PLoS ONE: Tumor Mouse Model bekræfter MAGE-A3 Cancer Immunoterapeutisk som en effektiv inducer af langvarig antitumorale Responses

Abstrakt

Formål

MAGE-A3 er et potentielt mål for immunterapi på grund af sin tumor-specifikke karakter og udtryk i flere tumortyper. Kliniske data om MAGE-A3 immunterapi har rejst mange spørgsmål, der kun kan løses ved hjælp af dyremodeller. I den foreliggende undersøgelse blev forskellige aspekter af de murine anti-tumor immunrespons induceret af et rekombinant MAGE-A3-protein (recMAGE-A3) i kombination med forskellige immunstimulanter (AS01, AS02, CpG7909 eller AS15) undersøgt.

eksperimentel design og resultater

Baseret på cytokin profil analyser og beskyttelse mod udfordring med MAGE-A3-tumor, blev kombinationen recMAGE-A3 + AS15 udvalgt til yderligere eksperimentelt arbejde, især for at undersøge mekanismerne for anti -tumor svar. Ved at bruge MHC klasse I-, MHC klasse II, perforin-, B-celle- og IFN-y- knock-out mus og CD4

+ T celle-, CD8

+ T celle- og NK celle- udtømte mus, demonstrerede vi, at CD4

+ T-celler og NK-celler er de vigtigste anti-tumor effektorer, og at IFN-γ er en stor effektormolekyle. Denne mus tumor model også etableret behovet for at gentage recMAGE-A3 + AS15 indsprøjtninger til at opretholde effektive anti-tumor responser. Desuden vores resultater viste, at effekten af ​​tumor afvisning af de fremkaldte anti-MAGE-A3 reaktioner afhænger af andelen af ​​tumorceller, der udtrykker MAGE-A3.

Konklusioner

recMAGE-A3 + AS15 cancerimmunterapi effektivt inducerede en antigenspecifik, funktionelle og langvarig immunrespons stand til at genkende og eliminere MAGE-A3-udtrykkende tumorceller op til flere måneder efter den sidste immunisering i mus. Dataene fremhævede betydningen af ​​den immunstimulerende middel til at fremkalde en Th1-typen immunrespons, såvel som den centrale rolle, som IFN-γ spillet, CD4

+ T-celler og NK-celler i antitumorale effekt.

Henvisning: Gérard C, Baudson N, Ory T, Louahed J (2014) Tumor Mouse Model bekræfter MAGE-A3 Cancer Immunoterapeutisk som en effektiv inducer af langtidsholdbar antitumorale Responses. PLoS ONE 9 (5): e94883. doi: 10,1371 /journal.pone.0094883

Redaktør: Ramon Arens, Leiden University Medical Center, Holland

Modtaget: Januar 21, 2014 Accepteret: Marts 20, 2014; Udgivet: 15. maj 2014

Copyright: © 2014 Gérard et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. GlaxoSmithKline Biologicals SA var den finansieringskilde og var involveret i alle faser af undersøgelsen adfærd og analyse. GlaxoSmithKline Biologicals SA finansieret også alle omkostninger forbundet med udvikling og udgivelse af det nuværende manuskript. JL var involveret i tilsynet undersøgelse i alle faser. Alle forfattere var involveret i studiedesign, gennemgang af undersøgelsesrapporter, dataanalyse og fortolkning. NB og TO udførte undersøgelsen og var involveret i generering af data. Alle forfattere var involveret i udarbejdelsen og godkendelsen af ​​manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Jeg har læst tidsskriftets politik og har følgende konflikter: CG, NB, TO, JL er medarbejdere i GlaxoSmithKline Vaccines. CG og JL erklærer bestand ejerskab i GlaxoSmithKline-koncernen. CG og JL er også opfinder om patenter ejet af GlaxoSmithKline-koncernen (WO /2013 /096.430). Dette ændrer ikke vores tilslutning til PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lige siden William Coley bemærkninger i det 19. århundrede, at kræft kan behandles ved at mobilisere patientens eget immunforsvar , det ultimative mål for kræft immunologer har været at reproducerbart opnå dette hos patienter. De muterede afvigende proteiner, re-aktiverede eller over-udtrykkes i tumorceller, repræsenterer potentielle “tumorantigener”, der kan målrettes af immunsystemet [1] – [3].

