PLoS ONE: Funktionel Polymorfi af CK2α Intronless Gene Afspiller Onkogene Roles i lungekræft

Abstrakt

Protein kinase CK2 er ofte opreguleret i humane kræftformer, selvom mekanismen for CK2 aktivering i kræft er fortsat ukendt. I denne undersøgelse undersøgte vi rolle CK2α intronless genet (

CSNK2A1P

, en formodet CK2α pseudogen) i patogenesen af ​​humane cancere. Vi fandt beviser for forstærkning og overekspression af

CSNK2A1P

gen i ikke-småcellet lungecancer og leukæmi-cellelinjer og 25% af de lungekræftpatienter væv undersøgt. MRNA-ekspressionsniveauer korreleret med kopi numre af

CSNK2A1P

gen. Vi identificerede også en ny polymorf variant (398T /C, I133T) i

CSNK2A1P

gen og viste, at 398T allel selektivt forstærkes over 398C allel i 101 ikke-småcellet lungekræft vævsprøver i forhold til dem i 48 normale kontroller (

s

= 0,013 0,05). Vi viser for første gang CSNK2A1P proteinekspression i transficerede humane embryoniske nyre 293T og muse embryonale fibroblast NIH-3T3-cellelinier. Begge alleler transformerer i disse cellelinier, og 398T allelen synes at være mere transformerende end 398C allel. Desuden 398T allelen nedbryder PML tumorsuppressorprotein mere effektivt end 398C allel og viser en relativt stærkere binding til PML. Knockdown af

CSNK2A1P

genekspression med specifikke siRNA øgede PML proteinniveauet i lunge kræftceller. Vi rapporterer, for første gang, at den

CSNK2A1P

gen er en funktionel proto-onkogen i humane kræftformer og dets funktionelle polymorfi synes at nedbryde PML forskelligt i kræftceller. Disse resultater er i overensstemmelse med en vigtig rolle for 398T allel af

CSNK2A1P

i human lungecancer modtagelighed

Henvisning:. Hung MS, Lin YC, Mao JH, Kim IJ, Xu Z, Yang CT, et al. (2010) Funktionel Polymorfi af CK2α Intronless Gene Afspiller Onkogene roller i lungekræft. PLoS ONE 5 (7): e11418. doi: 10,1371 /journal.pone.0011418

Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: 17. december, 2009; Accepteret: 5 juni 2010; Udgivet: 2 jul 2010

Copyright: © 2010 Hung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af National Institutes of Health (093708-01A3) og Larry Hall og Zygielbaum Memorial Trust, og Kazan, McClain, Edises, Abrams, Fernandez, Lyons og Farrise Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste dødsårsag af kræft i USA [1] Stater. Nogle af de somatiske begivenheder involveret i lungekræft er blevet godt karakteriseret, men nogle af dem er stadig ukendte [2], [3]. Protein kinase CK2 (tidligere kendt som casein kinase II) er en serin /threoninproteinkinase der phosphorylerer mere end 300 proteiner [4]. Det nedbrydes tumorsuppressorproteiner såsom PML [5] og fremmer aktiviteten og stabiliteten af ​​onkogene proteiner såsom AKT [6]. For eksempel CK2 fremmer PML nedbrydning og CK2 kinaseaktivitet er omvendt korreleret med PML proteinniveauer i human lungecancer [5]. For nylig blev multipelt overlevelse myelomcelle vist at stole på den høje aktivitet af proteinkinase CK2 [7]. CK2 påvirker også flere celle signalveje, herunder PI3K, NFkB, og Wnt veje [8].

Niveauet af CK2α udtryk er stramt reguleret i normale celler [9], og øget CK2α niveau og aktivitet har konsekvent været observeret i en række forskellige humane cancere [10]. For eksempel er den højaktivt og /eller nuklear lokalisering af CK2α er en markør for dårlig prognose for patienter med akut myeloid leukæmi, prostatacancer, og pladecelle lungecancer [10]. CK2α er den katalytiske underenhed af protein kinase CK2 og CK2α er blevet rapporteret til at være kodet af

CSNK2A1

genet på kromosom 20p13 [11].

