PLoS ONE: Funktionel DNA Repair underskrift cancercellelinjer Udsat til et sæt af cytotoksiske Anticancer Drugs Ved hjælp af en Multiplexed Enzymatisk Reparation analysen på Biochip

Abstrakt

Udviklingen af ​​resistens til konventionelle anticancermedicin kompromitterer effekten af ​​kræft behandlinger. I tilfælde af DNA-targeting kemoterapeutiske midler, kan cancerceller viser tolerance over for narkotika-induceret DNA-læsioner og /eller forstærket DNA-reparation. Men har endnu ikke er defineret, hvilken rolle DNA-skade respons (DDR) og DNA-reparation i denne kemoresistens. At give indsigt i dette udfordrende område, vi analyserede DNA-reparation underskrift 7 cancer cellelinjer behandlet med 5 cytotoksiske lægemidler ved hjælp af en nyudviklet multiplex funktionelle DNA-reparation assay. Denne omfattende tilgang overvejet kompleksiteten og redundans af de forskellige DNA reparation veje. Dataene blev analyseret ved anvendelse clustering metoder og statistiske tests. Denne DNA-reparation profilering metode defineret relevante grupper baseret på ligheder mellem forskellige lægemidler, hvilket giver oplysninger om deres dominerende virkningsmekanisme på DNA-niveau. Tilsvarende ligheder mellem forskellige cellelinier formentlig identificeret identiske funktionelle DDR trods en stor genetisk heterogenitet mellem cellelinier. Vores strategi har kastet nyt lys over det bidrag af specifikke reparation sub-veje til lægemiddel-induceret cytotoksicitet. Selvom yderligere molekylære karakteriseringer er nødvendige for fuldt ud at optrævle mekanismerne bag vores resultater, vores tilgang viste sig at være meget lovende at afhøre kompleksiteten af ​​DNA-reparation respons. Faktisk kunne det bruges til at forudsige effekten af ​​et givent lægemiddel og kemosensitivitet enkelte patienter, og dermed vælge den rigtige behandling for individualiseret kræftbehandling

Henvisning:. Forestier A, Sarrazy F, Caillat S, Vandenbrouck Y, Sauvaigo S (2012) Funktionel DNA Repair underskrift cancercellelinjer Udsat til et sæt af cytotoksiske Anticancer Drugs Ved hjælp af en Multiplexed Enzymatisk Reparation analysen på Biochip. PLoS ONE 7 (12): e51754. doi: 10,1371 /journal.pone.0051754

Redaktør: Abdelilah Aboussekhra, King Faisal Specialist Hospital Research Center, Saudi-Arabien

Modtaget: Juli 24, 2012; Accepteret: 5. november 2012; Udgivet: December 31, 2012

Copyright: © 2012 Forestier et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne takke tværgående CEA program teknologier til Sundhed for støtte samt GRAVIT for dets finansielle akkompagnement. Dette arbejde blev også delvist støttet af Europa-Kommissionen (Contract LSHB-CT-2006 til 037.575) – projekt “Comet assay og celle array til hurtig og effektiv genotoksicitetsundersøgelser« (COMICS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af aktiv forskning og udvikling af målspecifikke behandlingsformer, modstandsdygtighed over for standard cytotoksiske lægemidler udgør fortsat en udfordring i kræftbehandling. Mange konventionelle anticancerlægemidler såsom alkyleringsmidler, antimetaboliter og topoisomeraseinhibitorer inducerer DNA-læsioner som en del af deres cytotoksiske virkning. En vigtig faktor, der påvirker den cytotoksiske virkning af disse lægemidler er evnen af ​​tumorceller til at føle en lang række DNA-læsioner og fremkalde en koordineret reaktion herunder aktivering af transkription, cellecyklusstop, apoptose og DNA-reparationsprocesser [1], [2] . Denne globale DNA-skade respons (DDR) kan føre til tolerance over for narkotika-induceret DNA-læsioner eller til øget reparation [3], [4], forhindrer en ideel resultat for patienter efter kemoterapi. Den kritiske betydning af DDR fremgår af eksistensen af ​​mutationer i p53, K-RAS, PIK3CA veje forbundet med resistens over for behandling [5], [6]. DNA reparationsmekanismer er et centralt element i DDR, der repræsenterer et sæt af stærkt organiserede veje, som har udviklet til at klare forskellige former for DNA-skader [7] – [9]. Reparation af base /sukker ændringer – bortset strengbrud – er baseret på excision /syntese mekanismer. Base excision reparation (BER) kan håndtere små beskadigede baser og abasiske steder [10], mens nukleotid excision reparation (NER) håndterer helix-forvridende læsioner [11]. For nylig har nukleotid indsnit reparation (NIR) blevet beskrevet som et alternativ til både BER og NER [12]. Nogle proteiner besidder overlappende funktioner inden for og mellem BER og NER veje [13] og proteiner tilskrives én vej kan interagere med proteiner af andre veje [14] – [16]. Endelig interstreng tværbindinger (ICLs) repareres via flere mekanismer, enten rekombination-afhængige eller rekombination-uafhængig, med eventuelt samarbejde af proteiner fra NER og mismatch reparation (MFR) veje [17], [18].