Afvigende gen promoter demethylering er en vigtig mekanisme, ved hvilken ekspressionen af ​​normalt tavse gener genaktiveres i tumorceller. Dette er tilfældet for

MAGEA

familie af gener, der normalt udtrykkes under embryonisk liv [4] og i placenta [5], [6], men er tavse i normale voksne væv, undtagen i kimcellelinje celler i testiklerne [5].

MAGE-A3, et medlem af denne MAGE-a-familien, er en attraktiv tumorantigen, som i) den er næsten udelukkende udtrykkes i tumorer, hvilket eliminerer risikoen for montering af en aktiv immunrespons mod normalt væv (kimceller testiklerne er de eneste normale celler, der udtrykker MAGE-A3, men de mangler klassiske HLA klasse i-II-molekyler og derfor ikke har nogen antigen præsentation kapaciteter, som udelukker udviklingen af ​​immunrelaterede toksicitet ved MAGE-A3 immunterapi), ii) det udtrykkes i mange forskellige typer cancer, og iii) det er naturligt immunogent, da CD8

+ T-lymfocytter specifikke for MAGE-A3 viste sig at infiltrere tumor sites i melanomapatienter [ ,,,0],. 7]

Kliniske data genereret i det sidste årti under anvendelse af forskellige immunoterapeutiske fremgangsmåder viste, at levere MAGE-A3 som en oprenset rekombinant protein formuleret med et immunstimulerende middel kan være en lovende fremgangsmåde [8] – [11]. Ikke desto mindre trods opmuntrende resultater, forbliver mange spørgsmål, der skal løses for yderligere at forbedre MAGE-A3-specifik immunterapi. Især forbedrer MAGE-A3-immunostimulerende kombination til at inducere langvarige anti-tumor immunrespons fortsat afgørende. Desuden er de præcise mekanismer og vigtige immuneffektorer fører til tumorafstødning ikke kendt, og ingen klar immune korrelat for klinisk effektivitet er endnu ikke fastlagt. Det er heller ikke kendt i hvilket omfang den fokale mønster af MAGE-A3-ekspression i en tumor kan begrænse den kliniske effekt. Sådanne spørgsmål og hypoteser ikke med rimelighed kan behandles i kliniske forsøg, på grund af den lange varighed og begrænset antal patienter. Derfor forbliver afgørende for at vejlede den kliniske udvikling af MAGE-A3-specifik immunterapi prækliniske studier.

Vi rettet nogle af disse spørgsmål i den foreliggende undersøgelse. I en første række eksperimenter blev mus immuniseret med rekombinant MAGE-A3 (recMAGE-A3) formuleret med forskellige immunstimulerende: AS01, AS02, AS15 eller CpG7909. AS15 blev valgt på dette panel til yderligere undersøgelse på grund af dets evne til at drive immunsystemet mod en immunrespons af Th1-typen, og den resulterende anti-tumor aktivitet mod MAGE-A3-udtrykkende tumorceller. Mus blev derfor immuniseret med den valgte recMAGE-A3 + AS15 formulering i en anden række forsøg for at evaluere i) de centrale effektorer involveret i anti-tumor aktivitet, ii) indflydelse af booster-injektioner og iii) virkningerne af tumor heterogenitet -i.e. andelen af ​​tumorceller, der udtrykker MAGE-A3 på denne antitumoraktivitet.

Materialer og metoder Salg

etiske retningslinjer

Eksperimenter blev udført i GlaxoSmithKline Vaccines laboratorier eller af GlaxoSmithKline personale på Armand Frappier Institute (IAF – Canada). Dyreforsøg omtalt i dette manuskript blev etisk revideret og godkendt af GlaxoSmithKline Vacciner ‘belgiske etisk komité for dyreforsøg eller af den etiske komité i IAF. De blev udført i overensstemmelse med EU direktiv 2010/63 /EU, de CCAC standarder (canadisk råd for Animal Care), og GlaxoSmithKline Vacciner politik på Care, velfærd og behandling af dyr. Både GlaxoSmithKline Vaccine facilitet og IAF er AAALAC (Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care) akkrediteret. blev gjort alt for at minimere lidelse: tumorer overstiger en maksimalt tilladte størrelse på 17 mm × 17 mm, ulceration, tumor nekrose, kramper, sygelighed og kredser adfærd var betingelser om eutanasi ved intraperitoneal injektion med barbitursyre derivat (overdosis)

Antigen Beskrivelse, Produktion og oprensning

fusionsproteinet ProtD-MAGE-A3-His, også forkortet recMAGE-A3, indeholder de første 127 rester af protein D afledt af

Haemophilus influenzae

på N-terminus for at forbedre proteinekspression i et bakterielt system, og en sekvens af histidinrester ved sin C-terminus for at lette fusionsproteinet oprensning.

produktionen af ​​recMAGE-A3 blev udført i

Escherichia coli

stammen AR58, som tidligere beskrevet [11]. Andet rekombinant MAGE-A3-protein, som består af de første 314 aminosyrer af MAGE-A3 efterfulgt af 6 histidinrester, blev produceret i baculovirus [11]. Dette protein, benævnt bacMAGE-A3, blev anvendt i overvågningen af ​​de immunreaktioner.