CSNK2A1

gen kan tjene som et onkogen og dets dysreguleret udtryk kan fremkalde mammae tumorer og lymfomer i transgene mus [12], [13]. Selv om aktiviteten af ​​

CSNK2A1

genet er blevet vist at være forhøjet i humane cancere, nogen fast genetisk eller epigenetisk foreligger dokumentation vedrørende årsagen til den høje aktivitet af CK2α i cancerceller [10]. Den CK2α intronless genet (også kendt som CK2α “pseudogen”),

CSNK2A1P

, er placeret på kromosom 11p15.3 og dets sekvens er meget homolog (99% identitet) til

CSNK2A1

cDNA sekvens [14]. Selv om

CSNK2A1P

gen sigende udtrykkes i en megakaryocytisk cellelinje [15], dens rolle i kræftcellen udvikling er fortsat ukendt. Vi undersøgte derfor forstærkning og udtryk for

CSNK2A1P

gen i lungekræft og leukæmi-cellelinjer og lungekræft væv.

Resultater

Over-ekspression og forstærkning af

CSNK2A1P

gen i cancerceller og lungekræft væv

vi fokuserede på

CSNK2A1P

gen, fordi vi oprindeligt fandt det var minimalt udtryk i normale celler, men blev overvejende udtrykt i flere typer af humane cancercellelinier og tumorvæv, herunder den humane T-celle-leukæmi-cellelinie Jurkat, der er kendt for sin høje CK2 aktivitet. Ved semi-kvantitativ RT-PCR, viste vi, at

CSNK2A1P

gen er også overudtrykt i tre NSCLC linjer: H1299, H322, og A549, men minimalt udtrykt i normale celler og to lung cancercellelinier H1650 og H460 (fig. 1A). Desuden

CSNK2A1P

mRNA blev overudtrykt i lunge tumorvæv fra syv ud af 29 (-25%) tumorprøver sammenlignet med matchede kontrol væv (fig. 1B). Desuden FISH-analyse på de samme menneskelige kræftceller forudsat solid dokumentation for forstærkning af

CSNK2A1P

gen placeret på kromosom 11p15.3 (fig. 1D). For eksempel, fire kopier af

CSNK2A1P

gen blev fundet i den humane T-celle-leukæmi-cellelinie Jurkat, og tre eksemplarer på lungekræft cellelinier H1299, A549, og H322. Derimod normale lymfocytter og H460 cellelinien havde diploide kopier af

CSNK2A1P

gen (fig. 1C og D). Vigtigere er det, mRNA ekspressionsniveauerne korreleret med kopi numre af

CSNK2A1P

gen i disse humane cancer cellelinjer (n = 8; Pearsons γ = 0,9346;

s

= 0,0007). (Fig 1 E ). Vi yderligere udføres semi-kvantitativ RT-PCR for at vurdere mRNA ekspression af

CSNK2A1

gen med specifikke primere. Overekspression af

CSNK2A1

gen blev også bemærket i ovenstående cancer cellelinjer (fig. 1F), hvilket tyder på, at ud over den

CSNK2A1

gen,

CSNK2A1P

gen også spiller en vigtig rolle i patogenesen for lungekræft. Justering af primerne anvendt til semi-kvantitativ RT-PCR af

CSNK2A1

og

CSNK2A1P gener

blev vist i supplerende data (fig. S1).

(A) Semi-kvantitativ RT-PCR ved hjælp CSNK2A1P-specifikke primere viser CSNK2A1P mRNA-ekspression niveau er i overensstemmelse med kopiantal detekteres af FISH (3 for H1299, 4 for Jurkat, 3 for H322 og A549, 2 for WI-38 og CCL-211 ). (B) Delvis kvantitativ RT-PCR under anvendelse CSNK2A1P-specifikke primere viser den CSNK2A1P mRNA overudtrykkes i syv (patient 1 til 7) ud af 29 (-25%) lungetumorer i forhold til matchede normale tilstødende væv. Patient 8 til 14 repræsenterer prøver uden overudtrykt CSNK2A1P mRNA. Andre 14 prøver med lignende resultater er ikke vist. (C)

CSNK2A1P

genet amplificeres i den humane T-celle-leukæmi-cellelinie Jurkat, og i lungekræft cellelinier H1299, A549, og H322. (D) Repræsentative billeder af FISH undersøgelsens resultater i metafaser af normal lymfocyt, Jurkat, H322 og A549-cellelinjer.