Proteiner tilhører disse DNA-reparationsveje og til DNA-skader signalering /transducere klasser er blevet identificeret som potentielle terapeutiske mål [19], [20]. Tumor-specifikke defekter i DDR faktorer, såsom BRCA1 /BRCA2, p53, ATM, nu udnyttes til at udvikle nye specifikke terapier [19]. I betragtning af den rolle, DDR og de forskellige DNA reparation veje i modstand, en bedre forståelse af de mekanismer, der udløses af direkte eller indirekte DNA-targeting kemoterapeutiske stoffer er vigtig, da det vil hjælpe til at forudsige effekten af ​​narkotika samt kemosensitivitet af individuel patienter.

cellelinier afledt fra humane tumorer repræsenterer eksperimentelle modeller af cancere, der tillader determinanter for kemosensitivitet skal undersøges [21], [22]. For nylig, genekspression profilering og andre array-tilgange identificeret specifikke mønstre forbundet med kemoterapeutiske følsomhed [23], [24]. Disse globale strategier afslørede også nogle aspekter af mekanismerne i narkotika handling [25]. Sub-klassificere kræft efter disse nye data storstilet er nu en stærkt nye begreb, der rejser håb om at finde mere hensigtsmæssige lægemidler til skræddersyede behandlinger [26].

En stor begrænsning, der har hindret forståelse af den rolle DNA reparationsmekanismer er kompleksiteten af ​​de DNA-reparationsveje. Hidtil har forsøg på at bestemme rollen af ​​DNA-reparation undersøgt en reparation protein ad gangen [27], [28], der er tilbage af begrænset effekt. Det er nu tydeligt, som anført af Sander og Van Houten [29], skal denne DNA-reparation indgå i netværket biologi og protein interactome alder. Faktisk er reparationen respons reguleres gennem adaptive og koordinerede mekanismer, herunder protein post-translationelle modifikationer og omplantning [30], [31]. Derfor er en omfattende funktionel tilgang synes mere passende end transkriptom eller genomiske metoder til analyse af effektive DNA-reparation effektivitet som reaktion på kemoterapeutiske stoffer.

I den foreliggende undersøgelse, brugte vi en specifik multiplex enzymatisk DNA-reparation assay på biochip til samtidig at undersøge flere reparationsveje. Relevansen og fordele af dette begreb er blevet påvist i aldrende undersøgelser og i en undersøgelse af konsekvenserne af sol fotoeksponering med humane hud celleprøver [32] – [34]. Vi vurderede DNA reparation underskrifter fra et panel af 7 kræft cellelinjer afledt fra 4 tumortyper, behandlet med 5 cytotoksiske lægemidler mod cancer. Især excision /syntese reparation aktiviteter tilhører BER, NER, NIR, og dels ICLs reparation blev kvantificeret. En stram strategi tillod os at præsentere en ny effektiv måde at klassificere de model kræft celle reaktioner på de kemoterapeutiske lægemidler. Det gav nye indikationer om virkningsmekanismen af ​​cytotoksiske lægemidler, på evnen af ​​cellelinjer til at reagere og om eventuel inddragelse af specifikke reparation aktiviteter i kemoresistens. Vores oprindelige tilgang er en interessant funktionel supplement til molekylær farmakologi strategier til at forstå DDR og kan vise sig meget effektiv som en del af at vælge den rigtige behandling til optimeret pleje af kræftpatienter.