Beskrivelse af immunstimulerende

AS02 består af en olie-i-vand-emulsion indeholdende 3-

O

-desacyl-4′-monophosphoryllipid a (MPL, GlaxoSmithKline Vaccines, Rixensart, Belgien), en Toll-lignende receptor (TLR) -4 agonist, og QS-21 (

Quillaja saponaria

Molina fraktion 21, Antigenics Inc, et helejet datterselskab af Agenus Inc., Lexington, MA, USA), som er et molekyle af saponin familien [12]. AS01 er en adjuvanssystem indeholdende MPL, QS-21 og liposom. AS15 indeholder MPL, QS-21, liposom, og TLR-9 ligand CpG7909 (syntetiske oligodeoxyribonukleotider [ODN’er] indeholder umethylerede CpG-motiver, i det følgende benævnt CPG).

musestammer og vaccinationer

C57BL /6 eller CB6F1 (hybrid mellem C57BL /6 og BALB /c) hunmus (6-8 uger gamle) blev købt fra Harlan (Horst, Holland) og holdes i specifikke patogenfrie betingelser.

mus var normalt injiceres 2 eller 4 gange intramuskulært på to ugers intervaller med 1 eller 10 ug recMAGE-A3 i 50 ul immunstimulerende.

at studere langsigtet beskyttelse, mus modtog 2 injektioner af enten recMAGE-A3 + AS15 eller phosphatpufret opløsning (PBS) ved 2-ugers intervaller. Otte uger efter den anden immunisering blev dyrene udfordret med en TC1-MAGE-A3 tumor (se beskrivelse af tumorcellerne nedenfor;

tumormodeller og udfordringer

). På dag 150, 80 dage efter tumor udfordring, tumor-fri dyr fra recMAGE-A3 + AS15 gruppe blev randomiseret og fordelt i to grupper. Én gruppe fik fire booster-injektioner af recMAGE-A3 + AS15 på en 4-ugers interval, og den anden gruppe modtog injektioner af PBS efter samme tidsplan. Tredive dage efter den sidste injektion, mus undergik en tumorbelastning i samme flanke, og tumorvækst blev overvåget under 46 dage (op til dag 319). Derudover blev tumorceller injiceret i en gruppe på ti PBS-immuniserede mus, som en positiv kontrol for tumorvækst.

For at vurdere rollen af ​​IFN-γ, perforin og MHC klasse I eller II molekyler i tumorbeskyttelse følgende MAGE-A3 immunterapi blev immunsvækkede mus anvendes med de samme vaccinationsprogrammer som beskrevet ovenfor. De følgende stammer blev købt fra Jackson Institute: IFNy-slået ud (KO) mus (B6.129S7-Ifngtm1Ts /J), MHC klasse I-KO (B6.129P2-b2mtm1Unc), MHC klasse II-KO (B6.129S2 H2-dIAb1-Ea00451), B-celle-KO (B6.129S2.IgHmTm1Cgn) og perforin-KO mus (C57BL /6-PRF1 tm1Sdz /J).

for at vurdere den potentielle rolle af T-celler, recMAGE-A3-immuniserede C57BL /6-mus depleteret for CD4

+ eller CD8

+ T-celler ved injektion af 0,5 mg rotte-anti-muse-antistoffer (GK1.5 [TIB-207 fra ATCC] og 2,43 [TIB- 210 fra ATCC], henholdsvis) en uge før tumorbelastning og derefter ugentligt i løbet af forsøget. NK-celle depletion blev opnået ved injektion af anti-asialo GM1 antistof (Cedarlane) to gange om ugen startende på dag 49 (dvs. 7 dage før tumorprovokation) og indtil afslutningen af ​​forsøget (0,1 ml pr injektion). Udtynding blev verificeret ved flowcytometri (data ikke vist). Kontrol- antistoffer med lignende isotyper til depletterende antistoffer blev anvendt som negative kontroller.