CSNK2A1P

genet blev mærket med Cy3 (i rødt). Kromosom 11 centimeter probe blev mærket med FITC (med grønt). (E) Korrelation af kopien nummer og mRNA-ekspression

CSNK2A1P

gen blev beregnet ved hjælp af Pearson korrelation. (F) Semi-kvantitativ RT-PCR under anvendelse CSNK2A1-specifikke primere viser CSNK2A1 mRNA-ekspression niveau i normale og cancer-cellelinier nævnt ovenfor. Alle semikvantitative RT-PCR-forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater.

allel-specifik forstærkning af

CSNK2A1P

gen i lungekræft

For at bestemme om der er mutationer af

CSNK2A1P

i humane lungekræft, vi sekventeret den åbne læseramme af

CSNK2A1P

gen. Selvom vi ikke finde nogen mutationer, opdagede vi en hidtil ukendt polymorfisme inden kinasedomænet (398T /C, hvilket fører til aminosyreændring I133T, fig. 2A) i 18 cancercellelinier (tabel 1) og 101 primær lung cancer vævsprøver (tabel 2). Den specifikke aminosyreændring forudsiges at påvirke proteinfunktion når den sortering intolerante fra tolerant (SIFT) metoden [16]. Interessant denne polymorfi synes at være jævnt fordelt i normalt væv, men i tumorer, var signifikant hyppigere på 398T allel (figur 2C.) (Chi-square test, p 0,05). Endvidere af de 56 heterozygote lungekræft undersøgte væv med hensyn til denne polymorfi (fig. 2D), 20 (35,7%) prøver viste amplifikation i denne region, og i 18 (90%) af disse 20 prøver, den 398T allelen var selektivt amplificeret (fig. 2E). Denne selektive amplifikation antyder, at 398T allel kan give en vækstfordel over 398C allelen. For yderligere at validere resultaterne fra DNA-sekventering, undersøgte vi allelspecifik amplifikation af 398T allel af

CSNK2A1P

(koder for Ile133 variant) i humane tumorer under anvendelse af en kvantitativ enkelt-nukleotid polymorfisme (SNP) analyse, dvs. TaqMan-baserede allel diskrimination assay. data for diskrimination allele er i overensstemmelse med sekventeringsdata (fig. 2B). Af de 101 lung tumorprøver indtastet, 56 var heterozygote med hensyn til 398C → T polymorfi, og vi har analyseret disse 56 prøver til allelspecifik amplifikation af 398C → T polymorfi af

CSNK2A1P

efter TaqMan-analyse (Fig . 2B). Tyve prøver viste allel ubalance mellem de to alleler, viste 2 prøver gevinst af 398C allelen (koder Thr133) og 18 prøver viste gevinst af 398T allelen (koder Ile133). Disse resultater viser statistisk signifikant allel-specifik forstærkning af 398T allelen (

P

0,05, Chi-Square test), hvilket giver yderligere beviser for den rolle af denne allel i human lungekræft. Disse resultater fik os til at sonden dybere ind i rollen som varianten

CSNK2A1P

former i tumor udvikling.

(A) allel-specifik forstærkning af 398T allelen (TTT /C eller TT /C) findes i nogle ikke-småcellet lungekræft vævsprøver. T over pilespidsen (nukleotid 398T, I133,) til højre er angivelsen af ​​vildtype-genet. (B) Forstærkning af

CSNK2A1P

alleler i lungetumorer blev valideret af kvantitativ allelspecifik enkelt polymorfi (SNP) analyse. Forholdet mellem 398T og 398C alleler i heterozygote lungetumorer blev bestemt ved TaqMan-analyse ved hjælp af allel-specifikke prober og udtrykkes som forskelle i CT niveauer (cykler) med positive eller negative ACt værdier angiver forstærkning af 398T eller 398C allel hhv. Af 56 prøver indtastet, 2 viste forstærkning af 398C-allelen større end 0,6 CTS (prøver T3-4) og 18 viste forstærkning af 398T allelen (prøver T5-23). Tredive-seks prøver viste ingen forstærkning (repræsenteret ved T1-2). Normale kontroller prøver viste ingen amplifikation (N1-3). De normaliserede gennemsnit og standardafvigelser af tre uafhængige forsøg er vist. (C, D og E) allelspecifik amplifikation af 398T allelen øger i ikke-småcellet lungekræft vævsprøver. Normal: voksent menneske normalt genomisk DNA. Tumor: no-småcellet lungekræft væv. * Betegner p. 0,05 (Chi-square test) Vejviser