Materialer og metoder

cellekultur

Seven cancercellelinier repræsentative for forskellige cancer steder blev udvalgt og leveret af Oncodesign (Frankrig). HCC-1937 og MCF-7 (brystcancercellelinie), OVCAR-8 /ADR (ovariecancer cellelinje, der oprindeligt fejlagtigt som MCF-7 /ADR [35] (Oncodesign)), HCT-15 og HCT-116 (colon cancercellelinier), RPMI 8226 (myelom), T24 (blærecancer-cellelinie). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI-1640 indeholdende 2 mM L-glutamin og suppleret med 10% føtalt kalveserum (Lonza) ved 37 ° C i en CO

2 inkubator (5%). Celledyrkning, blev celle behandlinger og toksicitetsundersøgelser udført af Oncodesign.

kemosensitivitet assay

Følsomhed af cellelinier til 5 anticancer narkotika (cisplatin (CDDP (Sigma), oxaliplatin (OHP (Eloxatine®, Debiopharm)), adriamycin (ADR (doxorubicin, Sanofi Aventis)), 5-fluor-uracil (5-FU (Sigma)), og carmustin (BCNU (Sigma)) blev vurderet ved MTS (3- (4,5-dimethylthiazol -2-yl) -5- (3-carboxymethoxy phenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium), Promega) assay. absorbansen blev målt ved 490 nm ved anvendelse af en Victor 3 ™ 1420 multi-mærket tæller ( Wallac, PerkinElmer) (Se Metoder S1).

Virkningsmekanismen af ​​narkotika er angivet som underbyggende oplysninger, blev tabel S1. Det stof koncentration fører til 20% mortalitet beregnet (IC20) og er forsynet med.

Behandlinger og udarbejdelse af celle kerneekstrakter

hver cellelinje, belagte i en 75 cm

2 kolbe (Nunc), blev behandlet på IC20 med hver af de 5 teststoffer. En kontrolgruppe flask for hver cellelinie blev også fremstillet parallelt. Efter 48 h behandlinger blev celler trypsineret, talt og pelleteret ved centrifugering ved 550 g i 10 min. Pellets blev suspenderet i RPMI-1640 medium suppleret med 10% FCS og 10% DMSO og nedfrosset ved -80 ° C indtil fremstilling af celleekstrakterne. Ca. 3 10

6 celler var tilgængelige pr pille.

Cell kerneekstrakter blev fremstillet som allerede beskrevet [32], [36]. Typisk proteinindhold var 1 mg /ml.

Modificeret plasmid microarray

Den modificerede plasmid microarray er blevet beskrevet andetsteds [33], [36] og præsenteres som underbyggende oplysninger (Metoder S1).

DNA excision /syntesereaktion

excision /syntesereaktion blev udført på de modificerede plasmid arrays som beskrevet i [33] ved en endelig proteinkoncentration på 0,2 mg /ml for alle prøver (Se Metoder S1 til forsøgsbetingelser). Hver slide omfattede 12 identiske modificerede plasmid arrays: 9 arrays blev brugt til reparation reaktioner udført med kræft cellelinje ekstrakter og 3 til kontrol reaktioner udført med standard kommerciel HeLa ekstrakter (HeLa_Com, CilBiotech). Hver kræft cellelinje ekstrakt blev testet i to eksemplarer (tekniske gentagelser).

To uafhængige sæt reparation reaktioner (kaldet Set_1 og Set_2) blev udført på cellepellets opnået selvstændigt og forberedt flere måneders mellemrum. Således blev udført analyse på data fra to uafhængige undersøgelser (to eksperimentelle gentagelser).

Microarray scanning, fluorescens kvantificering, data behandling og normalisering

Billeder blev erhvervet ved 635 nm ved 10 um opløsning med en GenePix 4200A scanner (Axon instrument). Total spot fluorescensintensitet (FI) blev bestemt under anvendelse af GenePix Pro 5.1 software (Axon Instrument). Inden for hvert sæt af reaktioner blev dobbelte data indsamlet fra kræftcellen linje eksperimenter normaliseret ved hjælp NormalizeIt software [36]. Så for hver prøve, vi bestemt en intensitet værdi for de 6 modificerede plasmider svarende til summen af ​​intensiteterne af A-, B- og C fortyndinger, hvorfra værdien for CTRL blev fratrukket. Denne værdi svarer til intensiteten af ​​den umodificerede-kontrolplasmidet ganget med 3, for sammenhæng med hensyn til summen af ​​3 plasmid fortyndings- intensiteter. Derfor blev hver prøve karakteriseret ved 6 værdier, svarende til reparation af de 6 DNA-læsioner er repræsenteret i biochip.