tumormodeller og udfordringer Salg

TC1-MAGE-A3 celler er murine tumorceller er genetisk modificeret til at udtrykke humant MAGE-A3. TC1 tumorceller (opnået fra Dr. T. Wu, John Hopkins University) er interessante, da de rekapitulere de forskellige trin, der fører til en tumorigen cellelinie. Oprindeligt blev TC1 tumor cellelinje genereret fra C57BL /6 primær lunge epitelceller udødeliggjort af transfektion af

HPV-16 E6

e7

gener, og transformeret med en aktiveret

Ras

onkogen [13]. Disse celler blev transficeret med en pcDNA3 plasmid, der indeholder

MAGEA3

cDNA og

zeocin

selektionsgenet. Kloner er resistente over for zeocin behandling blev testet for

MAGEA3

ekspression med RT-PCR og til MHC klasse I-ekspression ved flowcytometri (data ikke vist). Den bedste klon viser reproducerbar tumorgenicitet i mus blev valgt.

For hver udfordring, dyrene fik en subkutan injektion af 2 × 10

6 TC1-MAGE-A3-celler (200 gi i flanken). Individuel tumorvækst blev registreret to gange om ugen ved måling af produktet af de 2 vigtigste diametre af tumoren under overvågningsfasen, begyndende 7 dage efter dagen for udfordringen. Mus blev aflivet under forsøget, når tumorstørrelsen nåede 289 mm

2. I så fald værdien af ​​den sidste måling opnåede før aflivning blev fremført til det næste tidspunkt (er).

For at afgøre om der er behov en tærskel procentdel af MAGE-A3-udtrykkende tumorceller til fremkaldelse tumorafstødning af immunsystemet, blev PBS-skin-immuniserede mus og mus immuniseret med recMAGE-A3 + AS15 udfordret med TC1 parentale celler (100% MAGE-A3-negative celler), TC1-MAGE-A3-celler (100% MAGE- A3 udtrykkende celler), eller forskellige forhold af TC1 /TC1-MAGE-A3:. dvs 10/90, 50/50 eller 90/10% henholdsvis

cytokinproduktion

Isolerede musesplenocytter blev dyrket i nærvær af 1 ug /ml bacMAGE-A3. Efter 72 timers forløb er koncentrationerne af IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ og TNF-α i supernatanterne blev målt ved cytometrisk bead array (CBA, Pharmingen cat n ° 551.287), ifølge producentens instruktioner .

Intracellulær Cytokine Farvning og flowcytometri

perifert blod mononukleære celler isoleret fra immuniserede dyr blev stimuleret

in vitro

i 96-runde bund brønde med enten medium (ingen stimulation ) eller en pulje af halvtreds-syv 15 mer peptider overlapper med 10 aminosyrer, der dækker hele sekvensen af ​​MAGE-A3 (1 ug /ml for hvert peptid), i et endeligt volumen på 200 pi RPMI, 5% føtalt kalveserum (FCS) indeholdende kanin-anti-muse-anti-CD49d og anti-CD28 antistoffer (Becton Dickinson, BD nr 553.154 og n ° 553.295 henholdsvis; slutkoncentration: 1 ug /ml hver). Efter 2 timers inkubation ved 37 ° C blev sekretionen af ​​cytokiner blokeret ved tilsætning af 50 pi Brefeldin (Golgi Plug, BD n ° 555.029: 1/1000 i RPMI 5% FCS). Celler blev overført til en 96-konisk bund brønds plade, centrifugeret og vasket med 250 pi PBS indeholdende 1% FCS (FACS buffer). Cellepellets blev inkuberet i 10 minutter ved 4 ° C i nærvær af rotte-anti-muse CD16 /CD32 (2.4G2, BD n ° 553.142; 0,5 mg /ml) for at blokere Fcy-receptorer. CD4

+ og CD8

+ T-celler blev farvet i 30 minutter ved 4 ° C ved tilsætning af 50 pi phycoerythrin-mærket rotte-anti-muse CD4 monoklonalt antistof (BD n ° 556.616) eller peridinin chlorophyl protein-mærket rotte-anti -mouse CD8 monoklonalt antistof (BD n ° 553.036). Efter et vasketrin blev cellerne fikseret i 200 pi Cytofix-cytoPerm opløsning (BD n ° 554.722) i 20 minutter ved 4 ° C og permeabiliseret ved tilsætning permWASH opløsning (BD n ° 554.723). Efter centrifugering blev celler inkuberet i 2 timer ved 4 ° C med 50 pi af en blanding af allophycocyanin-mærket anti-IFN-γ (BD n ° 554.413). Celler blev vasket, centrifugeret og resuspenderet i FACS buffer inden flowcytometrianalyse (LSR2 fra BD). Gating blev udført på T-celler, og i alt ca. 20.000 CD4