Differential transformerende aktivitet af de to

CSNK2A1P

alleler

For at teste funktionelle betydning af 398T → C polymorfi i

CSNK2A1P

gen, vi klonede

CSNK2A1

og

CSNK2A1P

gener i pcDNA 3.1 /myc-His vektor og gennemført en serie af cellevækst assays under anvendelse af NIH3T3-celler. I denne undersøgelse blev disse vektorer transient transficeret ind 293T og NIH3T3-celler og blev anvendt western-analyse for at bekræfte proteinekspression i begge alleler af

CSNK2A1P

genet (fig. 3A). Resultaterne viser for første gang, at ekspressionen af ​​

CSNK2A1P

kan producere sine proteiner.

(A)

CSNK2A1

og

CSNK2A1P

gener blev transient transficeret ind i 293T og NIH3T3-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens ifølge producentens protokol. 72 timer efter transfektion blev cellerne høst og totale cellulære proteiner blev ekstraheret. Western blot-analyse blev anvendt til at bekræfte proteinekspression i begge alleler af

CSNK2A1P

gen. Anti-Myc-mærke-antistof blev anvendt til at detektere de CSNK2A1P-myc-mærket fusionsproteiner. (B) Kolonidannelse assay. Transfektion af

CSNK2A1P

gen i NIH3T3 celler resulterer i forbedret forankringsafhængige vækst, sammenlignet med den tomme vektor kontrol. The Colony antal NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler er dramatisk højere end for de NIH3T3-EV celler. (C) blød agar-assay. Stabil transfektion af

CSNK2A1P

gener i NIH3T3 celler resulterer i forbedret forankringsuafhængig vækst. Både NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler produceret betydeligt flere kolonier end de NIH3T3-EV celler gjorde (* p 0,05, t-test). Af de to alleler af

CSNK2A1P

genet, 398T allelen dannet flere kolonier end 398C allelen gjorde (** p 0,05, t-test). Relativ kolonidannelse i begge cellelinier udtrykkes som procent normaliseret til tom-vektor-transficerede kontrolgruppe og vist som bar ± standardafvigelse i tre uafhængige forsøg. (D) kinaseassay af det udtrykte CSNK2A1 og CSNK2A1P proteiner i NIH3T3-celler. De udtrykte proteiner blev immun-udfældet med anti-Myc-mærke-antistof og kinaseassay blev udført. Både NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler havde signifikant højere kinase aktiviteter end NIH3T3-EV celler gjorde (* p 0,05, t-test). Af de to alleler af

CSNK2A1P

gen, de 398T allel celler havde signifikant højere kinaseaktivitet end 398C allel gjorde (** p 0,05, t-test). Relativ kinase aktivitet udtrykkes som procent normaliseret til tom-vektor-transficerede kontrolgruppe og vist som bar ± standardafvigelse i tre uafhængige forsøg. EV: tom vektor. Wt: CSNK2A1. 398C: CSNK2A1P (I133) 398T: CSNK2A1P (I133T)

I kolonidannelse assay, transfektion af

CSNK2A1P

gener i NIH3T3 (NIH3T3-CSNK2A1P) celler resulterer i forbedret forankring. -afhængig vækst, sammenlignet med den tomme vektor kontrol (NIH3T3-EV). Desuden frembragte vi NIH3T3-celler med CSNK2A1 (NIH3T3-CSNK2A1) som en positiv kontrol. The Colony antal NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler dramatisk højere end for de NIH3T3-EV-celler (fig. 3B). Transfektion af

CSNK2A1P

gen i NIH3T3 celler resulterede også i forbedret forankringsuafhængig vækst. Når blød agar-kolonidannelse analyseresultater blev sammenlignet, fandt vi, at stabil transfektion af