Da de to separate forsøg (Set_1 og Set_2) blev udført på forskellige plasmid microarray batches på forskellige dage måtte vi korrigere for inter sæt og inter dag fluorescens variationer tilskrives dels ændringer i ozon-niveau [37]. Den bruges til data behandling og normalisering strategi er tilvejebragt som underbyggende oplysninger (Experimental Work Flow Fig. S1).

Data udtryk

Effekt af behandling på de forskellige enzymatiske DNA reparation aktiviteter blev undersøgt gennem beregning af forholdet mellem FI opnået for hver læsion og hver behandling tilstand, mellem behandlede (T) og ikke-behandlede (NT) prøver. Nøgletal blev omdannet til log2, så stimuleret og hæmmede reparation i forhold til ikke-behandlede celler var centreret på nul og udstillet værdier med modsat fortegn. Disse værdier er rapporteret som log2 (T /NT). Bemærk, at i Set_2, 4 behandlede cellelinier (RPMI8226_5-FU, HCT-116_ADR, HCT-116_BCNU og MCF7_OHP) præsenterede reparation intensiteter ikke signifikant over baggrunden. De tilsvarende log2 forhold blev sat til minimum af hele datasættet (minus 1)

Dataanalyse -. Clustering metoder – Resultater display

Unsupervised hierarkisk klyngedannelse blev brugt til at udforske strukturen i datasæt, for at beskrive og visualisere forholdet mellem de forskellige behandlinger og de forskellige cellelinier. Analysen blev udført ved hjælp af den gratis software miljø for statistisk databehandling og grafik, R (https://r-project.org/). Den hierarkiske gennemsnitlige kobling clustering algoritme blev kørt med to forskellige forskellighed foranstaltninger (1) den euklidiske afstand, der aggregerer profiler med både tilsvarende niveauer intensitet og samvariation, (2) korrelationen forskellighed foranstaltning (1 – r), hvor r angiver Pearson korrelation koefficient, der aggregerer profiler med lignende samvariation uafhængigt af deres intensitet niveauer. Således to komplementære klassifikationer blev opnået at udforske data forskelligt, den ene overvejer både samregulering af reparations- veje og intensitet, og den anden overvejer kun samregulering af reparation veje uanset intensitetsniveau (Se metoderne S1).

Undersøgelse af forholdet mellem DNA Repair Response (DNA-Rep-Res) og kemosensitivitet

for at udforske sammenhængen mellem IC20 opnået for hvert lægemiddel, og DNA-Rep-Res, vi udførte ukontrollerede hierarkisk klyngedannelse hjælp den euklidiske forskellighed foranstaltning og gennemsnitlig kobling byområde metode. IC20 blev valgt som, på denne milde toksicitetsniveau cellerne forventes at kunne fremkalde en specifik DDR, leverer lægemiddel-specifikke signaturer eksponering. Den gennemsnitlige log2 (T /NT) FI af de 2 sæt forsøg for hver læsion-behandling Foreningen blev plottet mod log10 (IC20) af den tilsvarende behandling. Værdier langs hver akse blev standardiseret inden for hver cellelinie serie (middelværdi = 0 og standardafvigelse = 1). Det optimale antal klynger blev bestemt ved at skære klynge dendrogrammer ved agglomererings- kriterier fleksion punkt (fig. S2). Skillevæggene af behandling-læsioner opnået for hver cellelinje som en funktion af IC20 let kunne visualiseres på todimensionale farvede diagrammer.