+ T-celler blev erhvervet. Dataene blev udtrykt i procent af MAGE-A3-specifikke IFN-γ-producerende CD4

+ eller CD8

+ T-celler blandt den samlede befolkning i CD4

+ eller CD8

+ T-celler, henholdsvis efter fradrag af kontrol medium værdi.

statistiske analyser

Cytokin analyser blev udført ved hjælp af en ANOVA med gruppe som faktor efter log-transformation af dataene. For andre analyser, den statistiske model var en gentagen ANOVA med gruppe, tid og gruppe-for-time interaktion som faktorer; korrelationen mellem to målinger fra den samme mus antages at være autoregressive, dvs. korrelationer falde eksponentielt med tiden. Afvigelser blev antaget at være anderledes på tværs grupper, men identiske på tværs tidspunkter. Sammenligninger af de gennemsnitlige tumor størrelser blev foretaget ved sidste tidspunkt.

Resultater

Immune og Anti-tumor respons i mus immuniseret med recMAGE-A3 Kombineret med forskellige immunstimulerende

efter fire immuniseringer af C57BL /6 mus med recMAGE-A3, alene eller formuleret med et immunstimulerende middel (AS01, AS02, CpG eller AS15), blev både humorale og cellulære immunreaktioner vurderes. Antistofreaktionen var lav efter immunisering med recMAGE-A3 alene, sammenlignet med immunisering med recMAGE-A3 formuleret med et immunstimulerende middel (fig S1). De humorale reaktioner induceret af recMAGE-A3 formuleret med forskellige immunstimulerende blev anset ækvivalent, uanset immunostimulanten. Ligeledes blev der ikke observeret store forskelle mellem de immunstimulerende i deres evne til at fremkalde T-celle responser som vurderet af lymfo-spredning eksperimenter (figur S2).

I modsætning hertil blev der observeret, når relevante forskelle mellem de immunstimulerende

in vitro

cytokinproduktion af splenocytter isoleret fra immuniserede dyr blev målt ved CBA i kultursupernatanterne (figur 1). Trods den lave antal mus (n = 2 eller 3) i hver gruppe, viste vores resultater, at AS15 inducerer en klar bias mod en Th1-profil, kendetegnet ved højere IFN-y /IL-5 og TNF-a /IL-5-forhold , forholdsvis til AS01, AS02 og CpG. Denne observation blev forbundet med en højere produktion af IL-2 induceret af AS15 forholdsvis til de andre immunstimulerende.

Musene blev immuniseret på dag 0, 14, 28 og 42 med recMAGE-A3 (10 ug antigen) alene eller recMAGE-A3 formuleret med forskellige immunstimulerende, og re-stimuleret

in vitro

af bacMAGE-A3. Cytokinproduktion blev målt ved cytometrisk bead array (CBA) efter 72 h dyrkning. Hver prik repræsenterer en mus, og barer er geomeans. N, ikke gjort.

Efter 4 immuniseringer med PBS eller recMAGE-A3 formuleret med forskellige immunstimulerende blev musene udfordret subkutant med TC1-MAGE-A3 tumorceller og

in vivo

tumorvækst blev fulgt i 4 uger. I mus behandlet med PBS, blev en progressiv vækst af tumorerne ses (figur 2). Forskellige udfald blev observeret for de mus immuniseret med recMAGE-A3, afhængigt af den tilknyttede immunostimulant. Mus blev ikke beskyttet mod tumorvækst når AS02 blev anvendt og blev dårligt beskyttet med AS01 eller CpG. Imidlertid blev tumorvækst kontrolleret i mus immuniseret med recMAGE-A3 + AS15. Ikke kun var tumorstørrelsen reduceret i denne gruppe, men 3/5 mus var tumor-fri, når tumorer blev vurderet fire uger efter tumorbelastning.

mus (n = 5) blev immuniseret med recMAGE-A3 ( 10 ug antigen) formuleret med forskellige immunstimulerende og udfordret med TC1-MAGE-A3-celler. På dag 84, er standardfejl af middelværdien vist, og antallet af mus resterende tumor-fri er indiceret til hver gruppe. På dag 84 blev recMAGE-A3 + AS15 gruppe fundet forskellig fra enhver anden gruppe (p 0,01). Også tumor vækst blev reduceret i recMAGE-A3 + AS15 gruppe, sammenlignet med de andre grupper (p 0,01).

