196a, -216a, -143 og -155) blev udtrykt på et betydeligt lavere niveau i afføringsprøver fra patienter med PCA sammenlignet med kontroller (Kruskal-Wallis med Dunns indlæg test p 0,05 for miR-196a og miR-216a og p 0,001 for miR-143 og -155). Blandt disse, kun miR-143 og -155 afslører signifikante forskelle mellem patienter med kronisk pancreatitis og kontrol. Interessant, subgruppeanalyser blandt de tre grupper afslørede gradvist fald i

median

ACt for miRNA-ekspression i fækale prøver fra kontroller til lavere udtryk hos patienter med kronisk pancreatitis og lavest i patienter med PCA (miR-196a: -2,50 vs. -3,00 vs -3,65; mIR-216a: -5,30 vs. -9,10 vs. -10,80; mIR-143: -5,20 vs. -6,00 vs -7,35 og mIR-155: 0,15 vs. -1,95 vs. -2,55 for kontrol vs. kronisk pancreatitis vs. PCA henholdsvis) som vist i figur 3. det er værd at nævne, at miRNA udtryk forskelle til trods for den lavere miRNA udtryk i fæces fra patienter med PCA og kronisk pancreatitis, ikke var statistisk signifikante. Især miR-21, -375 og -210, som ofte dysreguleret i pancreascancer, viste sig at være uændret i fæces fra kontroller og patienter med PCA og kronisk pancreatitis (figur 3).

Tal (A ) til (G) repræsenterer forskellige miRNA, der blev udvalgt til undersøgelse baseret på ændringerne i PCA væv. * Betegner p 0,05, *** – p 0,001. Forkortelser: N-kontrolpersoner, CP kronisk pancreatitis, PCA- kræft i bugspytkirtlen. Dataene er til stede som box-og-whiskers plot: den øvre og nedre grænser for kasserne angiver 75

th og 25

th fraktiler, linjerne inde i kasser – medianerne, og den øverste og nederste vandrette barer betegne den 90

th og 10

th fraktiler henholdsvis.

En kombination af miRNA som diagnostisk værktøj til PCA

det blev tidligere rapporteret, at udtryk mønster af flere miRNA snarere end enkelt miRNA vil sandsynligvis resultere i højere sensitivitet og specificitet for identifikation af humane kræftformer [28]. Baseret på denne antagelse hypotese vi, at kombinationen af ​​4 differentielt udtrykte miRNA ville give bedre diskrimination af patienter med PSA sammenlignet med kontroller. Eftersom alle 4 miRNA viste gradvist fald i miRNA udtryk vi sammenfattet ACt-værdier af miR-196a, -216a, -143 og -155 for hver prøve. Som vist i figur 4,

median

ΣΔCt-værdier var: for kontrol -12.78 vs. -21,45 for kronisk betændelse i bugspytkirtlen vs. -23,25 for PCA (Kruskal-Wallis test p 0,0002, Dunns indlæg test kontrol vs kronisk pancreatitis eller PCA p 0,05 og 0,001 henholdsvis). Ved hjælp af denne kombination, vi opnåede

median

ACt-værdi forskel på 10,47 (eller 1418 gange) mellem PCA og kontroller, mens ACt-værdi forskel for miR-143 alene var 2,15 (eller 4,4 gange).

summation af ACt-værdier mIR-196a, -216a, -143 og -155 blev udført for at beregne Σ ACt-værdi. * – P 0,05, *** – p 0,001. Forkortelser: N-kontrolpersoner, CP kronisk pancreatitis, PCA- kræft i bugspytkirtlen. Dataene er til stede som box-og-whiskers plot: den øvre og nedre grænser for kasserne angiver 75

th og 25

th fraktiler, linjerne inde i kasser – medianerne, og den øverste og nederste vandrette barer betegne den 90

th og 10

th fraktiler henholdsvis.

diskussion

i denne proof-of-principle studie, vi evaluerede muligheden for fækale miRNA som potentielle biomarkører til detektering af PCA. Ved hjælp af en delmængde af miRNA, der ofte dysreguleret i PCA, fandt vi, at miR-196a, -216a, -143 og -155 er til stede på lavere niveauer i fækale prøver fra patienter med PCA sammenlignet med kontroller. Derudover viser vi, at også kan detekteres ændringer i fækal miRNA ekspression i patienter med kronisk pancreatitis. Endelig viser vi, at en kombination af en delmængde af miRNA kan tilvejebringe en overlegen diagnostisk værdi med en højere følsomhed og specificitet for identifikation af pancreas neoplasi.