Statistiske tests for at vurdere graden af ​​lighed

Vi brugte ” pvclust “R pakke til vurdere usikkerheden i hierarkisk klyngeanalyse (https://www.is.titech.ac.jp/~shimo/prog/pvclust/). Klynger med AU

P

værdi 95% blev anset for signifikant (Se Metoder S1 for detaljer)

Resultater

følsomhed cellelinjer til anticancerlægemidler: klassifikation i henhold til IC20. (fig. 1)

Vi ønskede at inducere DNA-beskadigelse uden at inducere overdreven apoptose eller nekrose i de 7 celle testede, så apoptotiske og nekrotiske celler indeholder høje niveauer af nukleaser linjer. Disse nukleaser ville forstyrre vores nedstrøms analyse. IC50 er almindeligt anvendt i farmaceutiske undersøgelser for at afprøve forbindelser og deres toksicitet over for celler, men vi foretrukket at anvende en mildere grad af toksicitet, IC20, således at udløse en reaktion fra cellerne uden at inducere overdreven celledød. De 7 cellelinjer og de 5 behandlinger blev grupperet i henhold til log10 (IC20) ved hjælp af euklidiske forskellighed foranstaltning. I den første dimension blev cellelinjerne grupperes i lighed deres log10 (IC20) profil på tværs af de 5 behandlinger. I den anden dimension blev de behandlinger grupperes i lighed deres log10 (IC20) profil på tværs af de 7 cellelinier. I farvekodede gitter, har cellelinjer og behandlinger er opført i de to dimensioner, og hver grid blok viser log10 (IC20) værdi for hver cellelinie og behandling. Lysstyrke farve er korreleret med log10 (IC20), med rødt for højere IC20 og grøn for lavere IC20 (fig. 1A). Cellelinier blev adskilt i to grupper repræsenteret af de to store dendrogram grene: på den ene side MCF7 og OVCAR-8 /ADR med en meget lav IC20 for 5-FU og meget høj for de andre behandlinger (med undtagelse BCNU for OVCAR-8 /ADR og ADR for MCF7). På den anden side blev de andre cellelinjer grupperet sammen, med en højere IC20 for BCNU end for de andre behandlinger, som alle havde en mellemliggende IC20. Inde i denne klynge, HCT-116 var betydeligt tættere på HCT-15, der viser en lignende følsomhed af de to tyktarmskræft cellelinier for de forskellige behandlinger (fig. 1B). Behandlingerne kan inddeles i 3 forskellige grupper: på den ene side blev CDDP, ADR og OHP grupperet sammen, med IC20 for MCF7 og OVCAR-8 /ADR højere end for de andre cellelinjer. 5-FU var imod denne gruppe, med IC20 for MCF7 og OVCAR-8 /ADR meget lavere end for de andre cellelinjer. Endelig BCNU blev klassificeret separat, med en meget højere IC20 for hver cellelinje undtagen OVCAR-8 /ADR (fig. 1C).

Baseret på log10 (IC20), den klyngedannelse anvendte euklidisk forskellighed foranstaltning. A. Heat map repræsentation af klynger. Lysstyrke på farven er korreleret med log10 (IC20), med rød farve for højere IC20 og grøn for lavere IC20. B. Cellelinier dendrogram med klynger signifikans værdier. C. Behandlinger dendrogram med klynger betydning værdier.

P

-værdier (AU (Ca. Uvildige) i rød og BP

P

værdier (Bootstrap sandsynlighed) i grøn rapporteres på dendrogrammer.

DNA Repair reaktion profilering: (. figur 2) klassificering af cellelinier efter effekten af ​​behandlingen på DNA-reparation aktiviteter

Vi brugte komplette datasæt (log2 (T /NT) værdier fra Set_1 og Set_2) til klynge DNA-Rep-Res (repræsenteret ved reparation af de 6 læsioner) og få et overblik over ligheder på tværs af cellelinjer og behandlinger. vigtigt er det, det også muligt for os at vurdere sammenhængen mellem de to uafhængige sæt af eksperimenter.

Clustering med korrelation forskellighed foranstaltning blev anvendt til gruppe de 7 cellelinjer fra de to eksperimenter og de 5 behandlinger ved læsion type (svarende til at reparere vejen), i de to dimensioner. i den første dimension, blev cellelinjer grupperet af lighed af deres DNA-Rep-Res samvariation tværs af de 5 behandlinger med de 6 læsionstyper. i den anden dimension blev behandlinger associeret med de 6 læsionstyper grupperes i lighed deres samvariation mønster på tværs af de 7 cellelinier fra de to eksperimenter (fig . 2A). Den Heatmap tilbudt en omfattende oversigt over klassificeringen, hvor forskellene mellem de behandlingsrelaterede inducerede fænotyper med hensyn til identiteten af ​​de cellelinjer let kunne visualiseres.