Det særlige ved dette anti-tumor respons blev etableret ved at vise, at mus immuniseret med recMAGE + AS15 var ikke i stand til at udrydde TC1 celler transficeret med et irrelevant antigen (TC1-HER2 /neu) injiceret i de samme vilkår som de TC1-MAGE-A3-celler (data ikke vist). Vi bemærkede også, at AS15 skulle være til stede i hver injektion til effektivt at stimulere anti-MAGE-A3 immunitet (data ikke vist).

Baseret på det samlede sæt af data, der sammenligner de forskellige immunstimulerende valgte vi AS15 for alle efterfølgende eksperimenter med recMAGE-A3, som det inducerede en Th1-biased immunreaktion og var den mest effektive mod vækst af MAGE-A3-udtrykkende tumorceller.

Immunisering med recMAGE-A3 + AS15 fremkalder Langsigtet beskyttelse

et vigtigt aspekt i genereringen af ​​et immunrespons anti-tumor er induktionen af ​​langsigtet immune hukommelse, der er stand til at tilvejebringe langvarig beskyttelse mod tumor tilbagefald. I indledende eksperimenter i mus, observerede vi, at øge antallet af recMAGE-A3 + AS15 injektioner var nødvendig for bedre at beskytte mus mod tumorbelastning, hvilket antyder, at opretholdelse af immunresponset ved gentagne injektioner kan være behov for forbedret effektivitet (data ikke vist) .

Vi har oprettet et eksperiment for at vurdere, om immunisering med recMAGE-A3 + AS15 var i stand til at fremkalde sådanne langsigtede immune hukommelse og om boostere var nødvendigt (figur 3A). Til dette formål blev mus immuniseret på dag 0 og 14 med enten PBS eller recMAGE-A3 + AS15. Immunisering med recMAGE-A3 + AS15 induceret IFN-γ-producerende antigen-specifikke CD4

+ og CD8

+ T-celler (figur 4). Efter udfordringen med TC1-MAGE-A3 tumorceller, alle PBS-immuniserede mus udviklede en tumor og blev aflivet, mens 52 ud af 60 recMAGE-A3 + AS15-immuniserede mus afviste tumoren og forblev tumor-fri i mindst to måneder ( figur 3A).

A. Undersøgelse design og stikprøvestørrelse (CB6F1 mus) på de forskellige trin er vist. Immuniseringer blev foretaget med 1 ug af antigen. B. Efter den anden tumorbelastning, blev tumorvækst fulgt i 46 dage. Ved slutningen af ​​forsøget (dag 319), standardfejl af middelværdien er vist, og antallet af tumor-fri mus er indiceret til hver gruppe.

CB6F1 mus blev behandlet som vist i figur 3A . Kort fortalt blev mus tumor-udfordret efter to immuniseringer med recMAGE-A3 + AS15 eller PBS (Kontrol 1). Mus af MAGE-A3 + AS15 gruppe resterende tumor-fri modtaget enten PBS boostere eller recMAGE-A3 + AS15 boostere. En ny kontrolgruppe modtog PBS (Kontrol 2). Blodprøver blev udtaget på dag 21 (7 dage efter den anden immunisering) og på dag 166 (7 dage efter den første booster-injektion). Blodprøver blev samlet og mængderne af MAGE-A3-specifikke IFN γ-producerende CD4

+ og CD8

+ T-celler blev bestemt ved intracellulær farvning og flowcytometri. Data er udtrykt som procent af den samlede CD4

+ og total CD8

+ T-celler efter fradrag af kontrol medium værdier, som tegnede sig for ca. 0,02% ved måling CD4

+ T-celler og 0,1% ved måling CD8

+ T-celler, henholdsvis; hver prik er en pulje af 3 prøver på dag 21, og hver prik er en pulje af 5 prøver på dag 166. *** = p. 0,001

På dette stadium, 50 i 52 tumor -fri mus blev tilfældigt tildelt to grupper. Én gruppe modtog PBS og den anden gruppe recMAGE-A3 + AS15. Immunresponser blev bedømt på dag 166, 7 dage efter den første booster. I gruppen, der har modtaget en PBS booster, CD4