CSNK2A1P

gener i NIH3T3-celler resulterede i forøget forankringsuafhængig vækst (figur 3C). Både NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler produceret flere kolonier end de NIH3T3-EV-celler gjorde. Sammenlignet med NIH3T3-EV celler, NIH3T3-CSNK2A1 og NIH3T3-CSNK2A1P celler producerede kolonier, der var for det meste større og havde spredt-out figurer. Når de to alleler af

CSNK2A1P

gener blev sammenlignet, fandt vi, at 398T allel dannede flere kolonier end 398C allelen gjorde. En kinaseassay af de udtrykte proteiner blev ligeledes udført (figur 3D). Den 398T genproduktet har en højere kinaseaktivitet end 398C genproduktet gør. Resultaterne fra kinase assay er i overensstemmelse med kolonidannelse og blød agar data.

Funktionel polymorfi af

CSNK2A1P

gener på nedbrydningen af ​​PML tumor suppressor protein

Til bestemme den potentielle mekanisme, hvormed 398T allel præferentielt amplificeret i prøver lungecancer, studerede vi effekterne af de to alleler af

CSNK2A1P

genet på tumor suppressor PML-protein.

CSNK2A1P

gener stabilt transficeret i NIH3T3 og NSCLC H1650 cellelinjer. Western blot analyse viste en reduceret PML proteinniveau i cellerne transficeret med

CSNK2A1P

gener. Den CSNK2A1P 398T allel, der ligner vildtype CSNK2A1, nedsat PML proteinniveauer mere end 398C allel gjorde (fig. 4A). For det andet, vi stilling til, om halveringstiden for PML er forskelligt reguleret af de to alleler. Disse to cellelinjer transficeret med

CSNK2A1P

gen blev behandlet med cycloheximid i 0, 2, og 6 timer, og de endogene PML proteinniveauer blev undersøgt. Den 398T allel faldt halveringstiden for PML mere effektivt end 398C allel gjorde (fig. 4B). Tredje, anvendte vi co-immunpræcipitering at vise den direkte og præferentiel binding mellem 398T proteinet og PML-protein (fig. 4C).

(A) PML-proteinet aftager i NIH3T3 og H1650 stabile cellelinier, som blev transfekteret af

CSNK2A1

og

CSNK2A1P

gener. Den endogene CSNK2A1 protein og overudtrykte CSNK2A1 og CSNK2A1P proteiner blev også vist. (B) Nedbrydning af PML-proteinet er mere fremtrædende i NIH3T3 stabile cellelinjer transficeret med CSNK2A1 og CSNK2A1P (I133). Hr: timer efter cycloheximid behandling. (C) 293T-celler blev co-transficeret med PML-V5 og Myc-mærkede CSNK2A1 eller CSNK2A1P konstruktioner. CSNK2A1 og CSNK2A1P (I133) viser stærkere binding til PML protein i gensidige immunopræcipitationsanalyser. EV: tom vektor. Wt: CSNK2A1. 398T: CSNK2A1P (I133) 398C: CSNK2A1P (I133T). (D) Udtrykket af

CSNK2A1P

gen falder i H1299 lungekræft cellelinje efter transfektion med

CSNK2A1P

gen specifikke siRNA. Ingen fald i ekspressionen af ​​

CSNK2A1

og

CSNK2B

gener blev noteret. (E) De CK2α protein niveau falder, og de PML protein niveau stiger i H1299 lungekræft cellelinje efter transfektion med

CSNK2A1P

gen specifikke siRNA. N: negativ kontrol siRNA. CSNK2A1P:

CSNK2A1P

siRNA. Bandet tætheder normaliseres til den negative siRNA transficeret gruppe ved hjælp actin som en intern kontrol. Alle forsøg blev gentaget tre gange med lignende resultater.

For yderligere at behandle spørgsmålet om, hvorvidt CSNK2A1P mRNA er fuldt oversat og nedbryder PML i kræftceller, vi bankede ned

CSNK2A1P

gen i H1299 lunge cancer cellelinjer med siRNA specifikke for

CSNK2A1P

gen. Vi valgte H1299 lungecancer-cellelinje, fordi vores undersøgelse (figur 1A og C) viste, at

CSNK2A1P

genet amplificeres og overudtrykkes i denne cellelinie.