A. Den Heatmap blev konstrueret under anvendelse af de log2 transformeret forhold mellem fluorescensintensiteten opnået for reparation af hver læsion mellem behandlede og ikke-behandlede cellelinjer (log2 (T /NT)). Hierarkisk klyngedannelse algoritme med korrelation forskellighed foranstaltning blev anvendt til gruppe i et farvekodet gitter de syv cellelinjer fra de to eksperimenter og de fem behandlinger ved læsion typen reparation, i de to dimensioner. I den første dimension blev cellelinjer klynger af ligheden mellem deres DNA-reparation respons profil samvariation over virkningen af ​​de fem behandlinger ved læsion typen reparation. I den anden dimension blev behandlinger efter læsion typen reparation grupperes i lighed deres mønster samvariation over de syv cellelinier fra de to eksperimenter. For at vurdere sammenhængen mellem de to uafhængige forsøg, blev Set_1 og Set_2 data holdes adskilt og analyseret samtidigt (markeret _1 og _2 henholdsvis). I farvekodede gitter, værdier større end 0 er skraveret med rødt indikerer stimulering af reparation aktiviteter mens værdier under 0 er farvet grønt indikerer en hæmning af reparations- aktiviteter i forhold til NT celler. Værdier større end 0 blev nedtonet i rødt indikerer stimulering af reparation aktivitet, mens værdier under 0 blev nedtonet i grøn indikerer hæmning af reparation aktivitet. Værdier omkring 0 blev farvet i sort indikerer ingen detekteret virkning. Lysstyrke farve var korreleret med størrelsen af ​​effekten af ​​behandlinger på de DNA-reparation aktiviteter. B. dendrogram af de fem behandlinger ved læsion typen reparation med klynger betydning værdier. C. dendrogram af de syv cellelinier fra de to eksperimenter med klynger signifikans-værdier. P-værdier (AU (Ca. Uvildige)

P Drømmeholdet værdi i rød og BP (Bootstrap Sandsynlighed)

P Drømmeholdet værdi i grøn) rapporteres på dendrogrammer.

Dendrogrammet af behandlingerne efter læsionstyper (fig. 2B) viste, at læsionerne forblev grupperet ved behandling typen, hvilket viser, at hvert lægemiddel havde en særskilt indvirkning på alle reparationsveje samtidigt. Denne analyse yderligere afsløret tre klasser af lægemidler: en omfattende BCNU og ADR behandling (AU p-værdi 95%) og en anden omfatter OHP og CDDP behandling (AU p-værdi 93%). 5-FU var fra hinanden, selv om det havde tendens til at klynge med den anden gruppe. Som et generelt træk, når de 6 læsion typer blev grupperet på det sæt af cellelinier ved behandling, mellem de to sæt af eksperimenter det konsekvent viste sig, at 8oxoG (8oxoG), alkylerede baser (AlkB) og AP sites (Abas), alle repareres af BER, tendens til at blive grupperet sammen; mens Glycol og fotoprodukter (CPD-64) grupperet uafhængigt af hinanden. Cisplatin (CISP) dannede en gruppe alene (fig. S3). Da hver behandling blev betragtet hver for sig, blev denne tendens opretholdes for BCNU og ADR-behandling, dog med visse forskelle (Fig. 2B). Tværtimod bemærkelsesværdige forskelle optrådte efter behandling med 5-FU. Interessant nok i tilfælde af CDDP og OHP behandling, CISP reparationsvej var signifikant forskellige.

I cellelinjerne dendrogram blev cellelinierne organiseret i 3 betydende hovedgrupper (fig. 2C). En separat gren indeholdt RPMI8226, en myelom-afledt hæmatopoietisk cellelinie, der, i modsætning til alle de andre cellelinjer, der ikke stammer fra et karcinom. De to brystcarcinoma cellelinier, MCF7 og HCC1937, tilhørte samme klynge, sammen med HCT-15. I denne undergruppe er de gentagelser for hver cellelinje blev blandet op. De replikater af den anden coloncancercellelinie HCT-116 udgjorde en undergruppe af en klynge indeholdende OVCAR-8 /ADR og blærecarcinom cellelinjen T24.