+ og CD8

+ T-celle responser på dag 166 (5 måneder efter de første to immuniseringer med recMAGE-A3 + AS15) var lavere end reaktionerne på dag 21 (en uge efter de første to immuniseringer med recMAGE-A3 + AS15) (figur 4). Dette illustrerer faldet i immunresponser over tid. I modsætning hertil en enkelt recMAGE-A3 + AS15 booster injektion var tilstrækkelig til at øge indholdet af cytokin-producerende CD4

+ T-celler op til mindst de niveauer, der måles på dag 21. Derudover niveauerne af CD8

+ T-celler blev forøget op til 5 gange sammenlignet med niveauerne målt en uge efter de første to immuniseringer (figur 4) og MAGE-A3-specifikke CD8

+ T-celler, der producerer IFN-γ repræsenteret op til 20% af CD8

+ T-celle pool.

Efter fire månedlige boostere, de 50 mus tumor-udfordret. På dette trin blev en tredje gruppe på 10 mus, der modtager kun PBS, indført som kontrol for tumorvækst. Nr IFN-γ-producerende antigen-specifikke CD4

+ og CD8

+ T-celler blev påvist i denne kontrolgruppe.

I gruppen, der modtog boostere PBS, kun lave niveauer af IFN- γ-producerende antigen-specifikke CD4

+ T-celler blev observeret (residual fra de første to MAGE-A3 + AS15 injektioner givet 9 måneder tidligere). Men 19 af disse 25 mus forblev tumor-fri efter den udfordring, hvilket indikerer, at en langsigtet immune hukommelse var blevet rejst, og at mus var stadig beskyttet næsten et år efter den sidste immunisering. I gruppen af ​​mus boostet månedligt med recMAGE-A3 + AS15 alle 25 mus forblev tumor-fri (figur 3B). Disse data antyder, at der var en fordel ved at give booster-injektioner med recMAGE-A3 + AS15, selv hvis en immunreaktion langvarig og effektiv blev induceret ved den første immunisering.

I en efterfølgende langvarig eksperiment, vi konstateret, at AS15 var nødvendig i hvert booster til optimalt beskytte dyrene mod tumorvækst (data ikke vist)

CD4

+ T-celler, NK-celler, IFN-γ og MHC klasse II er Cell. subpopulationer og Molekylær Effekt involveret i recMAGE-A3 + AS15-induceret tumor beskyttelse

i et forsøg på at identificere de celler eller effektor mekanismer, der kan være ansvarlig for beskyttelse mod tumoren, blev en række eksperimenter udført i mus enten KO eller udtømt for specifikke celletyper. De forskellige grupper af deficiente mus fik to eller fire immuniseringer af recMAGE-A3 + AS15 på en to ugers interval før de blev udfordret med TC1-MAGE-A3-celler. Som vist i figur 5, forblev B celle-KO, MHC klasse I-KO og perforin-KO-mus beskyttet af recMAGE-A3 + AS15 immuniseringer. I modsætning hertil blev tumorbeskyttelse påvirket i NK og CD4

+ T-celle-depleterede mus, og i IFN-γ-KO og MHC klasse II-KO-mus. Disse resultater identificerede CD4

+ T-celler og NK-celler som centrale cellepopulationer i tumorafstødning mekanisme. IFN-γ blev også identificeret som en kritisk molekylær effektor. Selv om den nøjagtige kilde til IFN-γ ikke er kendt, er det yderligere understreger vigtigheden af ​​at inducere et Th1-forspændt anti-tumor immunrespons.

celledepletering eksperimenter, kontrol isoptypes (Ig) i lighed med den anvendte antistof at depletere T-celle eller NK-celler blev anvendt. Antallet af dyr pr gruppe er angivet i hver graf titel. Den røde pil angiver tidspunkt for tumor udfordring. På sidstnævnte tidspunkt, er standardfejl af middelværdien vist, og antallet af tumor-fri mus er indiceret til hver gruppe. Den gennemsnitlige tumorstørrelse i hver gruppe blev statistisk sammenlignet med den for recMAGE-A3 + AS15 gruppe på det sidste tidspunkt (* = p 0,01; ** = p 0,001; NS = ikke signifikant).

tumorvæksthæmning Afhænger af Andel af MAGE-A3-udtrykkende celler i tumor

Angivelse af MAGE-antigener er ikke nødvendigvis ensartet i en tumor, som viser fokal farvning i immunhistokemi [14], sandsynligvis fordi ikke alle celler udtrykker MAGE-A3 samtidig og på samme niveau. Som forventes dette fænomen at have en indvirkning på effektiviteten af ​​recMAGE-A3 + AS15 immunisering vi vurderet om recMAGE-A3 + AS15 kunne beskytte mus mod en tumor, der ikke består af 100% MAGE-A3-udtrykkende celler.