CSNK2A1P

gen specifik siRNA forårsagede et fald på mere end 70% i udtryk for

CSNK2A1P

gen og ingen fald i ekspressionen af ​​

CSNK2A1

og

CSNK2B

gener (fig. 4D). I overensstemmelse med nedsat udtryk for

CSNK2A1P

gen, faldt den samlede CK2α protein og PML protein steget i de celler behandlet med

CSNK2A1P

siRNAs forhold til negative siRNA transficerede kontroller (Fig. 4E) .

diskussion

i denne undersøgelse har vi givet, at vi ved, den første beviser for, at den

CSNK2A1P

gen er en funktionel proto-onkogen i humane kræftformer . At støtte vores hypotese, at

CSNK2A1P

gen er et funktionelt protoonkogen, snarere end en “pseudogen”, vi har gjort omfattende DNA, mRNA, protein og siRNA analyse. Resultaterne af denne analyse giver den første dokumentation for, at mRNA-ekspressionen niveauet korrelerer med kopiantallet af

CSNK2A1P

gen i adskillige humane cancercellelinier. Desuden siRNA banke ned af

CSNK2A1P

gen faldt totalt CK2α proteinniveau i kræftceller, hvilket indikerer, at

CSNK2A1P

gen er fuldt oversat i kræftceller. Således kan forstærkningen af ​​

CSNK2A1P

gen spiller en onkogen rolle i disse menneskelige kræftceller. På baggrund af vores resultater, foreslår vi, at to funktionelle gener kan eksistere i den menneskelige CK2α familien,

CSNK2A1

, som lokaliserer på kromosomet 20p13, og

CSNK2A1P

, som lokaliserer på kromosomet 11p15.3.

Vi fandt også en hidtil ukendt polymorfisme inden kinasedomænet (398T /C, hvilket fører til aminosyreændring I133T, figur 2a) i 101 primære tumorer. Denne polymorfi synes at være jævnt fordelt i normalt væv, men i tumorer, er betydeligt hyppigere i 398T allel (tabel 2, figur 2). Den 398T allelen blev selektivt forstærket i atten af ​​de 101 lungekræft væv, hvilket tyder på det kan give en vækst fordel i forhold til 398C allel. Den 398C allel forstærkning blev kun fundet i to af de 101 lungekræft væv, hvilket tyder på, at det kunne være en tilfældig begivenhed. Disse spændende genetiske resultater fik os til at dykke længere ned rolle varianten

CSNK2A1P

former i tumor udvikling. Doing så gav to vigtige resultater, først, at 398T allelen er mere transformerende end 398C allelen, og for det andet, at den 398T allelen nedbryder tumor suppressor PML protein mere effektivt end 398C allel. For eksempel viste 398T allel signifikant højere transformerende aktivitet i både kolonidannelse og blød agar-assays end 398C allelen (fig. 3B og C). Dataene for kinase-assay viste, at 398T genproduktet har højere kinaseaktivitet end 398C genproduktet (fig. 3D), hvilket antyder, at 398T allelen er en mere transformerende allel end 398C allelen. Derudover antyder disse data, at den transformerende evne 398T allel af

CSNK2A1P

pseudogen svarer til den for den normale

CSNK2A1

genprodukt, så den mere aktive allel af pseudogenet synes at have aktivitet kan sammenlignes med den almindelige

CSNK2A1

gen. Til dato er der ingen genetisk eller epigenetisk beviser på aktivering af CSNK2A1 gen i human cancer. Således vores undersøgelse giver det første bevis på, at

CSNK2A1P

398T allel, som svarer til den

CSNK2A1

gen, forstærkes i humane lungecancer væv.

PML genet blev oprindeligt identificeret ved brudpunktet af t (15; 17) translokationen i akut promyelocytisk leukæmi [17] og blev vist sig at være et tumorsuppressorgen [18]. Tab af PML er blevet korreleret med dårlig klinisk resultat i en række forskellige humane cancere, herunder lungekræft, støtte sin tumorsuppressorfunktion [5], [19]. PML fremmer dephosphorylering af pRb og regulerer celle skæbne i udviklingslandene neocortex [20]. CK2 regulerer ubiquitinmedieret nedbrydning af PML i humane lungekræft cellelinier [5], [21]. Dette kan være en af ​​de potentielle mekanismer, som 398T allelen er fortrinsvis forstærkede i prøver lungekræft. Denne genetiske polymorfisme er sandsynligvis en nyttig markør til påvisning af amplifikation af CK2 intronless gen, fordi monoallelisk amplifikation menes at være ansvarlig for genamplifikation ved cancer [22]. Denne allel-specifik amplifikation indebærer også, at cancerceller kan være afhængige af den onkogene CK2α [23]. Kort sagt, forstærkningen af ​​398T allel af

CSNK2A1P

gen kan bidrage, i det mindste delvis, til patogenesen af ​​lungekræft.