vigtigt, observerede vi, at de to uafhængige gentagelser for hver celle line meste tæt forbundet, hvilket afspejler repeterbarhed af forsøget og dermed pålideligheden af ​​tilgangen. Korrelationen forskellighed foranstaltning beror kun på samregulering og er uafhængig af enhver batch effekt mellem eksperimenter. Denne foranstaltning var mere robust end den euklidiske afstand, når demonstrerer den tætte lighed mellem gentagelser

Konsekvenserne af narkotika behandlinger på DNA Reparation veje:. Stimulering eller hæmning

For at skelne klasser af reaktioner på behandlinger med hensyn til de forskellige DNA reparation sub-veje, de midler og standardafvigelser af data (log2 (T /NT) for hver reparation pathway) inden for de 3 vigtigste cellelinie klynger identificeret var repræsenteret på det samme skema. Dette gav let visualisering af 3 profiler (fig. 3). For at karakterisere hver klynge, signifikant stimulering eller hæmning af de forskellige reparation sub-veje blev efterfølgende undersøgt. Til dette formål har vi anvendt statistiske hypotesetests til hver af de 2 klynger indeholdende 3 cellelinier. Da fordelingen af ​​data kunne være ikke-gaussisk blev den ikke-parametriske Wilcoxon test anvendt. For hver klynge og behandling af læsion type, Wilcoxon testen afgøres, om medianen af ​​log2 forholdet fordeling var signifikant forskellig fra 0, fremhæver stimulerende (hvis median 0) eller hæmme (hvis median 0) effekter. For aktiviteter, der kun indeholder én cellelinje (RPMI8226) blev stimulering eller inhibering betragtet som signifikant, når | betyde | 3 × standardfejl. Resultaterne er vist i tabel 1.

middelværdier og standardafvigelser af de tre identificerede klasser af cellelinje responser tværs af de fem behandlinger og de seks læsioner typer blev beregnet under anvendelse af log2 (T /NT) data (sort linie: HCC1937, HCT-15, MCF7, rød linje: HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24, grøn linie:. RPMI8226)

Afhængigt af arten af ​​lægemidlet, den antallet af berørte reparationsveje varieres. Blandt funktioner, der opstod, vi observeret, at 5-FU drastisk betydeligt hæmmet CPD-64, AlkB og Abas reparation i RPMI8226 cellelinje. CDDP, OHP og ADR alle syntes at inhibere CISP reparationsvej af RPMI8226 cellelinje sammenlignet med de andre reparere veje undersøgt. Ved opposition, med OHP behandling, andre reparation veje for RPMI8226 (Glycol, 8oxoG og AlkB) var signifikant opreguleret. BCNU udøvede en hæmmende effekt på alle reparationer aktiviteter i [HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24] klynge med

P

værdi 0,1. Interessant, ADR hæmmede reparation af 8oxoG kun inden for denne klynge (

P

værdi 0,1). De to platin-baserede anticancer narkotika, CDDP og OHP, påvirkede ikke reparation aktiviteter i [HCT-116, OVCAR-8 /ADR, T24] klynge bortset fra at stimulere reparation af AlkB og Abas for CDDP (

P

værdi 0,1). Nogle reparation aktiviteter i [HCC1937, HCT-15, MCF7] klynge var lidt opreguleret med 5-FU behandling (signifikant for 8oxoG, Abas, CISP med

P

værdi 0,1) og klart nedreguleret af platin-baserede lægemidler (se tabel 1 for signifikans). Omvendt har ADR og BCNU behandlinger ikke har nogen indflydelse på DNA reparation veje denne klynge

Virkningen af ​​lægemiddelbehandling:. Analyse af cellelinie respons behandling ved behandling

Når vi fokuseret uafhængigt på hver behandling blev yderligere ejendommeligheder fremhævet. Dette berørte især de to tyktarmskræft cellelinjer HCT-15 og HCT-116 behandlet med 5-FU. Begge cellelinjer de viste stimuleret DNA reparation aktiviteter, uanset vejen betragtes (One-sidet Wilcoxon test

P Drømmeholdet værdi = 0,065) (fig S4A.). En ny cellelinje klynge delte ligheder, når de behandles af BCNU: HCC1937, RPMI8226, og HCT-15 for hvilken reparation af 8oxoG og CPD-64 blev stimuleret (One-sidet Wilcoxon test

P Drømmeholdet værdi = 0,05) ( fig. s4b).