Efter immunisering med PBS eller recMAGE-A3 + AS15 blev mus udfordret med forskellige forhold af TC1 parentale tumorer og TC1-MAGE-A3-udtrykkende celler (0-10-50-90 og 100%) (figur 6). Resultaterne viste, at alle tumor blandinger voksede jævnt i mus skin-immuniseret med PBS. Ligeledes blev væksten af ​​en MAGE-A3-negative tumor ikke påvirket af recMAGE-A3 + AS15 immunisering. I modsætning hertil recMAGE-A3 + AS15 immunisering beskyttet mod tumorvækst i de 25 dage efter tumorbelastning, selv når kun 10% af de TC1 celler udtrykte MAGE-A3. Det samme gælder, når 50% af cellerne, og derefter, udtrykt MAGE-A3. Men mens alle mus udfordret med 100% MAGE-A3-udtrykkende celler forblev tumor-fri op til 57 dage efter challenge blev tilbagefald observeret i musene udfordret med tumorer, der indeholdt MAGE-A3-negative celler. Intensiteten af ​​fænomenet var afhængig procentdelen af ​​MAGE-A3-negative celler i udfordrende tumor. I gruppen udfordret med 90% MAGE-A3-udtrykkende celler, viste 2/9 mus et tilbagefald. Den gennemsnitlige tumorstørrelse i denne gruppe var ikke statistisk forskellig fra den gruppe, der fik 100% MAGE-A3-udtrykkende TC1-celler. I modsætning hertil i gruppen udfordret med 50% af MAGE-A3-udtrykkende celler, havde 6/9 mus recidiverende på dag 112, og i den gruppe udfordret med 10% af MAGE-A3-udtrykkende celler blev tilbagefald observeret i 7 /9 mus på dag 112. den gennemsnitlige tumorstørrelse i disse grupper var statistisk forskellig fra den gruppe, der fik 100% af MAGE-A3-udtrykkende TC1-celler, med den højeste gennemsnitlig tumorstørrelse blandt alle tilbagefald dyr observeret i mus udfordret med 10% MAGE-A3-udtrykkende celler.

mus immuniseret med recMAGE-A3 + AS15 (1 ug antigen) blev fulgt op til dag 112. på dag 77 og 112, er standardfejl af middelværdien vist og antal tumor-fri mus er indiceret til hver gruppe. Statistiske sammenligninger af den gennemsnitlige tumorstørrelse i hver gruppe med at TC1-MAGE-A3 (100%) på dag 77 og 112 er vist (* = p 0,01; ** = p 0,001; NS = ikke signifikant). Rød pil:. Dag udfordring

Diskussion

I den foreliggende undersøgelse, vi vurderet potentialet i recMAGE-A3 formuleret med forskellige immunstimulerende. Både de inducerede immunresponser og deres evne til at hæmme tumorvækst blev analyseret. For de funktionelle eksperimenter blev anti-tumor potentiale MAGE-A3 immuniseringer evalueret i en profylaktisk indstilling med ikke-tumorbærende mus frem for en terapeutisk indstilling for mere nøje efterligner den kliniske situation af adjuvans behandling til kræftpatienter. Ja, i adjuverende patienterne først blive opereret, og betragtes som fri for tumor, når de modtager vaccinationsprogram. Selvom musemodeller muligvis ikke helt afspejler den menneskelige situation, dels som følge af iboende forskelle mellem de to immunsystemer [15], og fordi mus ikke er blevet spædet ved en primær tumor, injektion af TC1-MAGE-A3-celler blev valgt som en tumormodel at karakterisere effekten af ​​de immunreaktioner, der er blevet fremkaldt af recMAGE-A3-baserede immunisering. Med denne model kan de forskellige immunstimulerende evalueres og mindst en del af mekanismerne i tumorafstødning kunne opklaret.

Vores første og reproducerbar observation var, at injektionen af ​​recMAGE-A3 alene ikke inducere beskyttende immunresponser , recMAGE-A3 er svagt immunogent i sig selv.