CSNK2A1P

gen er et forarbejdet pseudogen placeret på kromosomet 11p15.3 og formodes at være dannet af retrotransposition, og karakteriseret ved fravær af introner, tilstedeværelsen af ​​flankerende dirigerer gentagelser, og 3′-polyadenylerings- hale [15]. Men det har en stærk promotor opstrøms fra initieringskodonen (14, 15). Udtrykket af

CSNK2A1P

gen er potentielt mere stramt reguleret end den

CSNK2A1

er. For eksempel promotorregionen af ​​

CSNK2A1P

gen indeholder to TATA bokse og en CAAT boksen, mens den opstrøms sekvens af

CSNK2A1

viser husholdningsgen egenskaber, fx høje GC-indhold, tilstedeværelsen af flere GC-bokse og manglen TATA-boks (14, 15). Desuden er der flere vigtige transkriptionsfaktor-bindingssites (f.eks CEBP-, Gata, og SMAD-bindingssteder) blev forudsagt i 5′-området (1 Kb) fra

CSNK2A1P

start codon, hvilket antyder, at

CSNK2A1P

gen kan potentielt være fremkaldt eller undertrykkes af flere master-regulatorer af udviklingsmæssige veje. Forstærkningen af ​​

CSNK2A1P

gen kunne resultere i overekspression af CSNK2A1P protein i kræftceller. Det kan også være muligt, at

CSNK2A1

gen eller anden måde er indirekte reguleret af ekspression af

CSNK2A1P

gen. Fremtidige undersøgelser er nødvendige for at afdække den mekanisme, gennem hvilken

CSNK2A1P

og

CSNK2A1

gener reguleres. Indtil nu har omkring 10.000 forarbejdet pseudogener [24] blevet karakteriseret i det humane genom, og nogle af disse gener er blevet rapporteret at blive udtrykt i cancerceller. For eksempel den onkogene

CRIPTO3

pseudogen udtrykkes i colon, bryst og lungekræft [25], den menneskelige homolog af vacciniavirus H1 phosphotase gen-klon 5 (

HVH-5 ​​

) pseudogen er udtrykt i brystkræft cellelinier [26], og den

Rac1

pseudogen udtrykkes i hjernetumorer [27]. Taget sammen med vores resultater, tyder dette en potentiel onkogen rolle de formodede pseudogener i nogle menneskelige kræftformer.

Denne undersøgelse havde nogle begrænsninger. Vi viste sammenhængen mellem

CSNK2A1P

gen og PML protein stabilitet i kun to lunge kræft cellelinier in vitro. Prøver fra kun 101 lungekræftpatienter blev analyseret, 56 som var heterozygote med hensyn til denne polymorfi og kan bruges til analysen. I fremtidige studier vil det være vigtigt at omfatte yderligere kræft cellelinjer og flere kræft væv.

Vores resultater giver genetiske beviser for aktivering af intronless CK2α gen i human cancer. Selv CK2 tidligere var kendt for at være en nøglespiller i kræft, blev dens mekanisme af aktivering i kræft ikke kendt [10], [28]. På grund af denne mangel på viden om mekanismen for CK2 aktivering og dets konstitutive aktivitet har CK2 blevet meste forsømt som en vigtig målsætning for anti-cancer medicin. Da der er gjort på de strukturelle grundlag for CK2 hæmning betydelige fremskridt, er det nu muligt at udvikle potente og selektive celle-gennemtrængelige CK2 hæmmere [29], [30]. Forstå forskellen i sekvenser af

CSNK2A1P

gen polymorfier kan tillade os at designe specifikke diagnostiske tests til human cancer. Vigtigere er det, vores resultater støtter den opfattelse, at protein kinase CK2α er en tiltalende mål for kræftmedicin såsom små molekyler hæmmere [10], [31].