Udover billeddannelsesteknikker, er der et klart behov for alternative modaliteter for tidlig påvisning af PCA. For eksempel kan den invasive samling af bugspyt eller bugspytkanal børstning synes potentielt lovende; dette kan kun udføres i et begrænset antal patienter på grund af sin invasionsevne og manglende egnethed til screening. Blod-baserede biomarkør forskning har altid været i fokus, som det har enormt potentiale for at udvikle ikke-invasive screening tilgange. Imidlertid har afføring også blevet foreslået som lovende alternativ, specielt til GI-relaterede maligniteter, grundet konstant afgivelse af eksfolierede celler og produktion af pancreas fluid [8], [24]. Det menes, at fecal markører endog kan have højere diagnostiske udbytte, eftersom molekylære kræftrelaterede ændringer i DNA, kan detekteres mRNA og miRNA meget tidligere i fæces. For nylig har vi og andre vist, at påvisning af fækale miRNA er en mulig fremgangsmåde, der har en høj grad af reproducerbarhed, og at patienter med colon neoplasi viser ofte højere ekspression af MIR-21 og -106a sammenlignet med kontroller [24], [31 ]

i øjeblikket findes overbevisende dokumentation for vævsspecifikke ændringer i miRNA udtryk i PCA [21], [26] -. [28]. Disse miRNA har været i fokus for flere undersøgelser, som viser komplekse samspil med centrale veje og mål i bugspytkirtlen carcinogenese. Baseret på eksisterende viden for miRNA ekspressionsmønstre i PCA, i nærværende undersøgelse, vi har valgt 7 PCA-associerede miRNA, der enten up- (miR-21, -155, -143, -210 og – 196a) eller ned-reguleret (MIR -375, -216a) for miRNA-ekspression analyser i afføring. I et pivotalstudie, Bloomston et al. viste, at PCA har distinkt miRNA ekspressionsmønster med specifikke ændringer af 25 miRNA vs. godartede pankreatiske væv og 21 miRNA når man sammenligner med kronisk pancreatitis væv. Ved hjælp af denne miRNA udtryk mønster forfatterne kunne skelne PCA væv fra godartede og kronisk pancreatitis væv med nøjagtighed på mere end 90% [26]. Efterfølgende blev det vist, at ekspressionen af ​​miR-21 og -196a var forbundet med høj spredning (Ki67-indeks), tilstedeværelse af levermetastaser og forudsigelse af dårlig overlevelse /prognose [19], [26]. Vores data bekræfter tidligere rapporter, som viser bemærkelsesværdige stabilitet af fækale miRNA i afføring, samt deres høje koncentrationer til stede i fækale prøver [24], [32], [33]. Brug target tilgang, fandt vi forskellen miRNA udtryk for 4 ud af 7 miRNA (miR-196a, -216a, -143 og -155) i fæces fra patienter med PCA i forhold til kontrol, mens 3 miRNA (MIR-21, -375 og -210) blev udtrykt på samme niveau mellem forskellige raske forsøgspersoner og patienter. I denne proof-of-principle studie var det noget overraskende at bemærke, at fire af de differentielt udtrykte miRNA i vores undersøgelse viste nedsat miRNA ekspression i fæces fra patienter med PCA, mens tidligere undersøgelser har vist opregulering af MIR-196a, -143 og – 155 i pancreas tumorvæv fra patienter med bugspytkirtelkræft og nedregulering af mIR-216a [26] – [28]. Vores hypotese, at årsagen til ændringen i fækal vs. væv ekspression af disse miRNA kan være på grund af ændringerne i pancreas fluidudstrømning, som ofte patologisk hos patienter med kræft i bugspytkirtlen og kan være delvist ansvarlig for denne afvigende observation. På grund af den tilbagevirkende kraft af undersøgelsen, var vi i stand til at indsamle data om status af galde /pancreas kanalen obstruktion eller udføre parret tumor og fækal miRNA analyser. Men vores hypotese gevinster støtte fra flere anden undersøgelser. Først blev det tidligere vist, at udvalgte miRNA (MIR-21, -210, -155, -196a) blev opreguleret i plasma fra patienter med PCA, hvilket antyder deres mekanistiske involvering i pancreascancer [21], [22]. For det andet har en uafhængig undersøgelse viste forøget ekspression af miR-155 i bugspytkirtlen væske af PCA patienter [29], hvilket yderligere understøtter vores observation. For det tredje, vores egen observation for den gradvise gradvist fald i ekspression af udvalgte miRNA i fæces fra patienter med kronisk pancreatitis sammenlignet med kontroller og PCA patienter støtter dette argument. Alligevel har vi ikke finde nogen signifikante forskelle i fækal miRNA udtryk mellem PCA og patienter med kronisk pancreatitis, som kan afspejle enten den høje risiko for PCA udvikling i patienter med CP fra den ene side eller potentielt kan foreslå et forhold til eksokrine eller endokrine pancreas insufficiens .