Undersøgelse af forholdet mellem DNA Repair reaktion og kemosensitivitet

de grafiske fremstillinger af log2 (T /NT) data som en funktion af log10 (IC20) tilladt meningsfuld visualisering af de klynger, der repræsenterede co-regulerede sub-veje for hvert lægemiddel-induceret DNA-Rep-Res (fig. 4 A-G). For praktisk visualisering af data i hvert diagram, blev DNA-reparationsmekanismer sub-pathways, der tilhører den samme klynge indrammet sammen. Afhængigt af cellelinjen behandlede, antallet af klynger varierede fra 6 til 13 klasser. Inden for hver graf, kunne reparation sub-pathways, vedrørende en behandling enten grupperes (f.eks HCT-116, fig. 4C og MCF7, fig. 4E) eller spredte (f.eks HCC1937, fig. 4B, HCT-15, fig. 4D) . Vi kan antage, at denne sidstnævnte funktion afslørede distinkte regler i de forskellige reparation sub-veje, til gengæld er ansvarlig for stigningen i klyngen nummer.

Vi rapporteret, for hver cellelinje, midlerne til log2 (T /NT ) data (Y-akse) ufarligt for hver behandling af de 2 sæt eksperimenter som en funktion af det tilsvarende log10 (IC20) (X-akse). Data blev standardiseret inden for hver cellelinie serie (middelværdi = 0 og standardafvigelse = 1). Inden hvert diagram blev læsion behandlingen foreninger tilhører samme klynge indrammet sammen. De tilsvarende klynge dendrogrammer vises i supplerende Fig. S2 (de kommende af læsionerne bogstaver refererer til behandling: A = adriamycin; B = BCNU; C = cisplatin; F = 5-FU, O = oxaliplatin).

I betragtning af dimensionen af data, i dette papir, vi kunne kun fokusere på åbenlyse foreninger, såsom lav reparation /lav IC20 og høj reparation /høj IC20, modtagelige at afspejle en kausalitet mellem reparation effektivitet og kemosensitivitet. Dette udelukker ikke, at andre foreninger kunne være biologisk relevant.

For eksempel HCC1937 diagrammet viste en lavere reparation af abasiske steder som reaktion på ADR behandling (ADR-Abas) forbundet med en lavere IC20 i forhold til andre behandlinger (fig. 4B). Omvendt blev et BCNU-drevet højere reparation af alle læsioner niveau er forbundet med forhøjet IC20 (fig. 4B). HCT-116 udviste en sammenhæng mellem hele ADR-drevet reparation respons og IC20, begge er lav (fig. 4C). En anden funktion værd at nævne pågældende HCT-15, hvor lav reparation af CISP efter OHP behandling var forbundet med lav IC20 (fig. 4D). I tilfælde af RPMI8226, var den høje BCNU-drevet reaktion forbundet med en høj IC20 (fig. 4G).

Af opposition, inverterede blev ligeledes bemærket såsom for T24 hvor ADR behandling var den mest cytotoksiske ( lav IC20) og alligevel er forbundet med den højeste DNA-Rep-Res (fig. 4A). Vigtigt er det, gjorde, at ADR-DNA-Rep-Res og lav ADR-IC20 omvendt var forbundet ikke, at de var formelt anti-korreleret og ingen hypotese kunne formuleres i øjeblikket om den biologiske betydning af en sådan potentiel anti-korrelation. Den samme observation blev fundet i tilfældet med MCF7 behandlet med 5-FU (fig. 4E). Endelig er de to tyktarmskræft cellelinjer HCT-116 og HCT-15 udviste en lignende reaktion på 5-FU, med ret svag toksicitet, men kunne blive diskrimineret af mindst ADR og OHP-behandlinger (fig. 4C og 4D henholdsvis).

diskussion

i denne undersøgelse tog vi fordel af en multiplex funktionel tilgang, der kvantificerer DNA reparation aktiviteter at udforske DDR og forholdet mellem narkotika-induceret cytotoksicitet og DNA reparation sub-veje. Vi brugte statistiske tilgange og privilegerede visuelle fremstillinger, der klart viste vores resultater.