Materialer og metoder

Cellelinjer

Den menneskelige cancer (Jakurt, H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052, Hela og H1650) og normal lunge (WI-38 og CCL-211) cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collections (Manassas, VA). H290 og MS-1 cellelinier blev opnået fra NIH (Frederick, MD). Celler blev dyrket i komplet vækstmedium (Dulbeccos modificerede Eagles medium for HeLa, A549 og CCL-211, Eagles Minimum Essential Medium for WI-38, Roswell Park Memorial Institute medium for H1299, A549, A427, H441, H1703, H322, H460, HCT116, H1975, H322, H358, H838, H28, H2052 og H1650) tilsat 10% føtalt bovint serum, 10 enheder /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin ved 37 ° C og 5% CO2.

vævsprøver

Friske tumorvæv og tilstødende normale væv blev opnået fra patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSLC), som blev undergår kirurgisk resektion af den primære tumor. Undersøgelsen blev godkendt af University of California, San Francisco, institutionelle Review Board (CHR # H8714-11647-14). Vi opnåede skrevet informeret samtykke fra alle deltagere, der er involveret i vores undersøgelse. Vævsprøver blev holdt ved -180 ° C flydende nitrogen frysere før brug, og sidste patologisk diagnose blev bekræftet af en patolog ved University of California, San Francisco (UCSF), USA. Normale voksne genomisk DNA formular perifert blod blev indkøbt fra BioChain (Hayward, CA).

Fluorescens-in situ-hybridisering

fluorescens-in situ-hybridisering (FISH) probe for CSNK2A1P (RP11-567I13 , kromosom 11p15.3) blev købt fra BacPac Resources (Oakland, CA). Den kromosom 11 centromer blev mærket ved Vysis CEP 11 SpectrumGreen ™ probe (Abbott Molecular, Abbott Park, IL). Metafase objektglas blev fremstillet under anvendelse af standard protokoller til UCSF Molekylær Patologi Core facilitet. Alle hybridiseringer blev udført af UCSF Molekylær Patologi Core facilitet. Den CSNK2A1P BAC probe blev mærket med Cy3 red af nick translation. Probe blanding blev fremstillet ifølge standardprotokollen

DNA og cDNA sekventeringsanalyse

Genomisk DNA eller total RNA blev isoleret fra cellelinjer og vævsprøver ved hjælp af DNeasy Blood Tissue Kit eller RNeasy Mini Kit (Qiagen Valencia, CA), hhv. Den CSNK2A1P genet blev PCR-amplificeret ved hjælp af sine genspecifikke primere. De fremadrettede og reverse primere anvendt til PCR og sekventering var: 5′-AGAAAATTGCTCCCCACTCC-3 ‘og 5′-GTGCTGCCAGAGAATGA CAA-3’ henholdsvis. PCR-produkterne blev geloprenset under anvendelse af QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen Valencia, CA) og blev efterfølgende sekventeret ved MCLab (South San Francisco, CA).

Semi-kvantitativ revers transkription-PCR (RT-PCR ) analyse

Totalt RNA fra cellelinier og væv blev isoleret under anvendelse af et ekstraktionskit, og DNA blev elimineret ved på-kolonne behandling med DNase (RNeasy Mini kit, Qiagen, Valencia, CA, USA). Semikvantitativ RT-PCR blev udført ved anvendelse af SuperScript One-step RT-PCR med Platinum Taq kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. Et-trins RT-PCR blev udført ved hjælp af par af CSNK2A1P-specifikke primere (Forward: 5′-AGAAAATTGCTCC CCACTCC-3 ‘og omvendt: 5′-GTGCTGCCAGAGA ATGACAA-3′), CSNK2A1-specifikke primere (Forward: 5’-TGGGGACAGAAGATTTATATGA -3 ‘og Reverse: 5′-CTGAAGAAATCCCTGACA TCAT-3′) og CSNK2B-specifikke primere (Forward: 5′-CAGGTCCCTCACTACCGACA -3 “og Reverse: 5’-CAGCTGGTAGGCCATCGGAT-3 ‘). PCR-produkterne blev verificeret ved direkte DNA-sekventering. Glyceraldehyd-3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) blev anvendt som en intern kontrol.