i denne undersøgelse blev miRNA profilering udelukkende bruges til at få den globale overblik til identifikation af miRNA ekspressionsmønstre i fækale prøver fra bugspytkirtlen kræftpatienter. Da tilgængelige prøver med tilbagevirkende kraft blev opsamlet og opbevaret til langsigtet, vi bevidst undgået profilering af disse tumorvæv for at undgå potentiel selektionsbias ved hjælp af en high-throughput microarray-baserede teknik. Selvom udvalgte miRNA viste ubetydelige forskelle mellem CP og PCA patienter, mener vi, at vores resultater er tankevækkende for PCA biomarkør forskning, og giver en overbevisende springbræt for virksomheden yderligere prospektive studier i fremtiden systematisk evaluere potentielle forskelle i miRNA, der er unikke for disse patientgrupper delmængder med hensyn til pancreas og galdegang status. Resultater af vores undersøgelse understreger behovet for yderligere forskning på den biologiske betydning af deregulerede miRNA i bugspytkirtlen neoplasi. Som det fremgår af tabel 2 er de fleste af de analyserede i vores undersøgelse miRNA har flere, kræftrelaterede valideret genmål i humane cancere. F.eks Gironella et al. har vist, at MIR-155 mål Tumor protein 53-induceret kerneprotein 1 (TP53INP1) forstyrre dets anti-tumoraktivitet i bugspytkirtelkræftceller [34]. Flere grupper har vist, at MIR-21-mål PTEN, Reck, PDCD4, som kan være ansvarlig for onkogen rolle MIR-21 [35], [36]. Ligeledes MIR-143, som ofte dereguleret i pancreascancer, har vist sig at interagere med KRAS [37] og tilbagelevering af tumor suppressor miRNA kan inhibere tumorvækst i xenograft bugspytkirtelkræft model med nanovector levering af MIR-143/145 [38 ]. Derudover MIR-196a og MIR-210 har vist sig at spille en onkogen rolle ved at målrette flere tumorsuppressorgener (ANXA1, KRT5, RAD52) påvirker proliferation og hypoxisk stress [39] – [42], mens MIR-375 og -216a , som ofte nedreguleret i bugspytkirtelkræft, har været impliceret i insulinsekretion og i reguleringen af ​​celle overlevelse og spredning ved at målrette flere onkogener såsom PDK1, JAK2, ATG7 [25], [43] – [46]. Disse data er tiltrækkende for yderligere intensiv forskning af biologisk betydning af miRNA som biologisk effekt af exosomal miRNA kan være ud over de cellulære eller lokale tumorale effekter [47], [48].

Aktuelle data implicerer, at miRNA ekspressionsmønstre, snarere end en enkelt miRNA kan være nødvendig for bedre værktøj til en miRNA-baserede diagnostiske tilgang. For eksempel i vores undersøgelse, vi udført en simpel summation af de ACt værdier, som tilladt os at opnå en bedre diskrimination af median ACt-værdier patienter med PCA sammenlignet med kontroller. En sådan fremgangsmåde kan være af betydning, hvis der anvendes fækal miRNA ekspressionsmønstre til screening af andre GI maligniteter. Dette er især relevant, da fækal analyse bredt implementeret i klinisk praksis, f.eks fækal okkult blodprøver for kolorektal cancer screening og til evaluering af pankreaselastase i fæces som biomarkør for eksokrin pancreas insufficiens. Hvis valideret i fremtiden kan visionen om fækal miRNA tilgang til identifikation af GI tumorer let oversættes til diagnostik, en tilgang, der utvivlsomt vil have en overlegen overholdelse patient i forhold til de for tiden tilgængelige invasive diagnostiske tests.

Selvom lovende, fækal miRNA tilgang kræver yderligere intensiv undersøgelse forud for klinisk anvendelse. Som tidligere erkendt, på grund af vores evne til at omfatte kun begrænset antal prøver i denne proof-of-principle undersøgelse, den statistiske signifikans af vores resultater giver begrænset evidens for klinisk anvendelighed og potentiale fækal miRNA til diagnosticering af PCA patienter i nærmeste fremtid. Ikke desto mindre mener vi, at vores resultater er nye og fremtidige undersøgelser, herunder prospektiv indsamling af prøverne med forskellige tumor stadier med komplet biokemisk og klinisk anmærkning for pancreas /galdegang obstruktion er nødvendige på grund af mulige konsekvenser af pancreas kanalen obstruktion på fækal miRNA ekspressionsniveauerne .